（细胞生物学专业论文）斑马鱼（danio+rerio）p糖蛋白cdna的克隆及表达分析.pdf

摘要 斑马鱼( d 以咒2 d 厂e 以d ) p 糖蛋白c d n a 的克隆 及表达分析 细胞生物学专业硕士研究生：马云芳 指导老师：梁国鲁研究员 崔宗斌研究员 摘要 p - 糖蛋白( p g l y c 叩r o t e i n ，p 母p ) 是一类能量依赖性的转运蛋白，能将许多结构不同的化 合物逆向转运出细胞。该蛋白首次是在肿瘤细胞中发现的，但是近年研究发现它在正常组织 中也有表达，主要参与约物和内、外源毒素的吸收、分布和排泄，行使解毒和防御保护的功 能。因此，通过转植p - g p 基因有可能降低经济鱼类、虾等水产品和经济作物中有毒污染物的 积累，对保护人类健康将有积极意义。 斑马鱼( d 彻胁，p d ) 具有性成熟早、全年皆可产卵、产卵量大、体外受精、胚胎透明和 发育迅速等优点，是脊椎动物发育学家特别感兴趣的模式动物之一。目前，对于斑马鱼卵子 发生及早期胚胎发育过程的调控机制已经引起越来越多研究者的重视。 由于目前国内外尚未有人在斑马鱼中研究p g 尸基因，本文将人的p g p 核苷酸序列在 n c b i 中比对发现斑马鱼p g p 基因的预测序列，后根据此序列设计引物，以斑马鱼肠道总r n a 反转录得到的c d n a 为模板克隆得到长度为4 0 4 4b p 的序列，经分析比对确定该序列为斑马鱼 p g pc d n a 全长序列。 对p g pc d n a 进行了一系列的生物信息学分析，发现该基冈定位丁斑马鱼第1 1 号染色 体上，包括2 8 个外显子和2 7 个内含子，其o r f 编码一个由1 3 4 8 个氨基酸组成的蛋白质。采 用c o 玎叩u t ep i m w 对预测蛋白进行分析，得到其理论等电点为6 2 3 ；分子量为1 4 8 9 6 lk d a 。 在n c b l 数据库中，对p g pc d n a 及其编码的氨基酸序列进行b l 舔t 分析，结果显示：在斑马 鱼中克隆得到的p g pc d n a 序列与n c b i 中预测的p g pc e i n a 序列( x m6 9 4 7 5 5 ) 之间有部 分差异；该基因编码的氨基酸序列与人m d 卿砌只a 加2 8 2 8 5 ) 、小鼠( 胁sm 搬c “帆 n p0 3 5 2 0 6 2 ) 等的氨基酸序列比对发现他们的相似度分别为6 9 7 和4 9 5 ，其中w a l k e r a 、 a b cs i 朗a t i l r e 、w a l k e 卜b 等区域在这三个物种中都存在，且高度保守。s m a n 分析发现p g p 由u 姨区、跨膜区、低度保守区等区域组成。根据系统进化分析，p g p 在软骨鱼纲、硬哥 鱼纲、哺乳纲以及哺乳纲的啮齿目中较保守，保守度可达到7 8 以上；与线虫和植物等低等 生物的氨基酸序列差异性较人，但部分区域仍很保守。生物信息学分析结果还显示该蛋白有 4 2 个丝氨酸( s e r i n e ，s e r ) ，1 6 个苏氨酸( 1 1 l r e o n i n e ，t h r ) ，1 2 个酪氨酸( t ) s i m ，t y r ) 可 i 西南人学硕十学位论文 能成为蛋白激酶磷酸化位点；对其进行细胞定位，结果显示p g p 是一个膜蛋白，主要定位 于细胞内膜，而且该蛋白没有明显的信号肽区域，是一种非分泌性蛋白。 采用整体原位杂交( w h o l e m o u n t 加j f mh y b d i z a t i o n ，w i s h ) 对斑马鱼不同发育时期的胚 胎，只g p i n 】刚a 表达模式进行分析，发现p - g p l l l 】刚a 在未受精时期就有表达，但表达量很 低；在受精后6h ( 即6h p f ) 的囊胚中期胚胎中，p - g p 在胚体上染色呈现为弥散均染状态， 从动物极看呈“u ”字型；从6h p f 至1 2h p f 只g p 在胚胎的头部和尾芽部位表达明显增强， 在背部的表达开始集中于脊索；当胚胎发育至2 4h p f 时，p - g 尸在头部的表达进一步集中于眼 睛和脑，在中脑和后脑的连接处有最强的表达，同时在脊索，原肾管、脊髓、背大动脉及静 脉轴处均有表达。自2 4h p f 以后至4 8h p f 尸- g p 在体节中的表达相对2 4h p f 时要弱，但脑中 仍旧维持一定水平的表达。 关键词：斑马鱼p 一糖蛋白c d n a 克隆整体原位杂交 第1 章文献综述 第1 章文献综述 1 1 发育生物学研究的理想模式生物斑马鱼 发育生物学( d e v e l o p m e n t a lb i o l o g y ) 是应用现代生物学的技术研究生物发育本质的科学， 是研究生物体从精子和卵子的发生、受精、发育、生长至衰老、死亡规律的科学。 发育生物学的研究离不开理想的模式生物。作为无脊椎动物发育生物学研究的模式动物， 果蝇( d d s 印j l l 妇，l e 肠玎d g 砸灯) 和线虫( c 矗册d 砌口6 口豇括p 艇渺胛s ) 在无脊椎动物的发育生物学 研究上起到了重要作用。