（发酵工程专业论文）利用微生物生产胆固醇氧化酶的研究.pdf

利用微生物生产胆固醇摹化碍的研究 利用微生物生产胆固醇氧化酶的研究 摘要 胆固醇氧化酶是胆固醇代谢的关键酶之一，它催化胆固醇氧化及 异构化反应，生成胆甾一4 - 烯一3 酮和过氧化氢。胆固醇氧化酶被广泛 应用于临床诊断、制药工业、食品加工及生物农药等方面，具有广泛 的应用前景。 本研究通过紫外+ li c l 、紫外+ 光敏试剂处理类芽孢杆菌x 5 3 4 ， 筛选出一株酶活较高的诱变菌株x u i i i o ，酶活为2 2 1 2 0u l 1 ，比出 发菌株提高了近2 5 倍。 此外对发酵工艺进行了改变，首先对突变株产酶条件进行了优 化，确定了合适的产酶培养基及其组成，并对发酵温度、溶氧、p h 等进行优化。在温度3 0 。c ，p h 值为8 ，转速2 0 0 r m in ，摇瓶发酵5 0 h ， 发酵液酶活达到2 7 5 4 1u l - 1 。 通过旋转蒸发浓缩、蔗糖浓缩、d e a e 离子交换层析、s e p h a d e x g - - 7 5 凝胶柱层析对该酶进行纯化，纯化后的浓缩酶液的酶活力达到 6 8 3 u r a g 。通过s d s - p a g e 电泳，测定酶的分子量为5 8 k d a 以胆固醇 为底物的米氏常数3 3x to m ot l ，最大反应速度为4 6 0 m m o l ( l m i n ) ，显示了与底物良好的亲和性，从薄板层析结果看， 转化产物单一，为有药用价值的胆甾一4 烯- 3 - 酮。 比较多种固定化酶的方法，最终确定固定化酶的材料为 利用微生物生产胆同1 w j r 1 , , - f e , b 1 1 h g z m - , q 艺 p v a + h 。b 0 3 + n a ：c o 。并确定固定化酶最适温度为6 0 4 c ，最适p h 为7 0 ， 其热稳定性及p h 稳定性相对于游离酶有了很大程度的提高，通过电 镜扫描观察固定化内部为小而密的多孔网状结构，使酶液很好的包埋 在固定化材料内。通过固定化酶对牛奶中胆固醇的转化率试验，可知 最高转化率为7 5 6 4 。 关键词：胆固醇氧化酶诱变育种分离纯化固定化酶 利用截生物生产胆固醇车化磅的研晚 s t u d yo np r o d u c t i o no f c h o l e s t e r o lo d a s eb y m i c r o o r g a n i s m a b s t r a c t c h o l e s t e r o lo x y d a s e ( e c1 13 0 9c 痂d y z e st h eo x i d a t i o no fc h o l e s t e r o lt o c h o l e s t - 4 - - e n - 3 - o n ew i t ht h er o d b e t i o no fo x y g e nt ol r y d r o g e ap e r o x i d e t h e c h o k 赡t o lo x y d a s ei sw i d e l ya p p l i e dt od i 楚吣、d r u g sm a n u f a c a w ei l 】血l s l 巧、 f o o di 1 1 m l s 时、b i o l o g i c a l a g r i c u l t u r a la n ds oo n , i ti r e st h ew i d e s p r e a da p p l i c a t i o n p d 喊 t h i sr e s e a r c hl l ：m u g hu v + l i c i , u v + 8 - m o p 弘跫s s j i n gp a e n i b a c i l l u ss p x 5 3 4 ，t h e nx u m - 1 0 s t r a i nw d so b t a h e d ，a l z y l l l ea c t i v i t yi s2 212 2 0u l 1 ，遗 e l l z y m ea c t i v i t yh i g h2 5t h n e sm 锄p l 圮n t s 臼= a i n i na d d i t i o n , t h ec l ow a sq 垴m 切。