细胞色素c的制备与相对分子质量的测定.doc

细胞色素c的制备与相对分子质量的测定 钟日龙(2009316044) 赵炀 （山西大学生命科学学院 山西太原市坞城路92号 邮编：030006）摘要 氧化型细胞色素C在408nm、530nm有最大吸收峰，还原型细胞色素C在415nm、520nm和550nm有最大吸收峰。550nm处的磨尔消光系数为2.77l04moL/m。其中还原型最稳定，实验中所获得的细胞色素产品是氧化型和还原型的混合物。经氧化剂或还原剂处理，可变为单一种型。测定其中一种的光吸收，根据磨尔消光系数，即可计算出细胞色素C的含量。根据生物大分子所带电荷量和大小不同，利用SDS-聚病稀酰的胺凝胶电泳测定细胞色素C的相对分子质量关键词 细胞色素C制备 相对分子质量 电泳法 测定中国分类号： 文献识别码： 文章编号：Preparation of cytochrome c and molecular weight determination Zhong Ri Long (2009316044) Zhao Yang(College of Life Science, Shanxi University Taiyuan, Shanxi Province No. 92Dock Road, City Zip: 030006)Summary of oxidized cytochrome C in the 408nm, 530nm maximum absorption peak of reduced cytochrome C at 415nm, 520nm and 550nm absorption maximum. Seoul mill at 550nm extinction coefficient 2.77 l04moL / m. Which is also the most stable prototype experiment in the product obtained is oxidized cytochrome and also the prototype of the mixture. By oxidizing or reducing agent treatment, into one single type. One measurement of light absorption, extinction coefficient based on grinding Seoul, you can calculate the cytochrome C content. According to the charge of biological macromolecules amount and size of the different rare diseases using SDS-poly amine acid gel electrophoresis of cytochrome C, molecular weight Key words cytochrome C preparation electrophoresis for determination of molecular weight 正文1. 前言细胞色素C是有效的电子传递体，对因组织缺氧引起的一系列症状，起到矫正细胞呼吸与物质代谢作用。临床上细胞色素C主要用于治疗因组织氧化还原过程障碍及因组织缺氧所引起的一系列疾病，如改善脑血管障碍、脑出血、脑外伤、脑动脉硬化、脑栓塞、中风后遗症等引起的氧缺乏等症状；治疗一氧化碳中毒、催眠剂中毒、新生儿假死、视神经症以及因心脏代谢障碍、心绞痛引起的心肌组织缺氧等。也可应用细胞色素C治疗因支气管哮喘和慢性肺炎所致的肺功能不全。有报道对进行性肌肉萎缩症也有较好疗效。其肠溶衣口服片对放疗和化疗引起的白细胞降低等也有改善作用。细胞色素是只存在于需氧细胞中。细胞色素在线粒体内膜上起传递电子的作用。细胞色C (cytochrome c) 是细胞色素一种。它在线粒体呼吸链上位于细胞色素B 和细胞色素氧化酶之间，是呼吸链的一个重要组成部分。细胞色素C是一种稳定的可溶性蛋白，耐热、酸碱，不易变性。细胞色素C ，相对分子质量约为13000，蛋白质部分由104 个左右的氨基酸残基组成。它溶于水，在酸性溶液中溶解度更大，故可自酸性溶液中提取。其制品分为氧化型和还原型两种 ，前者水溶液呈深红色 ，后者水溶液呈桃红色。细胞色素C对热、酸和碱都比较稳定 ，但三氯乙酸和乙酸可使之变性 ，引起失活。吸附剂通常在微酸性(pH56)或低盐溶掖中吸附蛋白质。吸附于吸附剂上的蛋白质在微碱性或较高改浓度条件下即可洗脱下来。还原型细胞色素C波长520nm处有最大吸收值，根据这一特性作出一条标准细胞色素C浓度和对应的光密度值的标准曲线，然后根据测得的待测样品溶液的光密度值就可以由标准曲线的斜率求出待测样品的含量。