因为脊椎动物在胚胎结构及形态形成等方面都与无脊椎动物存在极 大的差异，所以其中有些特征根本不能用无脊椎动物进行研究，如脊椎动物胚胎极其复杂的 神经系统等特征在无脊椎动物模型中并不存在，还有些脊椎动物器官与低级的无脊椎动物没 有明显的同源性。因此，进行脊椎动物胚胎的形成及人类方面的研究就必须借助丁理想的脊 椎动物的模式种。鼠类虽然在基因转移等方面有了高速发展，但因为其胚胎深埋于母体子宫 中无法进行观察；爪蟾( 舵玎叩“s 肠纠括) 虽然一直是胚胎学的好材料，但繁殖太慢因而难以 成为生物学研究的好对象。相对来说，斑马鱼因具有极高的繁育力、体外产卵、体外受精且 胚体透明等生殖特性而成为生物学家珍爱的研究对象。随着近十几年来人批分子生物学家对 斑马鱼的重视，斑马鱼在提示生命本质及其运行机制的发育生物学领域中的地位日趋重要。 斑马鱼用丁二基冈筛选仅有2 0 多年的历史，其创始人是美国o r e g o n 人学已故的著名遗传 学家g e o 唱es 仃e i s i n g e r 。1 9 8 1 年，他在n a t u r e 上发表了关于斑马鱼人i t 雌核发育的研究， 使斑马鱼开始引起人们的极大关注，同时奠定了斑马鱼发育遗传学研究的基础【lj 。位于 t n b i n g e n 和b o s t o n 等地的儿个实验室自1 9 9 3 年开始对斑马鱼进行e n u ( 一种化学突变剂) 人规模系统突变筛选和建库一l = 作【2 l 。1 9 9 4 年，以“斑马鱼发育和遗传”为主题的会议在冷泉 港召开，标志着斑马鱼已成为继小鼠、果蝇、线虫后义一发育生物学研究的重要模式生物。 1 9 9 6 年，d e v e l o p m e n t 上发表了一系列影响斑马鱼各系统组织( 心血管、脊索、脑等) 发 育的突变体，从而揭开了斑马鱼用于基因组和脊椎动物发育研究的序幕【3 1 。2 0 0 2 年8 月英国 剑桥桑格中心( s a l l g e r c e n t e r ) 宣称斑马鱼基冈组草图已经完成以及最近斑马鱼的基冈组测序 已经完成，都无疑会加快斑马鱼基因的功能研究。至此，斑马鱼已完全具备作为脊椎动物发 育生物学甚至人类基因组计划模式动物的条件，已成为胚胎发育遗传控制研究中盛行的动物 模型，被誉为“脊椎动物中的果蝇”。 1 1 1 斑马鱼的生物学特性 斑马鱼又名蓝条鱼、花条鱼、蓝斑马鱼、印度鱼，是属丁辐鳍亚纲( 彳c 砌d p 螂f ) 鲤科 ( 咖胁e ) 短担尼鱼属( d 口，2 f o ) 的一种硬骨鱼，原产于南亚，是常见的热带鱼。斑马鱼 体早纺锤形，稍侧扁，头稍尖，身上有斑马样的条纹，故得名斑马鱼( 如图1 1 所示) 。其品 种约有l o 多种，如长鳍斑马鱼、金丝斑马鱼、闪电斑马鱼、人斑马鱼等，主要区别在条纹和 色彩上，也有鳍行上的变化。 瓶甫人学硕+ 学位论文 些药物的水中即可f 8 】，另外可以在母体外对胚胎进行独立操作。这些性麓都优丁小鼠，小鼠属 予胎盘动物，胚胎操作时不能离开母体，而且实验分析时需要人量推论( 如投入母体的化学 药物在被耧胎感庵之前，常常要发生找辩交纯) 。在小鼠蓬臆发育赣问对其进行物理性操谗难 度较人，要观察胚胎必须将母体处夕e ，胚胎也随之死亡。 6 。斑玛鱼的坯胎发育j # 常迅速( 从受精到孵出大约3d ) ，胚胎在钵外l 天的发育程度裁 相当于人类胚胎3 个月的发育水平；而且，来之予同一母体的胚胎楚网步发育的，易于大登 收集特定阶段的同期胚胎材料。而小鼠的胚胎从受精到出生需要2 0d ，早期胚胎间的发育往 往楚不露步的。 7 斑马鱼的胚胎是完全透明的，这样即使在发育的高级阶段，仍然可以观察到全部的细 胞。这使褥研究者不仅能跟踪鼹察每一个细胞的发育命运，原肠期的细胞运动、脑区的形成 和心跳等胚胎发育事件，而釜也可观察到整个心盔管系统的发育过程。另外在坯胎发育时期， 其体型不会发生多大变化。利用这些特 生使研究者可以通过一些技术和荧光染色获得胚胎发 育鹜巴丽赵还可以在瑟期殛麓上实施缨脆及组织移植技术i 涮、全题组织标本制接技术 n 纛全 胚原何杂交技术1 1 2 l 等。小鼠胚胎是不透明的，操作起米较为幽难，如标记染色、移植等这一 类技术是不可能实现的。在发育期问其胚胎体积发生很大变化，2 0d 的发育期中仅有4d 可以 进行全胚胎抗体和琢位杂交分析。 8 斑马鱼的心瞌管、血液、消化道、肝脏、肾脏以及视觉系统与人类相麻系统有许多欺 阉特点，龙其是心夔管系统晕羧发育与入类极为耀似，心盎管系统有缺陷的突变体仍可长时 间存活，这为心血管发育遗传学研究提供极为有利条件。 9 在斑马鱼中能够观察到发育阶段死亡的斑马题胚胎( 死于致死突变或化学处理等) 。小 鼠胚胎死亡螽穰快就被吸收。 1 1 5 斑马鱼在发育生物学上的应用 斑马馥由于具有上述优点，近几年来已经成为研究脊椎动物发育的很好的试验材料，其 在发育生物学中的应用领域越来越广泛。 1 细胞谱系分季露：细胞谱系分祈是纲貔命运和细胞运动懿鞭踪发蠹生物学最主要麴研究 内容之一。它通过记录特定细胞在胚胎发育中的分裂历史，来提示其特定的细胞发育命运， 弗观察其发育潜麓。斑马鱼由予发育蓖期细胞分裂速度抉，胚体透明，特定的细胞类型易予 识别等有利闵素，很快成为脊椎动物中最适丁进行细胞谱系分析的物种。