d ，a n df e r m e n t a t i o nt e c h n o l o g yw a s i m p r o v e d a f t e r5 0 h sf e r m e n t a t i o ni ns h a k e f l a s ku n d e rt h ec o n d i t i o no f 3 0 o ca n dt h ei n i t i a lp h 8 0 ，r o t a t i o ns p e e d18 0 r r a i n , t h e6 n z y n l ea c t i v i t yi nt h e m e d i u mr e a c h e dt o2 7 5 4 1u l 1 w e p u r i f i e dt h ec h o l e s t e r o lo x y d a s e6 l l z y l l l eb yc i r e u m r o t a t ee v a p o r a t i o n , s u c r o s ec o n c e n t r a t i o n , d e a e - - c e l l u l o s ei o ne x c h a n g e , s e p h a d e xg 一7 5 g e lf i l t r a t i o n t h ea c t i v i t yo ft h ee l 峰y i n ew a si m p r o v e dt o6 8 3 u r n g t h e m o l e c u l a rm a s se s t i m a t e db ys d s - p a g ew a s5 8k d a i t sk i n e t i cp a r a m e t e r 莉用翻匕毛勿囊j 胆固翻搴1 七嗣融9 习陵 k mi s3 3 x 1 0 s m o l la n dv l 嗽, i s4 6 0m m 0 肌m 蛐f o rc h o l e s t e r 0 1 t h e p u r i f i e dp l x x l u c tw 3 5i d e n t i f i e da sc h o l e s t - 4 - 蜘- 3 - o n ew i t ht h i ns t e e lp l a t e c h r o m a t o g r a p h i ca n a l y s i s c o m p a r e dw i t ht h em a n yk i n d so ff i x e de n z y m e sm e t h o d , f i n a l l y d e t e r m i n e dt h ef i x e df f l l z y m et h em a t e r i a li sp v a + h 3 b o b + n a 2 c o a n dt h e e t 洲o n f i x e d 朗筘o p t i m u mt e m p e r a t u r ei s6 0 ( 2 ，o p t i i n u mp hi s7 o i t st h e r m o s t a b i l i t ya n dt h ep h s t a b i l i t yr e l a t i v e a n df r e ee i 岬et oh a v et h e v e r yg r e a td e g r e ee n h a n c e m e n t , p a s s e ds e m ss c a n n i n g , t h e r em - em a n ys m a l l a n dt h ed e n s ep o r o u sn e t 、) v o r ks t m c m l ei nt h ei m m o b i l i z a t e de n z y m e i n t e r i o r ， s ol h ef r e ee n z y m ec 觚b ev e r yg o o de m b e d d e di nt h ei m m o b i l i z a t e dm a t e r i a l t h r o u g ht h ec o n v e r s i o n r a t ee x p e r i m e n to fc h o l e s t e r o l i nm i l k b y i m m o b i l i z a t e de n z y m e ，w ek n o wt h em a x i m u mc o n v e r s i o nr a t ei s 7 5 6 4 k e yw o r l d ：c h o l e s t e r o lo x i d a s e ；m u t a t i o na n d b r e e d i n g ；p u r i f i c a t i o n ； 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文 的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也不包含 本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集 体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名：王纹台 学位论文使用授权说明 z o 、) 7 年6 月7 - of i 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，e 1 1 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 僦黻茹布揪布口即时发布阿解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论文作者签名：工伏盒 导师签名： 膨7 年石月习日 耳9 用微生物生产胆固囊簟化霸 的研究 1 1 胆固醇与人体健康 第一章前言 1 1 ：l 胆固醇的生理和代谢 胆固醇又称胆甾醇，是一种环戊烷多氢菲的衍生物。