关节损伤再灌注

战（创）伤致骨关节缺血再灌注损伤的机制与防治应用,中国人民解放军第 89 医院全军创伤骨科研究所王成琪王剑利孙新君郑宪友赵 成张伟旭刘光军,战创伤致骨关节缺血再灌注损伤比较常见，四肢血管损伤、断肢再植、止血带超时应用以及肢体过长时间的挤压等均可造成缺血再灌注损伤。,骨关节、滑膜、软骨等缺血再灌注损伤的机制与防治，是研究的重点。为此设多个专题进行研究：一、骨关节、滑膜缺血再灌注损伤二、软骨缺血再灌注损伤三、骨关节其它软组织缺血再灌注损伤四、防治方法的研究,一、关节滑膜缺血再灌注损伤,模 型 的 建 立 在股动脉处切开皮肤，游离股动静脉、股神经；于股骨中段逐层结扎并切断除股骨、股动静脉、神经以外的皮肤及各层肌肉；环形游离长约 0.5cm的骨膜并用牙科磨钻开窗，用明胶海绵填塞阻断髓腔血流，然后用血管夹夹闭股动静脉造成远端肢体缺血。8 小时后，放松血管夹恢复肢体血运。,a图: 连续夹闭4小时，动静脉未见明显异常。,a,b,c,b图:连续夹闭6小时，动脉内见血栓形成， 血管内皮细胞（EC）有脱落。,c图:连续夹闭6小时，血管变形，动脉内见血栓形成。,a,b,c,滑膜缺血与损伤的时效关系,指标检测 分别于阻断血流后0h、4h、6h、8h、10h 活杀动物，立即取材。,光 镜 观 察,关节滑膜 HE染色 400 单纯I/RI 1天,可见滑膜细胞间质水肿，其间散在数量不等的多形核粒细胞，伴有毛细血管充血，且管壁不完整，内有含铁血黄素。,关节滑膜 HE染色 400 关节单纯I/RI 2周，滑膜间质水肿加重，见表层滑膜细胞有坏死脱落， 间质内多形核白细胞（PMN）明显浸润。,关节滑膜 HE染色 100 关节单纯I/RI 4周，可见滑膜细胞及滑膜下层血管减少，滑膜间质疏松，伴有巨噬细胞浸润。,关节滑膜 HE染色 100 单纯I/RI 12周，滑膜组织乳头状增生，呈细小绒毛状向腔内突出 ，表面被覆滑膜细胞，间质内伴有大量巨噬细胞浸润。,电镜观察 缺血6小时 ，血管内皮细胞、滑膜细胞出现线粒体肿胀，嵴突变短；缺血8小时 ，还可观察到胞核染色质凝块的出现；缺血10小时，滑膜细胞染色质边集、粗面内质网脱颗粒和胞浆分泌颗粒减少，以致核碎裂等细胞坏死的表现; 小血管内皮细胞胞膜出现髓鞘样变 ， 胞浆突起、空泡形成， 细胞紧密连接变松弛，胞膜破坏、崩解。,关节滑膜 透射电镜 3000 单纯I/RI 2周内,可见滑膜细胞肿胀，细胞核染色质边集，核周隙明显增宽，细胞核周围出现空泡；胞浆内线粒体可出现髓样变、空泡样变。,关节滑膜 透射电镜 2000 单纯I/RI 2周 ， 可见血管内皮细胞肿胀明显，胞核变小， 胞浆出现空泡样变 ，线粒体等细胞器明显减少。,关节滑膜 透射电镜 1400 单纯I/RI 12周，滑膜细胞仍有肿胀，细胞核不规则 ，核仁明显，核周隙明显增宽，胞浆内质网扩大。,关节滑膜缺血再灌注损伤机制,1 组织IR过程中由于激活了次黄嘌呤- 黄嘌呤氧化酶系统，产生大量的活性氧自由基（ROS）； 血管内皮细胞（EC）由于缺血缺氧及活性氧自由基（ROS） 作用，可能促使多形核白细胞（PMN） 粘附并侵入到组织间隙；多形核白细胞（PMN） 在此过程中因呼吸爆发产生更多的活性氧自由基，当这些活性氧自由基的量超过组织的清除能力时，则导致组织细胞损伤，器官功能形态遭到破坏。,2 我们动态观察了脂质过氧化产物丙二醛（MDA）、多形核白细胞（PMN）及超氧化物歧化酶（SOD） 在滑膜IR损伤和修复中的变化，以及它们与滑膜组织结构和关节活动改变的关系。,实 验 方 法,动物分组 实验动物 55只，根据缺血后再灌注的时间不同， 随机分成11组 ，每组5只；再灌注时间分别为 1h、 3h、 6h、 12h、24h、72h和 1w、2w、 4w、8w、12w，一侧后肢为实验侧，另一侧后肢为自身对照侧(不施行手术)。