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摘要 摘要 生物大分子的核质转运是由受体i m p o r t i n1 3 蛋白家族成员介导完成的。 i m p o r t i n1 3 ( i m p l 3 ，或者1 9 1 2 、i p 0 1 3 ) 是i m p o r t i n t 3 蛋白家族的一个成员，它的表 达和功能是受发育调节。n o r t h e r nb l o t 和免疫组化实验均表明i p 0 1 3 在脑的表达 水平比其他组织都高。i m p l 3 是目前所知的哺乳动物细胞中唯一具有双向转运功 能的受体蛋白。 为了进一步研究i m p l 3 的功能，在本研究中，我们用羧基末端i m p1 3 ( a m i n o a c i d3 0 7 9 6 3 ) ( c i m p l3 ) 作为诱饵蛋白，用酵母双杂交系统筛选人胚胎脑c d n a 文库中能够与其相互作用的蛋白，发现a r x 蛋白质能与羧基末端i m p1 3 相互作 用。为了确定这个相互作用，我们构建了能表达带有g s t 和h i s 6 标签的全长a r x 的原核表达质粒。通过g s tp u l l d o w n 和免疫共沉淀实验，我们发现，像c 端 a r x 与i m p l 3 相互作用一样，全长a r x 也能与i m p l 3 ( 外源和内源) 相互作用。由 于i m p l 3 能够与a r x 相互作用，我们推测a r x 有可能是i m p l 3 的入核底物。 a r x ( a r i s t a l e s s r e l a t e dh o m e o b o x ) 蛋白是成对同源结构域蛋白家族的一个成 员。a r x 基因的突变和多种x 一连锁的疾病有关。研究发现a r x 对前脑，胰腺 和睾丸的发育起重要作用。为了进一步研究a r x 蛋白的功能，我们构建了表达 a r x g s t 融合蛋白质的表达载体p g e x 4 t 2 f a r x 。f a r x 蛋白纯化后做抗原，免 疫兔子，血清经纯化和验证后，获得了a r x 多克隆抗体。 关键词：a r x | i m p l 3 ：相互作用； a b s t ra c t a b s t r a c t n u l c e o c y t o p l a s m i ct r a n s p o r to fm a c r o m o l e c u l e si sm e d i a t e db ys o l u b l et r a n s p o r t r e c e p t o r s ，n a m e l yi m p o r t i n1 3s u p e r f a m i l yp r o t e i n s i m p o r t i n13 ( i m p 13 ，a l s ok n o w n a s1 9 1 2 、i p o13 ) ，i sam e m b e ro ft h ei m p o r t i nps u p e r f a m i l y , i t se x p r e s s i o na n d f u n c t i o na r ed e v e l o p m e n t a l l yr e g u l a t e d b o t hn o r t h e r nb l o ta n a l y s i sa n dm i c r o a r r a y a n a l y s i ss h o wt h a tt h ee x p r e s s i o nl e v e li sh i g h e ri nt h eb r a i nt h a ni no t h e rt i s s u e s t os t u d yt h ef u n c t i o no fi m pl3 ，w ea t t e m p t e dt oi d e n t i f yi t si n t e r a c t i n gp r o t e i n s f r o mah u m a nf e t a lb r a i nc d n al i b r a r yb yy e a s tt w o h y b r i ds c r e e n i n gu s i n g c i m p l3 ( a m i n oa c i d3 0 7 9 6 3 ) a st h eb a i t w ef o u n d t h a ta r xp r o t e i nc a ni n t e r a c tw i t h c i m pl3 t oc o n f i r mt h i si n t e r a c t i o n ，w ee x p r e s s e df u l l l e n g t ho fm o u s e a r xt a g g e d 、析me i t h e rh i s 6o rg s ti nb a c t e r i