根据生物大分子所带电荷量和大小不同，利用SDS-聚病稀酰的胺凝胶电泳测定细胞色素C的相对分子质量。细胞色素C在动物心肌和酵母中含量丰富，可作为实验材料。所以本实验以新鲜猪心脏为材料。2. 实验部分21主要实验器材与试剂 绞肉机；电磁搅拌器；电动搅拌器；离心机；72l型分光光度计；玻璃柱(2.530cm)；下口瓶；烧杯(2000、1000、500m1)；量筒；移液管；玻璃漏斗和纱布；玻璃棒；透析袋沸石（80目）滤纸 三恒电泳仪 垂直平板电泳槽 移液器 烧杯 直尺2MH2SO4溶液；1MNH4OH溶液；固体硫酸铵25硫酸铵溶液:100m1蒸馏水中含25克硫酸铵，约相当于25时40的饱和度0.2氯化钠溶液：称0.2克氯化钠，用蒸馏水溶解并定容至100ml.BaCl2试剂：称12克BaCl2,溶于100ml蒸馏水中。20三氯醋酸溶液联二亚硫酸钠(Na2S2O42H2O)凝胶贮液 分离胶缓冲液 10%SDS 浓缩胶缓冲溶液 样品缓冲液 电移缓冲液 低相对分子质量标准蛋白 染色液 脱色液 10%过硫酸铵 待测维生素 C 样品2.2 试验方法2.2.1 实验原理向心肌中加入三氯乙酸溶液，进行匀浆，大部分的蛋白质都沉淀下来，细胞色素C则留在三氯乙酸溶液中。将硫酸铵粉末加入到三氯乙酸抽提液中，硫酸铵与抽提液中的肌红蛋白、血红蛋白等一起沉淀下来，细胞色素C仍留于溶液中。再用乙酸乙酯酸化此溶液，细胞色素C就沉淀出来，然后透析并鉴定之。鉴定及测定细胞色素C用消光法。在550毫微米波长下，细胞色素C的克分子消光值为：氧化型细胞色素C：K1=0.9104/克分子/厘米还原型细胞色素C：K2=2.77104/克分子/厘米其含义为浓度是1克分子/升或1毫克分子/毫升的氧化型细胞色素C溶液，通过1厘米的光程，其消光值为0.9104。样品较纯时，从氧化型转变为还原型或者从还原型转变成氧化型，消光值相同。若样品不纯，含有其他色素，则测得的变化不可靠。【3】本实验细胞色素C的产率50mg/公斤，蛋白质的含量0.5mg/mL，则实验成功。2.2.2 试验流程 材料处理-提取-中和-吸附与洗脱-三氯醋酸沉淀-透析-鉴定-测定2.3实验操作 2.3.1细胞色素C的制备 材料处理取新鲜猪心，用水洗去积血，除去脂肪和韧带，将猪心切成小块，放入组织捣碎机，加入2倍体积的蒸馏水，绞碎。 提取 用1M H2S04调pH至3.8(此时溶液呈暗紫色)，在室温下搅拌提取2小时，在即将提取完毕，停止搅拌之前，以2M 氨水调pH至6.0，停止搅拌。用八层普通纱布压挤过滤，收集滤液。按同样程序处理滤渣，合并两次提取液。 中和 用2mol/L 氨水将提取液调至pH 7.5(此时，等电点接近7.5的一些杂蛋白溶解度小，从溶液中沉淀下来)，冰浴中静置3040分钟中后过滤，收集滤液。 吸附与洗脱 人造沸石的预处理：称取人造沸石（每升提取液约需80目沸石10克)，放入烧杯中，加水搅拌，除去12秒钟内不下沉的过细颗粒。 装柱：选择一个底部带有滤膜的干净的玻璃柱(2.530 cm)，柱下端连接一乳胶管，用夹子夹住，柱中加入蒸馏水至2/3体积，保持柱垂直，然后将已处理好的人造沸石带水装填入柱，注意一次装完，避免柱内出现气泡。 上样：柱装好后，打开夹子放水(柱内沸石面上应保留一薄层水)将准备好的提取通过人造沸石柱进行吸附。柱下端流出液的速度为1.0ml/分钟。随着细胞色素C的被吸附，柱内人造沸石逐渐由白色变为红色，流出液应为黄色或微红色。 洗脱：吸附完毕，将红色人造沸石从柱内取出，放入烧杯中，先用自来水，后用蒸馏水搅拌洗涤至水清，再用0.2NaCl溶液分三次洗涤沸石，再用蒸馏水洗至水清，按第一次装柱方法将人造沸石重新装入柱内，用25硫酸铵溶液洗脱，流速大约2ml/分钟，收集含有细胞色素C的红色洗脱液，当洗脱液红色开始消失时，即洗脱完毕。人造沸石可再生使用。 人造沸石再生：将使用过的沸石，先用自来水洗去硫酸铵，再用0.25M氢氧化钠和lM氯化钠混合液洗涤至沸石成白色，前后用蒸馏水反复洗至pH78，即可重新使用。 盐析为了进一步提纯细胞色素C，在上面收集的洗脱液中，加入固体硫酸铵(按每l00m1洗脱液加入20克固体硫酸铵的比例)边加边搅拌，放置30分钟后，杂蛋白便从溶液中沉淀析出，而细胞色素C仍留在溶液中，用滤纸(或离心)除去杂蛋白，即得红色透亮细胞色素C溶液。 (6) 三氯醋酸沉淀 在搅拌情况下向所得透亮溶液中加入20三氯醋酸(2.5m1三氯醋酸/100m1细胞色素C溶液)，细胞色素C立即沉淀出来（沉淀出来的细胞色素C属可逆变性)，立即于3000转/分钟离心15分钟，收集沉淀。加入少许蒸馏水，用玻棒搅拌，使沉淀溶解。 透析 将沉淀的细胞色素C溶解于少量的蒸馏水后，装入透析袋，在500m1烧杯中对蒸馏水进行透析除盐(电磁搅拌器搅拌)，15分钟换水次，换水3至4次后；检查透析外液SO42-是否已被除净。检查方法：取2m1 BaCl2溶液于试管中，滴加2至3滴透析外液至试管中，若出现白色沉淀，表示SO42-未除净，反之，说明透析完全，将透析液过滤，即得细胞色素C制品。 