,滑膜组织丙二醛含量和多形核白细胞记数 缺血组 4、 6、 8、10小时滑膜组织中丙二醛（MDA）的变化与正常组无显著性差异（P0.05）。,0,50,100,150,200,250,1h,3h,6h,12h,24h,72h,IR后时间,MDA含量(nmol/g),MDA实验侧,MDA 对照侧,*,*,*,*,*,再灌注组2周内，实验侧丙二醛（MDA）含量呈双峰变化， IR 1小时达第一个峰值，随后逐渐降低，IR 6小时再次升高，72小时达第二个峰值，然后又逐渐降低。,0,50,100,150,200,250,1w,2w,4w,8w,12w,IR后时间,MDA含量(noml/g),实验侧,对照侧,*,*,*,IR实验侧滑膜组织丙二醛（MDA）在IR 2周时仍显著高于自身对照侧（P0.05）；IR 2-8周丙二醛持续在低水平，12周又有所回升。,0,5,10,15,20,25,30,1h,3h,6h,12h,24h,72h,术后时间,PMN(个/高倍视野),PMN实验侧,PMN对照侧,*,*,*,滑膜组织中多形核白细胞 （PMN）浸润自IR后6小时开始升高，72小时达峰值，随后逐渐降低。,0,5,10,15,20,25,30,1w,2w,4w,8w,12w,术后时间,PMN(个/高倍视野),实验侧,对照侧,*,*,*,早期以中性粒细胞为主，两周后为巨噬细胞所代替。IR 6小时-72小时滑膜组织丙二醛含量（MDA）与多形核白细胞 （PMN） 记数显著相关（r=0.66， P0.05）。,IR及修复过程中超氧化物歧化酶SOD的变化,滑膜组织中超氧化物歧化酶（SOD）自缺血6小时开始降低，再灌注12小时达最低点， 然后回升，再灌注8周，基本恢复正常。,关节活动度的变化,缺血再灌注最初2周，实验侧肢体活动明显减少；4周时活动较2周时有所增加，但仍以对照侧肢体为主；812周，双侧肢体均参与活动及持重，但可见到明显的跛行。术侧膝关节损伤后被动活动度逐渐降低 。,滑膜组织病理学变化,二、 肢体缺血再灌注后 关节软骨病理变化的研究,关节软骨病理变化 大体病理观察：IR侧早期关节软骨与对照侧相比无差别，4 周后软骨失去原有光泽，色泽暗淡，暗红或淡黄色。,光学显微镜观察 IR侧肢体1天和3天组，关节软骨表面平坦，柱状层细胞排列整齐，细胞核大多有偏移、缩小现象；1周、2周组软骨细胞排列紊乱，层次不清，胞核缩小甚至消失，软骨细胞碎裂、坏死，软骨陷窝内细胞数目较对照侧减少；4周、8周组关节软骨表面粗糙，表层细胞有脱落现象，柱状层细胞稀少、排列紊乱，12周组软骨表面甚至出现裂纹。,肢体IR后关节软骨组织学变化 HE染色 200 A图：正常对照侧，表面光滑，软骨细胞排列 整齐，核大小均匀，潮线清晰可见。,肢体IR后关节软骨组织学变化 HE染色200 B图：IR后3天, 表面平坦，柱状层细胞排列整齐，核偏移。,肢体IR后关节软骨组织学变化 HE染色200C图：IR后2周, 关节面粗糙，细胞数目减少，排列紊乱，胞核缩小、偏移 。,肢体IR后关节软骨组织学变化 HE染色200 D图：IR后3个月, 细胞数目减少，排列紊乱，软骨增厚，潮线增多、前移、模糊 。,透 射 电 镜 IR 侧1天组，线粒体轻度肿胀，嵴消失，内织网扩张 ，胞浆内出现大量的脂滴； 3天组 ，细胞高度肿胀，染色质边集 ，部分细胞出现溶解坏死，胞膜溶解，胞核碎裂。,1周、2周组坏死细胞数量增加，胞核固缩、碎裂；4周、8周组仍可见到高度肿胀和溶解坏死的细胞 ，胞内残存有细胞器，12周组，可见较多的成软骨细胞，呈梭形，胞浆内大量粗面内织网和线粒体，新生软骨细胞数目增多，有分裂现象。