早在1 8 世纪人们已从胆 石中发现了胆固醇，1 8 1 6 年化学家本歇尔将这种具脂类性质的物质命名为胆固 醇。胆固醇广泛存在于动物体内，尤以脑及神经组织中最为丰富，在肾、脾、皮 肤、肝和胆汁中含量也高，在人体内，胆固醇主要分布在细胞膜上和血浆中。胆 固醇是动物组织细胞所不可缺少的重要物质，它不仅参与形成细胞膜，而且是合 成胆汁酸，维生素d 以及甾体激素的原料。其溶解性与脂肪类似，不溶于水，易 溶于乙醚、氯仿等溶剂。胆固醇除了可以调节胞膜的流动性和通透性，还具有 调节催产素受体和缩胆囊素受体的生理功能【1 2 】。因胆固醇同时含有亲水基团和 疏水基团，在血浆脂蛋白的微胶粒结构中，胆固醇与磷脂及蛋白质一起位于或接 近水一脂界面，可以帮助那些依靠低密度脂蛋白运输的非极性物质的溶解，此外， 它本身也是被血浆脂蛋白运送的一种脂类，在运送过程中，大部分胆固醇生成胆 固醇酯，被运送的胆固醇主要以胆固醇酯的形式存在。 尽管胆固醇在体内有着广泛的生理作用，但当其过量时便会导致高胆固醇血 症，对机体产生不利的影响。现代研究已发现，动脉粥样硬化、静脉血栓形成、 胆石症与高胆固醇血症有密切的相关性。胆固醇的代谢过程或输送过程不正常， 往往与动脉粥样硬化症的发展有关，而动脉粥样硬化是动脉壁变硬的一种形式， 能引起心肌梗塞、中风、动脉瘤或坏疽。此外西方国家居民中极普遍发生的胆石 症，也主要由胆固醇形成的【3 】。在动脉硬化的研究中发现，堆积在动脉壁的脂类 以胆固醇酯最多，这种堆积阻碍血液流量，与伤害心脏以及大脑的过程密切相关。 而且血浆胆固醇水平越高，越会加快这种发病过程，而降低血浆胆固醇浓度是减 利用做生物置j 胆固l 重曩1 弋翻 的习阳电 缓动脉粥样硬化的措施之一i 血浆胆固醇水平每降低百分之一，患冠心病的可能 性减少百分之二。一般认为当体内血清胆固醇含量超过2 0 0 r a g 1 0 0 m l 时，即应 引起医学方面的注意【4 】。 人体内的胆固醇有两个来源，一部分约4 0 从日常食物尤其是高胆固醇食物 中吸收而来( 外源性) ；另一部分约6 0 由自身肝脏和小肠在相关酶的促进下合 成( 内源性) 。在正常情况下，当膳食中摄入的胆固醇过多时，自身合成的就减 少，当膳食中胆固醇过低时，自身合成的就多些，如此通过相互调节以维持动态 平衡。但是，当体内的脂类代谢发生异常，或者胆固醇摄入量超过机体的调节能 力时，就会使血浆胆固醇升高。 日常含胆固醇较多的食物包括蛋类、肉类、动物内脏、贝壳类、软体类等， 具体见下表： 表1 - 1 食物中胆固醇的含量 根据美国心血管疾病研究会和欧洲动脉硬化疾病研究会的推荐，一般正常 人胆固醇摄入量不得高于3 0 0 n 叫天翻。而实际上，平均每人每天从肉类食物至少 2 利用截童翻勿生产胆固醇蕈化翻嘈9 习院 摄入3 0 0 - - 4 0 0 r a g t q 。从8 0 年代以来，我国人民的生活水平不断提高，膳食结构 发生显著变化，肉类、油脂、乳制品的摄取量急剧增加，与此相关的各类疾病的 发病率上升较快。因此，优化膳食结构，将膳食中的胆固醇减少到适当水平，在 预防医学上也具有很重要意义口显然，这也推动了低胆固醇类保健食品的研究和 开发。 1 2 胆固醇氧化酶的研究进展 胆固醇是人体内不可缺少的有机组成成分，血液中胆固醇浓度是重要的生 理指标，反映了人体的健康状况，而食物中胆固醇也会对人的健康构成很大影 响。所以，为了控制血液中胆固醇的浓度和食物中胆固醇的含量，胆固醇浓度 或含量的测定就显得尤为重要。正是由于在微生物中发现了胆固醇氧化酶，才 有了今天一系列的快速、简便以及自动化酶法测定胆固醇的方法【7 。随着研究 的不断深入，发现了胆固醇氧化酶的作用和功能越来越重要了。 1 z1 胆固醇氧化酶的分类 胆固醇氧化酶( e c1 1 3 6 ) 在酶学分类地位中属于氧化还原酶类。底物中发 生氧化的基团为c 3 碳原子上1 3 羟基( 删0 h ) ，羟基氧化脱氢后产生的氢原子经 某种方式( 如f a d ) 传递给受体一分子氧，形成过氧化氢( h 2 0 ：) 。同时，胆甾一5 烯 - 3 - 酮异构化形成胆甾- 4 - 烯- 3 - 酮尽管胆固醇氧化酶具有较广的底物范围，但是 底物必须含有31 3 一羟基基团。 