该方面的早期工作 主要由俄勒州人学斑马鱼研究中心的硒洲n e l 和w 魂a 等人完成1 1 怕】。斑马鱼的细胞谱系分析 和细胞发育命运追踩已开始癍耀 组织器宫熬起源囊舞究。例如采阁该技术，e a l l a 黼等证明斑 马鱼、斗熊和爪蟾侧线系统中的机械感受器为双重发育起源，即源丁神经脊和表皮基板m j 。 2 。突变鉴别斑马鱼单倍体：采崩突变对斑马鱼产出单倍体后代的w 能性较大，可以快速 育成_ 二倍体斑马鱼的同基囡占矗系，而在小鼠中单倍体只能通过持续近交获得。豳s 骶i s i n 孵 等在斑马熊中发明的单倍体和二倍体雌核发育技术克服了此前在脊椎动物中鉴别纯合隐性突 变体耗时的难题h l ，攀倍体簸骀霹戬羽以鉴别影响基本体型髓突变。零l 爰斑马鱼繁殖一代仅 需三个月左右的遗传特点，i s i n g e 等很快就鉴定出许多重要的突变i l 8 侈j 。 3 饱含诱变分柝：饱合诱变方案是1 9 世纪8 0 年代初在果蝇中开创的，并很快使果蝇成 6 两南人学硕十1 位论文 图1 1斑马鱼的基本形态 f i g 1 1 t h eb a s i cp a t t e mo f z e b r a f i s h ( f r o mh t t p ：z 6 n o r g c g i - b i n w e b d r i v e r ? m i v a l = a a z d b - h o m e a p g ) 斑马鱼性情温和，活泼好动，其对饲水水质要求不苛刻，喜在酸碱度中性的水中生活， 适宜水温2 l 一2 6 ，但斑马鱼适应范围广，水温在1 5 4 0 之间仍可生活。斑马鱼喜在上层水 域活动和觅食，对饵料不挑剔，各种鱼虫及人t 饲料均可投喂。饲养斑马鱼最好在缸底铺些 较人的卵“，便于沉淀物聚集，不使水浑浊。它不进攻和杀：# 其它鱼，适宜混养。 斑马鱼的雌雄区分容易：雄斑马鱼鱼体修长，鲢人，体色偏黄，臀鳍警棕黄色，条纹显 著；雌鱼鱼体较肥大，体色较淡，偏蓝，臀鳍呈淡黄色，怀卵期鱼腹膨人明显。斑马鱼的繁 殖比较容易，繁殖，【 j 水要求p h 6 5 7 5 ，硬度6 8 ，水温2 5 2 6 。斑马鱼最喜欢白食其卵，冈 此繁殖时应隔离鱼和卵。繁殖时可按雌雄鱼2 ：1 的比例放入繁殖缸内，一般头天晚上放入，第 一二大上午或中午就可以受精产卵。一条雌鱼每次可排卵3 0 0 1 0 0 0 粒不等。受精卵经2 3 大可 孵出仔鱼，再经2 天仔鱼开始游动觅食，开始先以草履虫变形虫等原生动物喂养，1 0 天后可 改喂其他小型鱼虫。斑马角的繁殖周期约7 大左右，一年可迮续自然繁殖6 7 次，而且产卵量 高。 1 1 2 斑马鱼的配子发生 进行有性生殖的高等动物，由生殖细胞( g e r n lc e l l ) 分化产生配子( g a m e t e ) ，使种族的 生命得以延续而构成生活周期( 1 i f ec y c l e ) 。在各生活周删中，雌性配子和雄性配厂结合形成 合f ( z y g o t e ) 。合子通过一系列复杂的发育过程，产生具有体细胞( s o m a t i cc e l l ) 和生殖细胞 的有机体。每个世代的个体经历个体发育过程，同时由成熟个体的生殖细胞分化形成雌性配 子和雄性配子，再由两性配子结合开始另一个世代的个体发育，如此周而复始。 在胚胎发育初期生殖细胞就已经决定了的动物，其生殖细胞米源于它的前体一原始生殖 细胞( p n m o r d i a lg e n nc e l l ，简称p g c ，复数为p g c s ) 。这些原始生殖细胞只有经过迁移，进 入发育中的生殖腺原基一生殖嵴( g e n n a la 1 1 l a g e g e n i t a lr i d g e ) 斤才能分化成生殖细胞。与周同 的体细胞相比，p g c s 很人并含有一个人的圆形核，核的直径为6 1 0 u m ；与体细胞的细胞质 和细胞核相比，p g c s 的细胞核和细胞质的曙红染色4 i 显著。性腺形成时，p g c s 核着色较浅， 相比甲期具有更致密的物质。 脊椎动物配子发生包括卵子发生( o o g e n e s i s ) 和精子发生( s p e n n a t o g e n e s i s ) 。在生殖细 胞发生过程中，_ 二倍体的p g c s 要通过减数分裂和分化才能转化成单倍体的卵或精子。生殖细 胞的发生都要经过增殖期、生k 期和减数分裂期。一个初级精母细胞经过两次成熟分裂形成4 2 西南大学硕十学位论文 3 囊胚期( b l a s t u l ap e o d ，2 2 5 5 2 5h p f ) ：从第8 次卵裂( 1 2 8 细胞期) 开始，就进入囊 胚期形成盘状囊胚。与其他硬骨鱼类不同的是，斑马鱼的囊胚期不形成囊胚腔，只在胚盘的 下层细胞中形成一些小的细胞外间隙；同时，细胞分裂的周期开始延长，这标志着中囊胚转 换( n l i d b l 硒t l l l at r a m i t i o n ，m b t ) 开始。中囊胚转换始于第1 0 次细胞分裂即第5 1 2 细胞期，比 爪蟾早2 个细胞周期。此时，细胞丧失同步化【6 1 ，新的基因开始表达，且细胞获得运动性；同 时中囊胚进入由母型调控向合子型调控的过渡期：大部分合子基因开始转录，细胞分裂减慢， 细胞移动明显等。