,肢体IR后关节软骨细胞超微结构观察 （14K） A图：对照侧关节软骨细胞，胞膜完整，核形态基本正常，未见细胞器肿胀。,肢体IR后关节软骨细胞超微结构观察 （7K）B、C图：IR后1天，变性软骨细胞，线粒体肿胀，内织网扩张，胞核变形、偏移，胞浆内出现大量脂滴 。,肢体IR后关节软骨细胞超微结构观察 （7K） D图：IR后1天，肿胀、坏死软骨细胞，胞膜表面微绒毛消失，细胞器及胞核溶解 。,肢体IR后关节软骨细胞超微结构观察E图：IR后3天，软骨细胞高度肿胀，胞核固缩，细胞器溶解，胞膜基本完整 。 （ 7.0 K）F图：IR后1周，大量软骨细胞溶解。（ 2.9K）,肢体IR后关节软骨细胞超微结构观察 G图：IR后2周，可见溶解坏死软骨细胞，胞膜破裂，细胞器溶解，胞核碎裂。（7.0K）H图：IR后1月，仍见坏死的软骨细胞（ 1.85K）,肢体IR后关节软骨细胞超微结构观察 I图： IR后1月，出现梭形成软骨细胞。（7.0K）J图：IR后2月，成软骨细胞数目增多，可见分裂的软骨细胞。 （2.1K）,肢体IR后关节软骨细胞超微结构观察 K图：IR后3月，见分裂的软骨细胞。（10.0K）L图：IR后3月，新生软骨细胞数目增多。（2.1K）,扫 描 电 镜 IR侧1周2周内软骨表面出现小的凹陷，“垄沟”尚在， 但变浅，表面可见散在的炎性细胞；4周、8周组，“垄沟”排列基本消失，软骨表面凹凸不平；12周组软骨表面出现细小浅表的裂缝，胶原暴露，基质丢失。,肢体IR后关节软骨表面扫描电镜观察 A图：IR后1天，表面有均匀分布的“垄沟”，呈平行排列，相邻距离相等，垄表面光滑，高度和深度基本一致。（1000）,肢体IR后关节软骨表面扫描电镜观察 B图：IR后1周，“垄沟”尚在，深浅不均，连续性 差。（1000）,肢体IR后关节软骨表面扫描电镜观察 C图：IR后1月，“垄沟”排列消失，软骨表面凹凸不平。（500）,肢体IR后关节软骨表面扫描电镜观察 D图：IR后3月，软骨表面出现的裂隙，胶原纤维暴露，表面不平坦。（1000）,关节软骨内MMP3的表达与分布 肢体IR后1天组，关节软骨内阳性颗粒较少 ， 主要分布在胞浆内；3天组明显增多，阳性颗粒在胞浆和基质中均有分布； 至1周和2周组渐升高达峰值 ， 之后表达逐渐回落，但8周-12周组仍高于对照侧。,组化SP法检测IR后关节软骨内MMP3的表达A图：对照侧关节软骨胞外基质很少着色，阳性细胞少，染色淡。 （DAB染色 200）,组化SP法检测IR后关节软骨内MMP3的表达B图：IR后1天，关节软骨内出现较少阳性细胞， 阳性染色主要在细胞内。 （DAB染色400）,组化SP法检测IR后关节软骨内MMP3的表达 C图：IR后3天，阳性细胞增多，主要集中在表层，胞外基质有着色。（DAB染色400）,组化SP法检测IR后关节软骨内MMP3的表达 D图：IR后1周，大量染色阳性细胞，胞外基质同时着色。 （DAB染色400）,组化SP法检测IR后关节软骨内MMP3表达 E图：IR后2周，阳性细胞多，着色深。 （ DAB染色400）,组化SP法检测IR后关节软骨内MMP3表达 F图：IR后4周，在大量阳性细胞周围，可见基质的阳性染色。（DAB染色400）,组化SP法检测IR后关节软骨内MMP3表达G图：IR后8周，表层细胞有脱落，柱状层染色阳性细胞多。 （DAB染色400）,组化SP法检测IR后关节软骨内MMP3表达H图：IR后12周，表层细胞脱落严重，细胞数目减少，但仍见强染色细胞。 （DAB染色400）,关节内MMP3的合成较正常增多，并在关节内广泛分布，与关节软骨基质的降解有关。