a l i k et h ei n t e r a c t i o no ft h ec - t e r m i n a la r x f r a g m e n t 晰t hi m p l3 ，f u l l l e n g t ha r xb i n d si m p13a sju d g e db yg s t - p u l ld o w n a s s a y s e q u i v a l e n to b s e r v a t i o n sw e r em a d eb yc o - i m m u n o p r e c i p i t a t i o na s s a y s s i n c e b o t he n d o g e n o u si m p l 3a n do v e r e x p r e s s e di m p l 3b i n da r x ，w es u g g e s tt h a ta r xi sa n i m p l3i m p o r tc a r g o t h ea r xp r o t e i n ( a r i s t a l e s s r e l a t e dh o m e o b o x ) i sam e m b e ro ft h ep a i r e dc l a s so f h o m e o p r o t e i n s a r xg e n em u t a t i o n sa r er e l a t e dw i t hm a n yx c h r o m o s o m el i n k e d d i s o r d e r s m a n yr e s e a r c hh a si n d i c a t e dt h a ti ti sc r u c i a lf o ri t sf u n c t i o n si nf o r e b r a i n ， p a n c r e a s e sa n dt e s t e sd e v e l o p m e n t t os t u d yt h ef u n c t i o no fa r xp r o t e i n ，w ec o n s t r u c t av e c t o rc a l l e dp g e x 4 t 2 一f a r xw h i c hc a ne x p r e s st h ef u s e dp r o t e i ng s t - a r x b y i m m u n i z i n gr a b b i t s 谢t ht h ep u r i f i e dr e c o m b i n a n tp r o t e i n ，a n t i s e r u mw a so b t a i n a f t e r p u r i f i c a t i o na n dv e r i f i c a t i o n ，w eg a i nt h ep o l y c l o n a la n t i b o d yo f a r x k e yw o r d s ：a r x ；i m p1 3 ；i n t e r a c t i o n ；a n t i b o d y 2 厦门大学学位论文原创性声名 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成果。 本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以明 确方式标明。本人依法享有和承担由此论文产生的权利和责任。 声明人( 签名) ：相裎爹 埘年7 月阳 厦门大学学位论文著作权使用声名 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大 学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电 子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学 校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索， 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适 用本规定。 本学位论文属于 1 、保密( ) ，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密( ( 请在以上相应括号内打“) 作者签名：席司7 臣，蓼 日期：蝌6 月如日 导师签名： 矿勾薄日期：乃砖牟7 月日 前言 1 前言 1 1 蛋白质入核机制的研究 i a 1 大分子物质核质转运的基本过程 蛋向质等生物大分子的核质分配，如核耱体蛋白，转录因子的入核转 运r n a 分子及r n p 颗粒的f 核转运，主要是受到由核质转运受体蛋白质家族成 员( 主要是i m p o r t i nb 家族) 介导的与核孔复合体的相互作用的调控完成的。 