该时期的胚胎细胞分三个细胞群( 图1 - 3 ) 即卵黄合胞体层( y o l ks y i l c ”i a l l a y e r y s l ) 、包被层( e n v e l o p i n gl a y e r e v l ) 和深层细胞( d e 印c e l l ) 。这些细胞群可以通过其有丝 分裂周期的长短来区分【7 】：卵黄细胞保持较短的细胞分裂周期；包被层细胞具有较长的细胞分 裂周期；深层细胞的分裂周期居于两者之间。 “t7 j l | ：! ，：一j 图1 3 囊胚期三个细胞群的分布 f i g 1 3 t h ed i s t r i b u t i o no ft 1 1 et h r e ec e l l si i lb l 勰t u l ap e r i o d ( f r o l nh t t p ：a c a d e r l l i c r e g i s e d u m 曲e d o t t b l 4 1 2 ) 4 原肠期( g a s t m l ap e r i o d ，5 2 5 1 0h p f ) ：原肠作用( g a s t m l a t i o n ) 指囊胚细胞有规则地 移动，使未来的内胚层和中胚层细胞迁入胚胎内部，而未来的外胚层细胞铺展在胚胎的表面， 从而形成原肠胚。原肠期主要的细胞移动类型包括外包( 印i b o l y ) 、内陷( i n v a 酉n a t i o n ) 、内 卷( i n v o l u t i o n ) 、内移( i n g r e s s i o n ) 、分层( d e l 锄i n a t i o n ) 和汇聚伸展( c o n v e r g e n te x t e n s i o n ) 。 在斑马鱼原肠期，生殖层开始形成。斑马鱼的原肠运动主要包括外包【4 】、内卷和汇聚伸展 ( 图1 4 ) 。外包始于囊胚期末，1 2 外包标志着原肠胚期的开始期。 】嘎终s t o d e o 婴 s p r e a d 组go fg a s t l ? 瞳a t l o nb e l ! 蛔s c o m r e l 謦e n c e s n so ny o l k b l a s t o d e 珊l ，ye p i b o b ， 训t hl i o i 孤嘣o n a n de 】【f ；n t l o n ：+ 一_ 一 一_ 4 图1 _ 4 斑马鱼的原肠运动类型 f i g 14t h et ) ，p eo fg a s 仃u l a t i o nm o v e m e n ti nz e b r a 6 s h ( f r o mh t t p ：a c a d e m i c r e 百s e d “m g h e d o 协，b l 412 ) r甚 &废 第l 章文献综述 为发育生物学研究的焦点，其原理是朋化学诱变剂处理成熟的雄性个体，然后用诱变了的精 予与卵子受精，产生的个体通过三代繁育来筛选发育异常的胚胎1 2 。因为发育过程是由一系 列的分子事件控制，要想解析完整的发商过程，岿须要筛选到影响一系列事俘的全部基因或 几乎全部蕊因，这就需要人量的动物个体进行筛选，而在脊椎动物中臻获得要求数量的个体 难度很大。在奎鼠中虽可获锝数隧吾计酶缝系动物，但由予凝骀在子塞中发育，涯狳壤受到 影响的突变体无法璺现，因而限制了其研究范围。斑马鱼卵予体外受精和胚胎体外发育的特 征则解决了这一难题。利用酚哪为最佳的饱合诱变剂，已筛选出了1 3 个具有明显异常表 型的突变体【2 啦】。这魑具有特定表征缺陷的突交体为从分子水平了解其发育过程提供了独特的 材料，为突变基因克隆和分析打下了基础。 4 。基因转移研究：中国科学院求生生物研究所朱终言等在世界上率先开展了鱼类基因工 程定向育种研究，建立了完糕的转基因鱼理论模型和完善的实验技术体系，为转基因鱼育种奠 定了理论基础【2 2 f 2 引。由于斑马鱼不仅遗传背景清楚、繁殖周期短、产卵过程可人为控制、怀卵 繁大、体矫受精、腥胎透瞬便予观察等，丽苴具有成熟的转基阕技术，因纛己威力鱼类基因 i ：稃中基同源重组、基冈表达调控和基冈功能研究的理想材料。斑马鱼的转基冈研究始于 1 9 8 8 年1 2 砒，目前国内外已获得约3 7 个转基阑斑马惫蘸系1 2 。斑马鱼转纂冈技术对分毒厅体内细 胞间相互作用，作为动物模型探讨发育、生长、繁殖等机理，以及阐明控制脊椎动物的发育 机制等方面均具有重要意义。斑马鱼基因_ l ：程将来发展方向：j e 3 - j ：筛选转基阑鱼类：过去 大部分的研究集中在剃期转基阂斑马鱼进行发育基因表达和活体形态发生等方瑟，今后须考 虑利州荧光标记鱼米筛查突变体、小分子或抑制嗽常发育的毒素。目前最常刚的定点基因失 活方法是将吗啉代( m 岬h o l i n o ) 注射到早期的胚胎中。斑玛鱼还可羽予筛查阻断特殊发育途 径的小分子，最近的研究显示，8 1 1 合成的小分子对发育的中枢神经系统、心血管系统、 耳或色素的正常形成有促进作用【2 刚。此外，还可以用表型模拟人类疾病的鱼筛选具有治疗价 值的小分予f 2 乃。