刺激 MMP3 表达的因素，考虑可能是肢体缺血再灌注后释放大量的自由基和炎症细胞因子，如：一氧化氮（NO）、白介素-1（IL-1）肿瘤坏死因子（TNF）等。有研究证明这些因子可刺激关节软骨细胞和滑膜细胞产生和分泌金属蛋白酶类。,后期出现新生软骨细胞，而慢性关节炎形成，炎性介质及细胞因子刺激新生软骨细胞合成 MMP3 ，MMP3mRNA又表现出增高趋势。而在2周-4周时MMP3并不随 mRNA而变化，可能是细胞裂解将胞内合成的MMP3释放的缘故。,关节软骨内蛋白多糖含量变化 IR侧1天、3天组与对照侧无明显差异；1周染色较对照侧淡；2周组蛋白多糖含量较1天组明显减少（P0.01）；直到12周组实验侧蛋白多糖含量较对照侧存在明显差异。,免疫组化SP法对关节软骨内蛋白多糖染色A图：对照侧软骨内着色深，基质与胞内均有着色。 （DAB染色100),免疫组化SP法对关节软骨内蛋白多糖染色 B图：IR后1周，软骨内蛋白多糖染色仍较深。 （DAB染色100),免疫组化SP法对关节软骨内蛋白多糖染色C图：IR后1月，染色明显变淡，胞内着色少。 （DAB染色100),免疫组化SP法对关节软骨内蛋白多糖染色 D图：IR后3月，染色淡，与对照侧有差异。 （DAB染色100),IR侧关节软骨内蛋白多糖含量减少可能的原因 IR后由于软骨细胞的损伤，细胞合成蛋白多糖及胶原的功能下降，而此时MMP3表达还没达到最高峰，因此推断软骨细胞损伤是IR早期软骨内蛋,白多糖含量减少的主要原因。2 周后MMP3在关节软骨内表达增多，基质中也有大量表达，明显多于对侧。金属蛋白酶合成与分泌，引起蛋白多糖的降解，最终导致蛋白多糖含量下降。,三、预 防 预防重于治疗，因而要先于治疗。 1、肢体不论何种原因造成的缺血，时限不应超过68小时，最长不超过1012小时。过长即可造成不可逆性损伤。因此，必须争分夺秒尽快采取措施恢复血供。,2、部队指战员操练、施工尽量不要一个姿势过长时间的操作，可以变换姿势或适当休息后，再行操练。避免肢体长时间寒冷，注意保温。 3、一旦发现肢体有血供不足或缺血的早期症状，如肢体行动乏力、酸痛或不稳等，应尽早采用活血化瘀、改善血液循环的药物治疗。,4、适当的补充微量元素，如锌、铁、硒等，是预防的重要方面。 5、维生素、钙的适当补充亦是预防和治疗所必须的措施。,四、消灵仙注射液与Vit.E注射 液对关节缺血再灌注损伤的防治研究,鉴于以上实验结果，研究I/R I 损伤的防治方法。我们采用中药消灵仙注射液与Vit.E注射液关节腔内注射，观察对 I/R I的发生、发展有否防治作用，并阐明其作用机制 ，为临床 I/R I的防治提供理论依据。,中药消灵仙的作用 中药消灵仙注射液的成分主要是活血化瘀、消炎祛湿类中药。其中红花的有效成分红花黄色素、当归的有效成分阿魏酸钠；三七、牛膝、紫苏的有效成分均有一定的抗凝、抑制血小板聚集、抗血栓形成，从而改善微循环的作用。此外，黄芪酮（黄芪的有效成分）及阿魏酸钠也有清除 OFR，增加超氧化物歧化酶活力的功效。,以红花为例，中药消灵仙注射液的活血化瘀机制可能为：,1. 抗凝血作用 红花黄色素可使血浆凝血酶时间、血浆凝血酶原时间和血浆复钙时间显著延长。对血小板活化因子（PAF） 介导的中性粒细胞的聚集、粘附均有抑制作用，并呈一定的剂量依赖关系。据此推测，红花黄色素对抗血小板活化因子的作用，可能是红花活血化瘀的重要机制之一。,以红花为例，中药消灵仙注射液的活血化瘀机制可能为：,2.抗血栓形成作用 可能与其促进血管内皮细胞释放组织型纤溶酶原激活剂（tPA） 有关。由于组织型纤溶酶原激活剂活性的增强抵消了部分纤溶酶原激活抑制剂的抑制作用，从而使其纤溶活性得以加强。,以红花为例，中药消灵仙注射液的活血化瘀机制可能为：,3.改善微循环 红花黄色素有改善外周微循环的作用，从而使血流加速，毛细血管开放数目增多，血细胞粘稠程度下降。