2 鉴定取制品与CBB试剂反应，观察颜色变化。2.3.2细胞色素c的定量测定样品测定 取1ml样品，稀释适当倍数，再加少许联二亚硫酸钠，在波长520nm处测定光密度。最后根据标准曲线的斜率计算其细胞色素C的含量。2.3.3相对分子质量的测定2.3.3.1 将垂直电泳槽装好，用15%琼脂趁热灌制于电泳槽平板玻璃的底部，以防漏。2.3.3.2 分离胶的选择和配置方法（1）按照蛋白质不同的相对分子质量选用不同的分离胶 蛋白质相对分子质量的范围分离胶的浓度5*1052%-5%(2)不同分离胶的配置方法分离胶的浓度20%15%12%10%7.5% 重蒸水1.5mol/LTris-HCl(pH8.8)/ml质量浓度10%SDS/mL凝胶贮备液（Acr/Bis）/ml量浓度为10%过硫酸铵、ul TEMED/ul总体积、ml0.752.50.16.6505102.352.50.15.0505103.352.50.14.0505104.052.50.13.3505104.852.50.12.5505102.3.3.3 分离胶的灌制 根据待测蛋白质样品的相对分子质量选择合适的分离胶浓度，本实验选用血管内皮细胞生长因子（VEGF）为待测相对分子质量的样品，用12%的分离胶。在15 ml试管中依次加入重蒸水3.35ml，1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)/ml缓冲液2.5ml,10%SDS/mL, 凝胶贮备液4.0ml, 10%过硫酸铵50ul和TEMED5ul,由于加入TEMED后凝胶就开始聚合，实验应立即混匀混合液，然后用滴管吸取分离胶，在电泳槽的两玻璃之间灌注，留出梳齿的齿高加1cm的空间以便灌注浓缩液。用滴管小心地在溶液上覆盖一层重蒸水，将电泳槽垂直静置于室温下约30到60分钟，分离胶则聚合，待分离胶聚合完全后，除去覆盖的重蒸水，尽可能去干净。2.3.3.4浓缩胶的配置与灌制一般采用5%的浓缩胶，配制方法：重蒸水2。92ml,0.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH6.8)1.25ml, 10%SDS0.05ml, 凝胶贮备液（Acr/Bis）0.8ml,10%过硫酸铵25ul, TEMED 5ul, 在试管中混匀，灌注在分离胶上。小心插入梳齿，避免混入气泡，将电泳槽垂直静置于室温下至浓缩胶完全聚合（约30min ）。2.3.3.5 样品的制备（1）标准蛋白质样品的制备取出一管预先分装好的20ul低相对分子质量蛋白质，放入沸水浴中加热35分钟，取出冷至室温。（2）待测蛋白质样品的制备a, 10ulVEGF(约含5ugVEGF)加10ul 2倍还原缓冲液。b, 10ulVEGF(约含5ugVEGF)加10ul 2倍非还原缓冲液。以上a,b两管均同标准蛋白质样品一样，放入沸水浴中加热35min, 取出冷至室温. 2.3.3.6 电泳（1）待浓缩胶完全聚合后，小心拔出梳齿，用电极缓冲液洗涤加样孔（梳孔）数次，然后将电泳槽注满电极缓冲液。（2）用微量注射器按号向凝胶梳孔内加样（3）接上电泳仪，上电极接电源的负极，下电极接电源的正极。打开电泳仪电源开关，调节电流至2030mA并保持电流强度恒定。待蓝色的溴酚蓝条带迁移至距凝胶下端1cm时停止电泳。2.3.3.7染色与脱色小心将胶取出，置于一大培养皿中，在溴酚蓝条带的中心插一细钢丝作为标志。加染色液染色1h，倾出染色液，加入脱色液，数小时更换一次脱色液，直至北京清晰。2.3.3.8相对分子质量的计算用直尺分别量出标准蛋白质、待测蛋白质区带中心以及钢丝距分离胶顶端的距离，按下式计算迁移率：相对迁移率=样品迁移距离（cm）/染料迁移距离（cm）以标准蛋白质Mr的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线。根据待测蛋白质样品的相对迁移率，从标准曲线查出其相对分子质量。3结果与分析一 标准曲线的绘制： 取1毫升标准品(81mg/ml)，稀释至25ml，从中分别取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml，分别置于五支试管中，每管补加蒸馏水至4m1，并加少许联二亚硫酸钠作还原剂，然后在520nm处测得各管的光密度，分别为0.179，0.330，0.520，0.700，0.870。以浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，作出标准曲线图。 浓度00.1620.3240.4860.6480.81光密度值00.1790.330.520.7087经测得样品吸光光度值为0.308在图中可读出样品的浓度为0.329计算得样品 m=2.139mg二利用SDS-聚病稀酰的胺凝胶电泳测定细胞色素C的相对分子质量12345