胆固醇氧化酶是单体酶，只有一条多肽链，分子在5 0 0 0 0 - 6 0 0 0 0 道尔顿之间， 根据酶在细胞内的分布，可将胆固醇氧化酶分为三种类型：胞外酶、膜结合酶及 胞内酶，前二者同属于分泌型，而且分泌过程通过信号肽机制，它们的区别是膜 结合酶具有一个疏水锚定区域，使酶镶嵌在细胞膜中，在同一个细胞中往往三种 形式的酶共存，而且由同一个结构基因编码，但是有量上的区别，表现形式也不 相同；根据酶的产生是否能被底物诱导，胆固醇氧化酶又可分为非诱导型和诱导 型两种形式，诱导型只有在添加底物情况下才产生酶，而非诱导型对底物的没有 要求；根据辅助因子的有无，可将目前所有分离到的微生物胆固醇氧化酶分为 两类，一类是缺乏f a d 或其它辅助因子，另一类是含f a d 辅因子的胆固醇氧化酶， r l f 掌| 士# 喧性- 克制用j 轴生，咀j t - 的爿：竞 属于f a d 依赖型的黄紊虽白，目前绝大多数的胆固醇氧化酶属于这一类 目前发现的各种微生物来源的胆固醇氧化酶均为单体，以f a d 为辅基”，催 化的胆固醇氧化反应第一步是胆固醇的氧化t 第二步是中间产物的异构化，因而 在胆固醇氧化酶分子中，就存在三个活性中心：底物结合活性中心，决定酶与底 物的亲和能力；氧化活性中心，催化胆固醇的氧化；异构化活性中心，催化中间 产物5 一胆甾烯一3 一酮的异构化。 m 蛄 台缸点 哳， j 环 围i - i 胆固醇氧化酶蛄构示蠢圈 f i g 卜ls k e t c h 吐po ft h ec l l o l e s t e r o lo x i d a s e 图卜1 中。环“”是位于n 一端的一个在蛋白质二级结构，它决定了底物与酶的 结合，为底物结合活性中心；胆同醇氧化醇的氧化和异构化催化活性中心空间上 主要由c 一端氨基酸残基组成，第4 4 7 位的组氨酸( h i s 卅) 既参与氧化反应，又参 与异构化反应，是活性中心的一个关键氨基酸，另有实验表明g l u 鲫只参与胆固 醇的氧化反应，而参与中间产物异构化反应，应为氧化括性中心一个关键氨基酸 n 1 】 23 研究现状 国外方面： 从1 9 4 8 年t u r f i t t g 驴州。首次发现红平诺卡氏茁产生胆固醇氧化酶阱来，已 经报道丁有多种微生物能产生胆固醇氧化酶，主要包括诺卡氏菌( n o c a r d i a ) 、链 利用微生物生产胆固醇氧化晦的研究 霉菌属( s t r e p t o m y c e s ) 、短杆菌属( b r e v i b a c t e r i u m ) 、假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 、 裂殖菌属( s c h i z o p h y l l u m ) 、链轮丝菌属( s t r e p t o v e r t i c i l l i u m ) 、红球菌属 ( r h o d o c o c c u s ) 等，其中链霉菌属中产生胆固醇氧化酶的菌种最多包括浅紫链霉 菌( s v i o l a s c e n s ) 、肉桂链霉菌( s c i n n a m o m e u s ) 、灰肉色链霉gg r i 蝴) 、 吸水链霉菌( s h y g r o s c o p i c u s ) 及一些未定名种有关真核生物及高等动植物来 源的胆固醇氧化酶的分离、纯化的报道则极少。 1 9 7 3 年，r i c h m o n d n 司首次在以胆固醇为唯一碳源的培养基上培养了诺卡氏 菌n c i b l 0 5 5 4 ，从细胞中分离得胆固醇氧化酶，并建立了用此酶作为测定血浆中 胆固醇的酶学方法。杆菌只能在以胆固醇为唯一碳源的培养基上产酶。i n o u y e 町 等从s t r e p t o m y c e sv i l l a c c e n s 的发酵液中分离到胆固醇氧化酶；u 霄a j i m a 等从 土壤中分离到产胞外胆固醇氧化酶的微生物，u w j i m a n 刀在以葡萄糖为唯一碳源， 另外胆固醇作诱导剂利用短杆菌产生胞外胆固醇氧化酶，并且从培养液中分离到 胆固醇的氧化产物胆甾4 一嘲 3 酮，未分离到其它甾体类中间产物。这些都 是以胆固醇作为诱导剂诱导产酶的。l i u w h 1 8 3 用u v 诱变简单节杆菌，筛选到胆 固醇氧化酶组成型突变株，并将该菌进行固定产酶研究和在有机相中反应来制备 胆甾3 酮。n o m a r a n 蚰、p b r i g i d i 嘲等将链霉菌与短杆菌胆固醇氧化 酶基因克隆到大肠杆菌上，得到高表达胞内胆固醇氧化酶。y o s h i k a t s u m u r o o k a 等将链霉菌的胆固醇氧化酶基因克隆至s t r e p t o m y c e si i v i d a n s 中，获得比原产 酶菌株高数倍的胞外胆圃醇氧化酶克隆子乜1 】。l i uw e n - h s i u n g 等将节杆菌 a r t h r o b a c t e rs i m p l e x 的不同突变株进行原生质体融合，筛选出产酶能力比亲 株高2 0 一- 4 0 的融合子嘲。 国内方面： 国内研究胆固醇氧化酶开始于八十年代中期，法幼华、苏起恒等分离到节杆 菌菌产胞内胆固醇氧化酶，并用于临床分析嘲。上海工业微生物研究所的胡军报 导以桔红诺卡氏菌发酵生产胆固醇氧化酶洲，1 9 9 9 年，江南大学从土壤中筛选 到的菌株dgc 一007 ，并进行诱变处理，酶学性质及应用方面的研究，为进 一步工业化生产打下基础乜嘲1 。