,关节软骨 HE染色 400 单用药2周时，可见软骨表面欠光滑，细胞层次减少，钙化潮线前移，表面见少许细胞脱落。,关节软骨 HE染色 400 单用药4周时，可见关节软骨表面仍有凹陷，但细胞层次较前增多，提示少量软骨细胞增生修复。,关节软骨 HE染色 400 单用药12周时，软骨表面光滑，细胞层次排列清晰，提示软骨细胞几乎完全修复。,关节软骨 HE染色 400 联合用药2周时，可见关节软骨表面略有凹陷，细胞层次减少，但未见到细胞坏死脱落。,关节软骨 HE染色 400 联合用药4周时，关节软骨表面无凹陷，细胞层次增多，各层排列较规则。,关节软骨 HE染色 400 联合用药12周时，可见软骨表面光滑，细胞排列整齐，无异于正常软骨。,关节滑膜 HE染色 400 单用药1天，可见滑膜间质水肿，毛细血管扩张，但无充血或血栓形成，偶见少量的多形核粒细胞浸润,关节滑膜 HE染色，100 单用药2周，滑膜间质水肿减轻，未见表层滑膜细胞脱落，间质内有少量多形核粒细胞浸润。,关节滑膜 HE染色，100 单用药4周， 滑膜间质无水肿，表面被覆增生的复层滑膜细胞，其下密集增生的纤维组织内散布多数增生的滑膜腔隙，并可见巨噬细胞浸润。,关节滑膜 HE染色 400 单用药12周，滑膜细胞细胞排列较规则，复层被覆于滑膜下结缔组织表面，无巨噬细胞浸润，已近完全修复。,关节滑膜 HE染色 400 联合用药早期（1天-2周）可见滑膜间质水肿，偶见少量的多形核粒细胞浸润，无充血或血栓形成，表层无细胞脱落。,关节滑膜 HE染色 400 联合用药4周，可见滑膜胶原纤维增多，表面滑膜细胞增生，未见巨噬细胞浸润，已开始修复。,关节滑膜 HE染色 400 联合用药12周，可见滑膜细胞层次排列清晰，间质内无巨噬细胞浸润，已完全修复。,生化指标测定结果,中药组、VitE组及中药+VitE组均较单纯缺血再灌注组丙二醛（MDA）含量明显降低，差异有显著性（P0.05）；其余任两组间差异显著（P0.05）。,丙二醛（MDA）含量在1天组较高，之后逐渐下降，在12周又复回升，1天组与12周组间丙二醛含量差异显著（P0.01）。,中药组、VitE组及中药+VitE组的超氧化物歧化酶活力均较单纯组明显升高，统计学上有显著性差异（P0.05）；其余任两组间差异显著（P0.01）。,活力值（NU/mg）,各时间点超氧化物歧化酶（SOD）活力亦有显著性差异（P0.05），超氧化物歧化酶活力随时间延长而逐渐回升。12周组与其他组间超氧化物歧化酶活力差异显著（P0.05）。,活力值（NU/mg）,中药组、VitE组及中药+VitE组的NOS酶活力均较单纯组明显降低，统计学上有显著性差异（P0.05）；其余任两组间差异显著（P0.05）。,活力值（U/mg）,各时间点NOS酶活力亦有显著性差异（P0.05），其余组间差异有显著性（P0.05）。,活力值（U/mg）,VitE与消灵仙注射液对关节生化、形态、功能的影响,对生化指标的影响 关节缺血 8 小时后，在关节局部可产生大量的OFR ，超过了超氧化物歧化酶。在应用亲水性氧自由基清除剂VitE后，可使局部关节滑膜组织中的丙二醛含量降低，且超氧化物歧化酶活力升高，随时间的延长而疗效更加显著。,中药消灵仙中阿魏酸钠与黄芪酮等均是OFR清除剂，可使滑膜组织中丙二醛含量降低，超氧化物歧化酶活力升高。中药消灵仙中以红花黄色素为代表的活血化瘀类中药成份可有明显的抗凝血、抗血栓形成、疏通局部毛细血管的作用，可使关节I/RI后，内皮细胞自稳态失衡、白细胞粘附、聚集等介导的关节局部微循环障碍得到明显的改善。 若VitE与消灵仙注射液联合应用，则从清除过多 OFR、改善局部微循环两个环