应用于生态发育生物学研究：转基因技术推动了生物“环保l 舞兵”豹飞速发 展，斑马鱼是这些生物“环保哨兵”中业绩最为突出的动物之一。科学家往往通过改造基冈的方 法选斑马焦发光，从而作为环境污染物煦指示器。据报道存在3 种川转基因斑马鱼检测琢境 有害化学物的方法：一种是利翊携带了熬合高拷贝数量的人肠杆菌穿梭载体的斑马鱼来测试 环境诱变剂【2 8 】；第二种方法利用标记转基因斑马鱼，其荧光溅荧光素酶受到一种启动调控元 件熬诱导，瑟这种崩动谖控元件义受翻不藏的环境污染物黧芳烃、重金j | 墓和环境雌激素的影 响【2 9 】；第三种可能性是利用组织限制的荧光标记鱼米筛选对特殊发育途径产生特别作用的环 境毒素。因此转基因斑马鱼不仅可以服务丁阐明自然的发育事件，丽越可以崩来促进发育途 径中某些重要成分的发现，以及评估环境对这些相同途径的作并j 。制备基因敲除动物模越： 目前，随蓿斑马鱼基因定点整合技术和转基因斑马鱼克隆实验体系的建立，转基冈斑马鱼将 成隽基因功麓研究和久类疾病模型研究憋理想模型。透过基因组旋定点改造和黪馋，转基圜 斑马鱼可商效表达目的基冈的缀白质产物或合成相关代谢产物，并在惫类特定组织中富积， 成为高效的“生物反趱器”，生产廉价的珍贵蛋白质秘药物。 5 构建基阂连锁图：要想签定和克隧控制突变表型的基因并分析它们的正常功能，前提 条件是构建斑马鱼的基冈连锁网，然后在己知标记的基础上，才有可能克隆和分析新的基因。 l o 魏懿s o 珏等 3 硼翻敷l e 鞋掰a i f 3 l 等利翊爨马焦可进行攀倍体和二倍俸雌核发育戆有翻条诗，构建 7 烈南人学硕士学位论文 了斑马鱼的第一个连锁图。在此基础上，p o s t l e t h w a i t 等进一步直接扩殿了基因型单倍体胚胎 的分析能力，已将一隐性的色素突变基因( 黄铜色) 定位到了连锁图上。他们估计，用1 0 0 0 对雩| 物，铥何突变都可被定位予一个分子标记豹o 。5 分摩之逡( 约3 蝻) ，这些非常程近的 连锁标记可以通过染色体步行法来克隆突变基因的起始点，以加快定位速度。2 0 0 2 年8 月英 阑剑桥桑格中心( s 鞠辨f c e n t e r ) 宣称斑马鱼基因缀革图已经完成，因此斑马鱼基因克隆和基 因定位必将会大大加快。 1 1 。6 斑马鱼是一个研究人类相关疾瘸的重要模式动物 1 斑玛鱼成为研究人类造血系统的模式动物：因为斑马惫胚胎发育早期，能通过氧的被 动扩散进行呼吸，其存活无需功能性的造血和心敷管系统的存在，在晕期可与死胚分开，因 此可以进行早期造盘和心盘管系统缺陷的研究；丽越斑马鱼透明的胚胎在体钤发育，使人 f 瑟瑟 容易观察胚胎是否有红细胞或瓶红蛋向的生成，因而特别适宜r 造血疾病的模型筛选，并对造 薤系统的病理秘生理功能进行磺究，嚣此成为了一个优秀的垂嚣究器富发生和可遗传人类疾瘸 的脊椎动物模型，并鼠已经建立了理想的分析造血器官发育和欠调的遗传系统p 2 4 酗。 2 斑马鱼成为研究人类神经细胞发育的模式动物：m i l l e f 等p7 】认为斑马鱼是个研究内 裤l 经元致瘸蛋白弓| 起的神经元邋佬的模式生物。如h u n t i n 舒o n s 症( h d ) 和其它电多聚谷氮 酸( p o l y g l u t a m i n e ，p o l y q ) 引起的神经元退化类疾病等。此外，在人类中常 ! 的引起p a r k i n s o n s 疾病的基因在斑马鱼中也被发现，如去泛素化酶u c 量 乞l ，它可能对斑玛鱼早期题胎神经缨胞 的发育和成体斑马鱼脑中神经细胞疾病的发生具有遵要作用p 引。此外，斑马鱼和人类一样， 也利用纤毫细胞探测声音和运动，但是人类的纤毛细胞深埋在内耳中很难接近，斑马鱼的纤 琵细胞剐位于身体的表面。这一特点使它成为研究纤毛细脆发育憨一个极好蠡冬模裂。鲡& 翻l 等【”1 将斑玛鱼作为研究模型，证明胶质细胞在调节感觉纤毛细胞前体的发育中起到一定的作 用，增进了人啻j 对神经细胞发肖枫制的了鳃。 3 斑马鱼将成为研究人类免疫系统的新型模式动物：对斑马鱼免疫系统研究主要集中于 主要组织相容性复合体( m 句o rh i s t o c o n l p a t i b i l i t yc o n l p l e x ，m h c ) ，其次楚1 卜特异性免疫系统中 的巨噬缀施、自然杀伤( n 8 l u 糟l 瓤l l 瓯n k ) 细胞活化相关分子等领域。在斑马垒淋巴纲胞的 发生领域中，已鉴定了多个影响血液系统发育和妨碍淋巴细胞生成的突变基因。目前，斑马 惫在免疫学上的癍岗主要表现在两个方蕊【柏3 。一是n e e l y 等【4 l 】建立的细菌感染致病性链球菌 斑马鱼模裂，它是一个宿主和致病菌都便于基因工程改造和遗传突变分析的生物模型系统， 为进一步研究非特异性免疫反应中宿主和病原体相互作用奠定了坚实的基础。二是、矾e i l l l o l d s 等睁】获得的融g l 缺炎突变体，为特异性免疫系统缺尖戆斑马焦在生理生化方瑟变化和获褥淋 巴系统再生后可能的免疫系统功能水平的变化的研究提供了良好的模溅。 随着斑马鱼基因组计划的嬲动，越来越多的 港巴细胞特异性表达基阕将被相继克隆。