2 0 0 5 年中国农业大学对马红球菌产胆固醇氧化酶 也作了大量的研究，虽然为胞内酶，但产量较高嘲。四川大学也正在对产胆固醇 氧化酶进行优化嘲。 5 ，酉大学阁e 士孽睃论文 利用做生物生产胆固醇摹 t 瞎的研究 1 乞4 胆固醇氧化酶的应用 微生物来源的酶在很多领域都有广泛的用途。许多工业用酶如蛋白酶、淀粉 酶等的研究较为深入。胆固醇氧化酶的研究则起步较晚，因而具有较大的理论研 究和实际应用的潜力。目前胆固醇氧化酶在日本、美国等国家已进行商品化生产， 它的应用范围从最初的临床诊断扩展到制药工业、生物有机化学和分子生物学等 领域 1 2 4 1 临床诊断 胆固醇氧化酶最早和最广泛的应用是在临床诊断方面，血清中胆固醇水平增 高是动脉粥样硬化及心脏疾病的主要原因，因此测定血清胆固醇含量是临床诊断 的一个重要指标，1 9 7 3 年f l e g g 首先用红平诺卡氏菌胆固醇氧化酶氧化血清胆固 醇，产生胆甾一4 - 烯- 3 - 酮，由于羰基在2 4 0 n m 波长处有特征吸收峰，从而测定了 血清中胆固醇的总含量。由于血清中胆固醇多是以胆固醇酯的形式存在，因此在 进行酶法分析之前，血清需要经过皂化处理以产生胆固醇分子。在胆固醇酯酶和 过氧化物酶成功分离纯化之后，血清胆固醇含量测定方法随之改进口u 。目前血清 胆固醇测定所用试剂已制成试剂盒在同一反应体系中同时加入三种酶时，胆固 醇酯酶先将胆固醇酯水解产生游离胆固醇，然后由胆固醇氧化酶催化胆固醇氧化 并产生h 2 0 。，h ：0 ：在过氧化物酶作用下与4 一氨基安替比林及苯酚发生反应，产生吸 收波长为5 0 0 h m 的红色醌亚胺，从而通过比色法间接地测定胆固醇含量。与化学 法相比，这种方法准确、简单、快速，因而很快在临床上推广开来。经过二十多 年的发展，胆固醇氧化酶在临床诊断及其他方面也得到应用。例如利用固定化的 胆固醇氧化酶制成的高灵敏度酶电极，可应用于全血及低密度脂蛋白的胆固醇含 量测定嘲 1 2 4 2 食品加工 胆固醇氧化酶可作用于食品材料中的胆固醇，从而降低食品的胆固醇含量， 有利于人类的身体健康。由于奶制品在日常生活中的重要性，人们试图对它从多 方面进行质最提高，乳酸杆菌是人体正常菌群，能够消化乳糖和抵抗肠道病原菌， s o m k u t i 将胆固醇氧化酶基因c h o a 转化进入奶酪乳酸杆菌，试图使乳酸杆菌具备 氧化胆固醇的能力，c h o a 能在转化子中稳定表达嘲嗜热链球菌是奶制品发酵所 必需的微生物，s o m k u t i 将c h o a 连接到由嗜热链球菌内源质粒衍生的表达载体上， 6 利用做生物生产胆固醇氧化酶的研究 转化嗜热链球菌后，c h o a 在转化子中能以胞内酶形式表达嘲。所有这些工程菌株 都有希望用于奶制品生产和提高食品质最，同时又能简化工艺程序。 1 2 4 3 制药工业 胆固醇氧化酶在制药工业中主要用于激素生产方面，比如胆固醇氧化酶催化 孕烯醇酮和5 一雄烯一3b ，1 7b 一二醇氧化，分别产生孕酮( 黄体酮) 和睾酮，这两 种激素是人体中重要的性激素，孕酮还是许多固醇类激素的前身物质。由孕酮产 生的脱氢可的松、氧化泼尼松是抗过敏药物和抗风湿病药物瞬】 1 2 4 4 工具酶 胆固酵氧化酶在生物领域的应用主要是用作工具酶，用于探测3b 一羟固醇的 空间结构以及作为细胞膜或其它结构胆圃醇的探针。比如，胆固醇氧化酶作为不 可渗透膜的探针，有选择地作用于线粒体外膜的胆固醇，从而研究肾上腺细胞线 粒体的胆固醇库的结构，以便于深入研究肾上腺皮质激素的体内合成鼬跏。通过 胆固醇氧化酶作用，还可确定生物膜胆固醇的分布以及胆固醇与其它膜脂的相互 作用。 i 2 4 5 潜在应用 1 9 9 3 年p u r c e l l 从链霉菌a 1 9 2 4 9 发酵液中发现胆固醇氧化酶c h o m 是棉铃象鼻 虫致死原因，纯化的胆固醇氧化酶半致死浓度为2 0 9i ig m 1 链霉菌胆固醇氧化 酶能令棉铃象鼻虫致死的特性，是苏云金杆菌伴胞晶体蛋白所不具备的，胆固醇 氧化酶对其它昆虫的作用也可与苏云金杆菌伴胞晶体蛋白相媲美。组织病理学研 究表明，胆固醇氧化酶使昆虫中肠上皮细胞破裂而导致昆虫的死亡嗍。g h o s h r o y 利用染料渗漏实验证明胆固醇氧化酶与膜的结合以及膜胆固醇进入酶活性部位 的过程并不能使双层脂膜破裂，而是氧化所生产的胆绺一4 一烯一3 一酮使膜的渗透性 增加，使细胞质外漏，从而导致昆虫死亡。其杀虫机理与苏云金杆菌伴胞晶体蛋 白的不同，因而具有成为新的杀虫剂的潜力，同时也为转基因植物提供了新抗虫 基因。c o r b i n 将胆固醇氧化酶基因c h o m 改造后转入烟草细胞中，并获得表达 m u r o o k a 等将胆固醇氧化酶基因c h o a 整合到烟草细胞染色体上，并在转化细胞中 表达咖。由于棉蕾中象鼻虫用常规杀虫剂特别难控制，因此在棉花植株中表达胆 固醇氧化酶基因引起人们极大兴趣，它为控制棉铃象鼻虫提供了潜在的强有力手 段。 