入桉转运的基本过程包括发生在细胞质中的底物细胞核输入受体二聚体的形 成、细胞核输入受体二聚体和和核孔复合体的相互作用( 如与f g - r e p e a t 的相互 作片j ) ，发生在核内的r a n g t p 的作用下的“棱输入受体一底物”二聚体的解聚和 底物的释放，咀及随后的“梭输入受体r a n o t p ”复合物通过n p c 重返细胞质， 并在胞质内r a n g t p 水解) b r a n g d p ，使得核输入受体在胞质中被释放，丌始 新一轮的入核转运i l “( 图1 1 ) h 9 * # f “州m m n c l m e 女b * 自 2 嬲2 一至2 囊护 图1 _ 1 细胞核质转运示意图 f i g1 1s c h e m eo f n u c i e o c y t o p l 蛐i ct r a n s p o r tm e d i a t e db yt r a n s p o r t i n 女m m il 女等m 物学泉b2 h2 6 3 7 6 4 5 前言 i m p o r t i nb 家族成员是一类真核生物中广泛分布的核质转运受体蛋白。迄 今为止，在人类细胞中发现超过2 0 个成员，酵母细胞中大约1 4 个【7 6 】。这些家 族成员在功能上保守，在蛋白质序列上具有较低的相似性；分子量大约9 5 1 4 5 k d a 之间；结构上都具有保守的n 端r a n 结合结构域( i b nnd o m a i n ) 和多 个( - 2 0 ) h e a tr e p e a t s 结构域( s w i s s - p r o t 数据库) 。h e a t ( h u n t i n g , t i n ，e l o n g a t i o n f a c t o r3 ，t h er e g u l a t o r ya s u b u n i to f p r o t e i np h o s p h a t a s e2 aa n dt o r l ) 是由连续重 复的3 7 4 6 个氨基酸组成的一种螺旋形棒状结构单元。而h e a tr e p e a t s 由多个 这样的单元叠加形成具有延展性的超螺旋，可以通过构象改变为相互作用的蛋 白质提供丰富的结合位点。通过这种特殊的结构，i m p o r t i nd 家族成员可以使 用c 端结合底物( c a 唱o ) 【3 1 或接头蛋白( a d 印t o r ) 4 1 ，n 端结合r a i l g t p 【5 】，中部 结合核孔蛋i 刍( n u p s ) 6 ，从而将底物带入或带出细胞核。 1 1 2 i m p o r t i n l 3 的结构与功能的介绍 在研究肺器官发育的分子机理时，加拿大m c g i l l 大学k a p l a n 实验室得到长 度为3 6 k bc d n ai p 0 1 3 ( i m p l 3 ，i p 0 1 3 ，k a p l 3 ) ( g e n b a n k ，a f l1 0 1 9 5 ) 编码9 6 3 个氨基酸的蛋白质【_ 7 1 。i p 0 1 3 定位在染色体l p 3 3 3 4 2 上。通过b l a s t 检索工具 在网上数据搜索i m p l 3 序列的同源蛋白，发现i m p l 3 属于k a p i m p l 3 家族成员，并 且与之序列同源性最高的是t r n s r ，即人类的t r a n s p o r t i n3 蛋白，与人类的酿酒 酵母的m t r l 0 蛋白同源性次之。不仅序列相似，i m p l 3 蛋白的其他特性也与 i m p o r t i nd 家族成员相同。 i m p l 3 作为i m p o r t i nd 家族成员，转运蛋白质进出细胞核是其重要的生物 学功能。关于i m p l 3 的转运底物的报道近年来不断涌现，i m p l 3 的转运特性也 逐渐为人所知，有文献报道p a x 6 ( p a i r e dh o m e o d o m a i nt r a n s c r i p t i o nf a c t o rp a x 6 ) 由k a r y o p h e r i np 家族成员k a p l 3 ( i m p l 3 ) 转运入核嘲。p a x 基因是一个编码转 录因子的发育控制基因的超家族，也是一类进化上高度保守的基因家族，普遍存 在于从果蝇到人类的各种动物体内，基因家族成员都含包括1 2 8 个氨基酸的成 对结构域，并通过这个结构使蛋白与d n a 结合。有文献报道在酵母双杂交中 p a x 6 被认为是i m p l 3 的识别底物。体外g s t - p u l ld o w n 和体内的免疫共沉淀都 验证了p a x 6 和i m p l 3 之间的直接相互作用，洋地黄皂苷通透细胞膜试验证明 了p a x 6 是依赖r a n 由i m p l 3 转运入核。i m p l 3 通过n l s 识别p a x 6 ，这个n l s 4 刖吾 存在于包含同源结构域的8 0 个氨基酸残基中。