利 用这些d n a 分子标记可对特定淋巴细胞的发生及迁移进行豫踪，双丽为人 j 进一步探索淋恐 细胞的成熟、归巢等提供了良好的研究平台。尽管目前斑马鱼作为免疫学模式生物还只是刚 鞫l 起步，傻由于萁翼有发育生物学研究方法成熟、进化遗位特殊、遗传突交筛选简便等特点， 在朱来的研究，特别是免疫系统的发生、发育及特异性免疫系统进化起源等研究领域中必将 发挥日趋重要的作用。 8 第l 章文献综述 肿瘤是对人类健康威胁最人的疾病之一，近年的研究表明斑马鱼同样可以川作产生肿瘤 模型。l a n g e n 她掣4 2 】通过在斑马鱼的胸腺中过量表达小鼠的c m 弦基因而制备出白血病的动 物模型。在斑马鱼中将抑癌基因删3 突变后，易发生恶性周边神经鞘瘤【删。6 一m 力基因突变 后的c r 玎s j i l 6 ”埘( c 而) 突变体杂合体经m 卜烈g 致瘤剂处理后，比野生型鱼更易发生血管瘤、睾 丸生殖细胞瘤等肿剧4 5 1 。m o o r e 等4 6 1 人通过诱变筛选表现基因组不稳定性的突变体，获得多 种易丁发生肿瘤的杂合突变体 1 2p - 糖蛋白( p g l y c o p r o t e i n ) 的研究进展 肿瘤是对人类健康威胁最大的疾病之一，目前化疗是提高恶性肿瘤疗效的一个重要手段， 然而肿瘤细胞对化疗药物产生的多药耐药性( m u l t i d r u g 豫s i s t a i l c e ，m d r ) 往往导致化疗失败。 m d r 是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药性的同时，对结构和作用机制完全不同的抗肿 瘤药物产生交义耐药性，是一种独特的广谱耐药现象。这一概念于1 9 7 0 年由b i e l d e r 首次提出 h 川，自此m d r 的研究得到了广泛开展。近年研究发现，m d r 由多种途径诱导形成，其中由位 于细胞膜上的p 糖蛋白( p g l y c 叩r o t e i n ，p g p ) 所介导的药物转运机制被称为经典m d r 途径。 1 2 1p g p 的基本特征 1 9 7 6 年j u l i 柚。和l i n g 在具有多药耐药性表犁的中国仓鼠卵巢( c h o ) 细胞中发现一种 与耐药程度呈止相关的高分子糖蛋白，命名为p g p ( 由m d r l 或a b c b l 基因编码) ，它是 第一个被发现的人a b c 转运蛋白( a t pb i n d i n gc a s s e t t en 独s p o n e r s ) 【4 8 】。m d r l 基因定位丁人 7 号染色体，编码由1 2 8 0 个氨基酸组成的分子量为1 7 0 k d a 的蛋白质，故p g p 义称p 1 7 0 。 1 p g p 的结构特点：通过序列分析发现，p g p 的分子结构包括两个核苷酸结合区 ( 咖c l e o t i d eb i n d i n gd o m a i n s ，n b d ) 和两个跨膜区( m e m br ：肌es p a l l n i n gd o m a i n ，m s d ) ，每个 跨膜区包括六个疏水的跨膜部位，每个核苛酸结合区含一个亲水的位丁胞浆内的a t p 结合位 点，跨膜区作为膜通道有利丁药物转运，而a t p 结合点与能最供应有关。每两个相邻的跨膜 部位相对并形成一个环状结构，这样整个分子共具有六对跨膜a 一螺旋，1 2 次横跨质膜，在n 端第一个跨膜环的细胞外侧发生糖基化，p g p 的基本序列为m s d l - n b d l m s d 2 n b d 2 ( 图 1 - 6 ) 。 跨膜区( m s d ) 魄外e x t r a c e i i u i a 。 r百1 n 几 ，jiii jl ，i 核苷酸结合区( n b d ) 图1 6p g p 的二级结构拓扑模型 f i g 1 - 6 i 叩o l o g i c a ln l o d e lo fp r e d i c t e ds e c o 岫s n u c t u r e s 蠡吖p g l y c o p r o t e i n 无论从长度或氨基酸组成分析，每一段的m s d 和n b d 均有4 3 的同源性，但任何一个 a t p 结合位点的灭活都可致使整个蛋白质功能丧失，说明高级结构对p g p 功能的发挥具有重 要作用4 9 1 。 9 西南大学硕士学位论文 2 p g p 的作用机制：p g p 是一种依赖能量的跨膜药物外输泵( 图l 一7 ) ，可将抗肿瘤药 物逆浓度从细胞内泵出到细胞外，降低细胞内药物浓度并导致肿瘤细胞的耐药。p g p 作用机 制被认为是一种“疏水真空清洁器”。当肿瘤细胞与化疗药物接触时，脂溶性药物经浓度梯度进 入细胞后与p g p 底物结合区结合，同时a t p 结合到n b d 上；随后，经过a t p 水解，p g p 构型改变，药物从高亲和位点转移至低亲和位点并被排出胞外等一系列变化，使得胞内的药 物浓度不断卜降，药物的抗肿瘤效应也因此减弱甚至消失，肿瘤细胞出现耐药效应【5 0 ，5 1 】。 八 + 寸粤 八乒v ? 