7 利用截生物生产胆固醇氧化酶的研究 胆固醇氧化酶另一个潜在应用是作为治疗高血胆固醇的药品，其依据出于以 下几个实验，给患高血胆固醇病的豚鼠和兔子静脉注射胆固醇氧化酶，能使血液 中胆固醇含量显著下降，来源于高血胆固醇动物的脾、肝、肾细胞匀浆对胆固醇 氧化酶的氧化敏感，而来自正常动物的组织细胞匀浆则对胆固醇氧化酶具有抗性 删，胆固醇氧化酶作药物的应用还需要更深入的研究。 1 3 本论文研究的内容 本课题的所用的菌株为上一届研究生赵芳从腐败的鸡蛋黄中筛选出来的，并 对该菌株产酶的条件，酶的提取及酶学性质进行了初步研究。原菌株主要产胞内 酶，并伴有少量胞外酶产生，由于胞内酶的提取比较困难，从实际应用的角度出 发，要求通过诱变育种的方法，有意识的选育胞外酶产量高的菌株。故本论文在 上届研究基础上，着重提高胞外酶的产量，并对酶的纯化和固定化进行研究，主 要目标是： 1 通过物理、化学试剂诱变及复合诱变使胞外胆固醇氧化酶的活性提高2 倍左 右； 2 对发酵培养基和发酵条件进行优化，找到产酶的最适培养基组成和最适发酵 条件； 3 胆固醇氧化酶的初步纯化及部分酶学性质研究； 4 胆固醇氧化酶固定化材料的选择及固定化酶性质的研究。 8 翻用徽生物生产胆同醇曩代酶的研究 第二章胆固醇氧化酶高产菌株的选育 2 1 材料与方法 2 1 1 材料 2 - 1 1 1 出发西株 菌株p a e n i b a c i l l u ss px 5 3 4由广西大学食品与发酵工程研究所提供 2 1 1 2 主要试剂和药品 胆固醇国药集团化学试剂有限公司 a r 4 氨基安替比林华东师范大学化工厂 a r 辣根过氧化物酶华美公司2 5 0 u r a g 过氧化氢宜兴第二化学试剂厂a r t d t o n x - 10 0 s i g m a a r m g s 0 4 7 h 2 0 上海试剂四厂 a r n a c i洛阳市化学试剂厂a r n h 小0 3广东台山化工厂 a r k i - 1 2 p 0 4广东汕头市西陇化学厂 a r m n s 0 4 7 1 - 1 2 0天津市耀华化工厂 a r 琼脂奥博星生物技术责任有限公司 a r 牛肉膏北京奥博星生物技术责任有限公司 a r 蛋白胨北京奥博星生物技术责任有限公司 a r 苯酚上海试剂一厂综合经营公司 a r 吐温8 0天津市大茂化学试剂厂 a r 8 - m e t h o x y p s o r a l e n ( 8 - m o p )s i g i n a a r 土豆市售 2 1 1 3 主要仪器与设备 ( 1 ) h y g - 2 型回转式恒温调速摇床柜上海新星自动化设备厂 9 利用截生物生产胆圈醇曩化壕的研究 ( 2 ) p y x - d h - 4 0 5 0 隔水式电热恒温培育箱上海跃进医疗器械厂 ( 3 ) h q l3 0 0 柜式恒温摇床中科院武汉科学仪器厂 ( 4 ) m - 0 3 自动控制压力蒸汽灭菌器广州市豪尔生医疗设备有限公司 ( 5 ) w - c j - i f 超净工作台苏净集团安泰公司 ( 6 ) 7 8 1 磁力加热搅拌器江苏省金坛市医疗仪器厂 ( 7 ) u v - 1 6 0 1 紫外分光光度计日本s h i m a d z u 公司 ( 8 ) m o d e lj 2 - 2 1 冷冻离心机 b e c k m a n 公司 ( 9 ) 生物显微镜日本o l y m u p s 公司 ( 1 0 ) 3 2 0 p am e t e r m e t t l e rt o l e d ( 1 1 ) 分析天平瑞士m e t t l e r - t o l e d o ( 1 2 )电热恒温水浴锅上海器械工厂 ( 13 )血球计数板上海医科大学科宇科技开发公司 z1 1 4 培养基 ( 1 ) 斜面培养基( ) ：葡萄糖2 ，牛肉膏1 5 ，蛋白胨l ，n a c l0 5 ，琼脂 2 ( 2 ) 种子培养基( ) ：不加琼脂，其它同斜面培养基 ( 3 ) 发酵培养基( ) ：2 0 土豆汁，葡萄糖1 5 ，胆固醇0 0 4 ，吐温- 8 00 1 ， n a c l0 5 ，础：p o l0 0 1 6 ， l g s q 7 h 2 00 0 2 ，骱s o h z o0 0 2 ，p i i 值调到7 0 ( 4 ) 筛选培养基( ) ：胆固醇2 0 ，n h 4 n 0 30 3 ，n a c l0 5 ，l 吐p 0 0 0 1 6 ，m g s 0 4 7 h 如0 0 2 ，s 0 4 a , o0 0 2 ，琼脂2 2 1 2 方法 2 1 2 1 菌种的活化 将保存菌种转移到斜面培养基上，3 0 培养2 4 h ，然后从斜面挑一环菌落接 于种子培养基，3 0 ，2 0 0 r m i n ，摇床培养1 2 h 至对数生长期。 2 1 2 2 菌悬液的制备 取对数期的培养液1 0 毫升，离心( 6 0 0 0 r m i n , l o m i a ) 收集菌体。将菌体用 1 0 毫升灭菌生理盐水洗涤离心2 次，之后将菌体打散悬浮于灭菌生理盐水中， 1 0 利用碱生物生产胆圆醇氛化砖的研究 调整菌浓为1 0 8 个，m i 。 