够 图1 7p g p 转运机制( a m b u d k a r 钟口，2 0 0 6 ) f i g 1 7 m e c h a j l i s mo ft h e 仃孤s p o n a t i o nf o rp - g l y c o p m t e i n 3 p g p 的生理功能：p g p 在肿瘤细胞中首次被发现，但后来研究表明它在人体正常组织 中也广泛表达，如肠道上皮细胞、血脑屏障毛细管内皮细胞、胎盘滋养层细胞、肝细胞毛细 胆管膜、肾近曲小管上皮细胞等【5 5 4 】。人量研究表明，在生理状态卜，p g p 主要参与内、外 源药物和毒素的吸收、分布和排泄，对机体组织和器官行使防御保护的作用。例如，小肠黏 膜上皮细胞的p g p 限制药物的肠腔吸收以及经j j j = 汁排泄后的重吸收；胎盘滋养层细胞刷状缘 的p g p 可限制多种约物进入胎儿体内，并加速其排泄。在病理情况下，p g p 在相应的组织 内过度表达，导致多药耐药性。 1 2 2p g p 与癌症发生的相关性研究 1 p g p 与癌症治疗：在癌症治疗中，检测p g p 有助于预测化疗敏感性，对选择合适的 治疗方案和实施有效的逆转措施具有重要意义。g u r e l 等用免疫组化方法检测5 5 例胃癌发现 p g p 表达占8 7 ( 4 8 5 5 ) ，p g p 表达程度越高则预后越差【5 5 】。张威等用免疫组化方法检测 1 0 1 例胃癌、1 8 例胃异型增生和2 0 例止常胃粘膜j 发现p g p 在正常胃粘膜、异型增生及未 经化疗的胃癌组织中均有表达，且表达强度依次增加【5 6 】。正常胃粘膜内存在p g p 的表达也说 明人类本身存在m d r l 基因表达，即白身具有抵抗药物的特性，肿瘤细胞的形成只是增加了 这种抗药特性的表达。 2 p g p 与药物代谢动力学：p g p 之所以造成癌症治疗困难重重，主要是其在肿瘤细胞和 止常组织中的分布及对药物的逆向转运功能使得p g p 参与药物的吸收、分布和排泄等过程。 小肠是药物的主要吸收部位，小肠上皮细胞膜上含有丰富的p g p ，且由胃肠近侧端到远侧端 逐渐增加。肠道p g p 所介导的药物外排可限制药物( 底物) 的肠腔吸收或经胆汁排泄后的约 物重吸收，是口服药物吸收差和变异度大的主要冈素【5 7 】。肠道p g p 通过外排泵作用，使进入 小肠上皮细胞内的药物泵出到肠腔，减少药物及其代谢产物经小肠吸收。 l o 第1 章文献综述 研究发现，屏障组织的p 七p 可改变约物在局部组织的分布。如血脑屏障( b l o o d - b m i n b a r r i e r ，b b b ) 部位的p g p 可使长春新碱、表鬼臼毒素等脂溶性高的药物通透性也降低。运 用基因敲除技术证实，与基冈敲除鼠m d r l a ( ) 相比，环孢素a ，v a l s p o d a r 和e l a c r i d 盯可 导致野生型鼠i n d r l a ( + - + ) 脑中紫杉萜( 1 k o t e r e ) 浓度分别提高3 8 、5 6 和5 8 【5 8 】。血 脑脊液屏障( b l o o ( h ：e r e b r o s p i m ln u i db a r r i e r ，b c s f b ) 独特的结构，在维持脑内环境稳定、 外排代谢物、保护脑不受外源有害物质的损伤等方面起重要作用。在b c s f b 中，p - g p 由脉 络丛上皮细胞表达【5 9 1 ，转运药物方向由血液指向脑脊液。胎盘p g p 能限制多种药物( 如长春 新碱、地高辛、孕酮、环孢霉素a 、奎尼丁、氯丙嗪等) 进入胎儿，并加速其排泄【觚6 1 】。利用 基冈敲除技术，证实胎盘可通过表达功能性p - g p ，限制胎儿接触环境致突变物，从而避免胎 儿畸形发生1 6 2 。 p g p 不直接参与药物代谢过程，但对该过程有影响，主要表现在对小肠首过代谢的影响。 研究发现，肠道p g p 与药物代谢酶c y p 3 a 4 之间的关系十分密切【6 3 】。 p g p 存在于肝脏肝小管和肾近曲小管上皮细胞的刷状缘，对药物经尿液和胆汁排泄起着 调节作用。肾脏p g p 可负责将药物经肾小管卜皮细胞管腔面，以主动分泌的方式排入肾小管 管腔内。当药物持续进入肝小管时，该部位p g p 及其他具有外排功能的转运子有助丁将药物 排入_ | j 目汁。进一步研究证实，p g p 参与了地高辛、柔红霉素、阿霉素、长春碱、维库溴铵等 药物经胆汁排泄畔】。当静脉给予p g p 的底物地高辛实验中，在p g p 野生型小鼠m d r l a ( + 件) 给药9 0 m i n 后有1 6 地高辛排泄入肠腔，而基因敲除小鼠m d n a ( - ) 则在肠腔内没有发现地 高辛。p g p 抑制剂奎尼- j 可抑制这一过程，而诱导剂利福平则可诱导该过程【6 5 1 。 3 p g p 与多药耐药性逆转剂：如前所述，肿瘤细胞的多药耐药性与p g p 表达密切相关， 如果抑制该蛋白的基冈表达，就可能逆转肿瘤的m d r ，从而提高肿瘤细胞对化疗的敏感性。 目前，人多数的逆转剂通过抑制p g p 外排泵的功能，提高肿瘤细胞内化疗药物的浓度而 对抗多药耐药性。针对p g p 多药耐药性的逆转方式主要有：1 ) 研制不具多药耐药性的新抗 肿瘤药物。如使用非p g p 药泵作用底物的化疗药；对抗癌药物进行化学结构修饰，消除其p g p 底物的特征。2 ) 发现新的多药耐药性逆转剂，并与抗肿瘤药物合用，恢复多药耐药性细胞对 抗肿瘤药物的敏感性。3 ) 通过脂质载体运送抗癌药，改变药物进出细胞的途径。4 ) 运用单克 隆抗体、反义寡核苷酸( a m i s e n s eo l i g o n u c l e o t i d e ，a s o n ) 、核酶和s i r n a 等技术，在d n a 或r n a 水平抑制m d r 1 基因的表达。5 ) 运用一些细胞冈子逆转剂等。最新一项研究显示， 肿瘤血管生成抑制剂贝伐单抗( a v a s t i n ) 与f o l f o x 6 ( 5 f u + 甲酰四氢叶酸+ 奥沙利铂) 及 f o l f i r i ( 5 f u + 甲酰四氢叶酸+ 依立替康) 的联合用药治疗结直肠癌，原发肿瘤的存在并不 会增加穿孔和出血的危险性，应答率与试验期望相一致，可获得较高的转移灶切除率【6 叼。 对肿瘤细胞多药耐药性逆转剂的筛选主要通过查找多药耐药性细胞在有或无候选逆转剂 的情况卜对化疗药物的反应，以确定该药物作为逆转剂的可能性。鉴于活体内的多种因素可 影响药物的分布、代谢、清除、生物药效率、对宿主的潜在毒性等，体外筛选出的逆转剂运 用于临床的效果往往不佳。因此，针对多药耐药性的形成机制和p g p 表达的特点，寻找高效、 低毒的逆转剂仍是今后肿瘤学研究的重要课题。 砖南人学硕- ：学f 证论文 2 1 研究的目的和意义 第2 章引言 随着人民生活水平的不断提高，消费安全，卫生，营养黪“绿色”水产品己成为现代人的 重要需求。然而，目前环境污染，特别是水污染严重威胁着人类的健康，其中重金属( t o x i ch e a v y 燃t a l s ，t h m s ) 豹危害基盏严重。承体中的重金属以各种形态分布在水樵、生物体中，表现出 不同的毒性特征，其毒性危害与污染特点在于：天然水中，只要有微量浓度即可产生毒性 效应。微生物不仅不能降解重金属，相反地，某些重金属在微生物的作用f 可转化为毒性 更强的金属有梳纯合物。生物体铁环境中摄取的重金属，可经过食物链麓生物放大佟矮逐 级在较高的生物体内富集，如鱼体内蓄积t h m s 的浓度可比周围水环境高1 0 0 0 倍【6 7 郇】。重 金属可通过多种途径进入人体，不易撵出，逐渐积累，从面导致急、慢性疾病或产生远期危 害f 6 弘7 。 先前的研究结果显示，p g p 主要参与内、外源药物剐毒素的吸收、分布和排 l l ，对机体组 织和器窑行使防舞保护翡作翔。两苴毽有磷究表骥p _ g p 在熏金属离予的吸收、积累黍l 排演中 起重要作用。如哑砷酸盐处理可以诱导细胞中p 如p 的人奄袭达，它们能够以外排的方式降低 砷盐在细胞内的积累，从而对机体起到保护作耀。p g p 盘发现之日起，入们对其在人胂瘸 细胞多药耐药性中的作用作了大蕈研究，但到目前为之，这一蛋白的c 渊a 在斑马鱼中尚未克 隆得到，在斑马鱼中对有毒重金属排泄等功能的研究在国内外仍是空囱。因此，研究p g p 对 鱼体态有毒重金属离子酶转运馋耀，将骞助予揭示动物穗鲻的分子视钊秘辫毒桃理，筛选与 道金属疾瘸相关的药物，并为培育抗重众属积累的转p g j p 基闪鱼的养殖品系奠定理论和技术 基础。 2 2 研究的范围和内容 本研究撅综合利趔运耀现代基阏组学方法、分子警物学拳l 发育生物学研究手段，以模式生 物斑马鱼为材料，克隆出p - & p 基因并在离体条件下进行功能分析，预利用细胞培养技术和转 基冈技术，得到只基因对裔毒重金属排泄功能的相关数据。 本试验在藏入研究昀基础上，欲模式生物斑马惫为试材，主要进行了以下凡顼z 作： 1 克隆p g p 基因的全长c d n a 。 2 。制餐探针进行整体原侮杂交，研究p 6 罗列燃a 的时黧表达。 3 构建表达载体p r c 忿m v 2 一p g p ；p t 2 s v 4 0 p g p n a g ；p t 2 细m r e d 5 m t l - p p - f l a g 。 4 在细胞水平转染p r c c m v 2 p g p ，后用重金属处理，研究重金属对转染了p g | p 基因的 细貔豌影响。 5 将p t 2 ，s v 4 0 p g p f l a g 和p t 2 ，m m r e d 5 m t l p g p f i a g 质粒体外注射斑马鱼胚胎，通过筛 选褥到转基因鱼。簌用重金属诱导只钟表达，以检测该基闪对重金属的作用。 1 2 第3 章在斑马鱼中克隆出新基因尸g p 第3 章在斑马鱼中克隆出新基因尸- 卯 3 1 材料和方法 3 1 1 数据库及分析软件 1 核酸数据库为美国国立生物技术信息中心( n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o i o g y 1 1 1 f o m 诅t i o n ，n c b i ) g e n b a n k 数据库( b 鲤；丛塑型：堕璺丛：坠地：塾鱼：g q 迦丛凼垒墨曼也亟曼茎：h