2 1 2 3 酶活的测定方法 0 8 2 6 i im o l l 的胆固醇异丙醇溶液1 0 0 l jl ，t r i t o n x - 1 0 0 为1 0 0 i il ， 0 i m o l l 磷酸钾缓冲液( p h 7 5 ) i m l ，3 t o o l l 的4 一氨基安替比林1 m l ，1 8 t o o l l 苯酚i m l ，7 0 0 0 u l 过氧化物酶2 0 0l ll ，将上述组分，充分混合均匀，混合液于 3 7 ( 2 保温3 r a i n 后加入粗酶液，测定o d 湖吸光度。在上述条件下，每分钟内催化 1i lm o l 胆固醇氧化为胆甾一4 一烯一3 一酮所需要的酶量为1 个酶活单位m 3 z1 2 4 肇外+ l i c i 复合诱变 开启紫外灯预热1 5 分钟，使光波稳定，调整紫夕 光管与培养皿的距离为 3 0 c m ，将5 m l 的菌体悬浮液分别加入到巾5 0 1 的培养皿中，置于诱变箱中，开 启磁力搅拌器，打开皿盖，进行诱变处理。照射时间分别为1 5 ，3 0 ，4 5 帮，6 0 ，7 5 ，9 0 ”，将u v 照射后的菌悬液涂布在含0 3 的l i c i 的培养基中，使菌 株生长过程中进行诱变。 2 1 2 5 肇椭敏试剂( 8 - 1 印) 复合诱变 以紫外+ l i c i 复合诱变后筛选到的菌株为光敏试剂诱变的出发菌株。按1 0 的体积量加浓度为1 0 的8 - m o p 光敏试剂到摇瓶菌悬液中，在l o o r m i n 的摇床 上黑暗培养l 小时，然后分别吸取5 毫升加入到由5 0 衄的平底平板中，在预热 好的黑光灯下分别照射3 0 ，、6 0 。、9 0 一、1 2 0 一、1 5 0 、1 8 0 ，、2 4 0 一然后 分别取照射液进行稀释涂布到平板，3 0 恒温培养箱中培养。 2 1 2 6 筛选方法 初筛：在筛选平板上挑选菌落较大或是菌落形态与原菌形态不同或是有透明 圈的菌株做为初筛菌株斜面保存。 复筛：将经初筛选得的斜面菌株上摇瓶进行发酵，以确定发酵产酶较高的诱 变菌株。 2 1 2 7 菌株稳定性试验 将复筛得到的高产菌株分别传代进行发酵稳定性的试验。 利用截生物生产胆固醇氧化穗的研究 2 2 结果与讨论 2 2 1 选育谱系 出友菌株 i 自然分离2 - - 3 次 ， 自然选育的菌株一保存 上 紫外+ l i c i 复合诱交 i 初筛挑选1 0 0 株 复筛 土 稳定高产菌株挑选6 株保存 土 s - - m o p 诱变处理 i 初筛挑选1 0 0 株 ， 复筛 上 稳定高产菌株_ 挑选6 株保存 土 保藏 物理化学诱变是不定向的，但筛选的目的是定向的，且突变可以被稳定地 遗传，高产菌株的获得是建立在一定数量和规模的基础上的。本试验除了用紫外 线以外，还采用了化学试剂l i c i 、光敏试剂8 _ 嘲o p 。8 _ 咄i o p 是一种对细胞 核酸有强烈作用的化学试剂，其操作简单方便，对操作人员较安全，诱变效果理 摁的化学诱蛮翱i 。 2 2 2 蘩外+ l i c i 复合诱变致死率曲线 紫外+ l i c i 复合诱变致死率试验结果如图2 1 所示： 1 2 翻用徽生物生产胆同醇氧化膏的研究 01 5 3 0 4 56 0 59 0 1 0 5 t i m e ( s ) 图2 - 1 茵体x 5 3 4 紫外诱变剂量效应曲线 f i g u r e2 - lt h ee f f e c tc t l l 一eo ft n r = u t a g e n e s i sd o s a g e x 5 3 4 从图2 - 1 可以看出，在诱变时间达到9 0 秒时，菌体的致死率可以达到9 7 。 由于菌株x 5 3 4 是原始菌，并来经过多次诱变，根据经验，试验中应选取致死率 较大的剂量，故确定9 0 秒为诱变剂量，对x 5 3 4 菌株进行诱变。 乏z3 譬外+ l i c i 复合诱变试验结果 紫外+ l i c l 复合诱变试验结果，如表2 - 1 所示： 表2 - i 紫9 k + l i c l 袭合诱变试验结果 倍。 突变菌株的酶活最高可以达到1 3 5 1 3u l - ，比出发菌株x 5 3 4 提高了1 5 2 iz4 蘩夕h 匕敏试剂复合诱变致死率曲线 以菌株x u l 4 为出发菌株，采用紫外+ 光敏试剂复合诱变，菌体的致死率曲线 如图2 2 所示： 趵 如 约 。 翻用饿生锄生产胆围喀曩化晦的研究 03 06 09 01 2 01 5 01 8 02 1 0 t i m e ( s ) 图2 - 2 茵体】【i 1 4 紫外+ 光敏试剂复合诱变致死率曲线 f i g u r e2 - 2t h ee f f e c tc u l - v eo f8 - - w pu m t a g e n e s i sd o s a g eo nx u l 4 从图2 - 2 可以看出，在紫外+ 光敏试剂诱变时间达到9 0 秒时，菌体的致死率 可以达到7 9 。由于菌株x u l 4 是经紫外线与l i c l 复合诱变过的菌株，根据经 验，试验中应选取致死率在7 0 8 0 的诱变剂量或更低剂量诱变效果好，故选 取9 0 s 为本试验的诱变剂量。 2 2 5 蘩，卜+ 光敏试剂复合诱变结果 紫外+ 光敏试剂的复合诱变试验结果，如表2 _ 2 所示： 表2 - 2 紫外+ 光敏试剂的复合诱变试验结果 最终获得高产突变株x u m i o ，酶活2 2 1 2 0u l - 1 ，比出发菌株x u l 4 的酶活提 高1 6 4 倍。 2 2 6 遗传稳定性试验 从表2 - 2 中结果得到诱变菌株x u m i o 的酶活力最高，分析传代次数对高产突 变株x u m i o 产酶的影响。如图2 - 3 ，每隔1 0 天传代一次，共传了5 代，各代胆 固醇氧化酶的活性差异不大，说明该菌株遗传较稳定，可以作为下一步研究菌株 的来源。 1 4 们o 射用曲生，曩摹| 化啦l 崭竞 2 5 0 ：2 0 0 i1 5 0 ：i o o 嚣。 0 传代冼教 圈2 - 3 茸棒x 叫1 0 遗侍穗定性蛄果 f 啦4t h e g e n e t i cs t a b i l j t y o f t h e x u m i o 227 纲舶捧奄及曹蔫搭盎麓襄 在大批量的筛选工作中，我们发现产胆固醇氧化酶较高的菌株一般有队下 特点：正突变株比出发菌株曹落稍大，为圆形，中间拱起，乳白色，不透明，表 面光滑，菌苔边缘较整齐规则，菌落显示较湿。而负突变株多较小，形状扁平， 白色，半透明，菌落边缘不规则，菌落显示较干生长缓慢。 显撤镜观察细胞呈杆状，革兰氏染色呈阴性，具有运动性，亲株和正变异株 在显微镜下没有明显差别。 。 参 叫 。、二、忡_ ! 田2 - 4 谤圭茵株的茁落特征 f i 啦4 c h i c t e r c o f r u i n a t i o ns t r a i n s 利用微生物生产胆固醇囊化磅的研究 第三章胆固醇氧化酶发酵工艺条件优化 3 1 材料与方法 3 1 1 材料 3 1 1 1 出发酉株 菌株p a e n f b a c i l i u ss px ：u m i o 3 1 1 2 试剂和药品 蔗糖广西南宁糖厂 乳糖上海试剂二厂 麦芽糖上海试剂二厂 葡萄糖国药集团化学试剂有限公司 k h 2 p 0 4广东汕头市西陇化学厂 c a c l 2广东省台山市化学厂 z n c h广东汕头市光华化学试剂厂 m g s o 7 h 2 0上海试剂四厂 ( n i q 4 h s 0 4洛阳市化学试剂厂 s q 地o天津市耀华化工厂 n a n 0 3广州化工试剂厂 广东省台山市化学厂 胰蛋白胨北京陆桥技术有限责任公司 牛肉蛋白胨北京奥博星生物技术责任有限公司 酵母膏北京奥博星生物技术责任有限公司 牛肉膏北京奥博星生物技术责任有限公司 可溶性淀粉上海试剂厂 玉米淀粉上海试剂厂 1 6 一级糖 a r a r a r 丸r a r a r 九r a r a r a r a r a r a r a r a r a r a r 利用傲生物生产胆圈叠事摹玳砖的研究 t w e e n - 8 0 t w e e n - 2 0 尿素 黄豆粉 3 1 1 3 主要仪器与设备 同2 1 1 3 3 1 1 4 培养基 天津市大茂化学试剂厂 上海润捷化学试剂有限公司 广东汕头市西陇化工厂 市售 同2 1 1 4 中的( 1 ) ( 2 ) ( 3 ) 3 1 2 方法 a r a r a r 3 1 2 1 酉种保露方法 ( 1 ) 普通冰箱保藏 菌在斜面培养基上划线，3 0 c 培养2 4 小时，然后放于冰箱保存，每个月传 代培养一次。 ( 2 ) 石蜡封存保藏 石蜡在0 1 m p a 压力下连续灭菌3 次，每次间隔三天，将无菌的石蜡液倒入 培养了l 天的斜面菌种试管里，并浸过培养基的上沿，放入低温冰箱保藏，备用。 3 1 2 2 培养条件 ( 1 ) 斜面种子培养 把冰箱保存的斜面种子由划线的方法接种到新鲜斜面上，在3 0 c 培养箱中 培养1 天备用。 ( 2 ) 种子培养 取一环活化好的斜面种子，接入装有l o o m l 种子培养基的5 0 0 m l 三角瓶中， 于3 0 c ，2 0 0 r r a i n 摇床培养1 2 1 4 小时。 ( 3 ) 摇瓶发酵培养 将一级种子按1 0 的接种量接入装有发酵培养基的摇瓶中，于3 0 c ， 2 0 0 r r a in 摇床培养4 8 h 。 3 1 2 3 酶活的测定方法 见2 1 2 3 3 1 2 4 不同碳源对产酶的影晌 分别以2 的玉米淀粉、可溶性淀粉、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖为碳源， 1 7 利用做生物生产胆固醇氯化酶的研究 固定培养基其他成分，发酵条件：p h 7 0 ，3 0 u ，2 0 0 r m i n ，4 8 h ，2 5 0 m l 摇瓶 2 0 装液量，每个试验做5 个平行，找到发酵产酶的最佳碳源。 3 1 2 5 不同氮源对产奠的影响 选取以下几种不同氮源，进行试验：牛肉蛋白胨、胰蛋白胨、黄豆粉、牛 肉膏、酵母膏、尿素、n h n 0 3 、n a n o l 3 、( n h 4 h s 0 4 ( 均按总氮量0 2 计) 固定 培养基其他成分