当这个同源序列的两端 ( a a 2 0 8 2 1 4 和a a2 6 1 2 6 7 ) 缺失后i m p l 3 和p a x 6 之间的作用力减弱。成对同源 家族有2 0 多个成员，所有成员都包含类似于p a x 6 的n l s ，因此都有可能被 i m p l 3 转运入核。实验也证明了同一家族成员p a x 3 ，c r x 都能被i m p l 3 识别并被 其转运入核 8 1 。 有文献相继报道i m p l 3 是s u m o 1 s e n t r i n 连接酶u b c 9 的入核转运受体， 除此之外i m p l 3 也是m g n ( 果蝇胚胎发育重要蛋白m a g on a s h i 的人类同源蛋白) 和r b m 8 ( m g n 和m r n a 之间的桥接蛋白) 的入核转运受体，并且i m p l 3 与 r b m 8 - m g l l 二聚体中的r b m 8 直接作用，而且还发现i m p l 3 是转录起始因子 e l f l a 的核输出受体旧f 5 l 】。u b c 9 和r b m 8 都不含经典的入核序列( n l s ) ， r b m 8 序列中含有两段富含带电荷的氨基酸基序，但它们相距1 0 0 个氨基酸， 所以无法形成经典n l s 序列。推测这些氨基酸序列的三维结构可能形成类似 于n l s 的序列，或者这些蛋白可能结合于i m p l 3 的不同位点上 9 1 。 还有人报道i m p l 3 可以介导转录激活因子n f y 的二个亚基n f y b 与 n f y c 形成的二聚体转运入核。n f y 由n f a ，n f y b 和n f y c 组成的异源 三聚体，n f a 可以直接结合i m p o r t i n1 3 而被转运入核，而n f y b 和n f y c 都 不能以单体的形式进行核输入，只有通过其保守的组蛋白折叠结构域( h f m ) 形 成二聚体，才能被i m p l 3 识别并转运入核。这是由于单体的n f y b 或n f y c 的h f m 结构域都不具有n l s 的信号功能，核定位信号只出现在二个相互作用 的h f m 结构域中，因此i m p l 3 只能结合n f y b n f y c 二聚体并介导其入核【1 0 1 。 最近，t a o 等通过g s tp u l l d o w n 和c o i p 发现t i m p l 3 与g r ( 糖皮质激素受 体) 相互作用【l ，同时还发t 见i p 0 1 3s i r n a s 抑错u i m p l 3 的表达，直接导致g r 蛋白 质不能在糖皮质激素诱导下，进入细胞核，影响g r 的正常生物学功能。他们 发现将g r 的n l s 突变后( 将5 1 3 5 1 5 氨基酸中的赖氨酸用天冬酰氨替换) ，g r 不能与i m p o r t i na 结合【1 2 】【1 3 】，但依然能与i m p l 3 相互作用。 已知目前有报道的i m p l 3 入核底物有：s u m o 1 连接酶h u b c 9 、r n a 结 合模体蛋白r b m 8 和m g n 复合物【1 4 1 1 1 卯、调控发育因子p a x 3 、p a x 6 嘲，转录激 活因子n f y b n f y c 二聚体【1 7 1 ，糖皮质激素受体g r t l 引，m y o p o d i n t l 9 】出核底 物有：翻译起动因子e l f l a 1 4 1 。 m y o p o d i n 是我们研究i m p l 3 在心脏中的功能时发现的。我们利用大鼠i m p l 3 5 作为诱饵蛋白在人心脏c d n a 文库中筛选与其相互作用的蛋白质时发现 m y o p o d i nc 端氨基酸3 6 0 - - 6 9 8 能与i m p l 3 相互作用。m y o p o d i n 是一个富含脯氨 酸与肌动蛋白微丝偶联的蛋白质，它在细胞中的核质分布情况受到细胞分化情 况及胁迫的影响，同时它的表达与核质分布情况影响到膀胱癌及前列腺癌的恶 化情况。我们利用g s t - - p u l ld o w n 实验和免疫共沉淀实验发现全长的m y o p o d i n 能与i m p l 3 相互作用，同时我们检测到i m p l 3 与m y o p o d i n 的相互作用受到 r a n g t p 的调节。在2 9 3 t 细胞中，我们发现c 端片段的i m p l 3 能阻止m y o p o d i n 入 核，在n i h 3 t 3 细胞中，i m p l 3 的s i r n a 同样g h i i - m y o p o d i n 入核。因此我们推断 i m p l3f 邑将m y o p o d i n 带入核。 1 2a r x 的研究进展 1 2 1a r x 基因和a r x 蛋白 1 2 1 1a r x 基因的发现 a i 基因定位于x 染色体上【2 0 1 ，在脊椎动物中，它首先于1 9 9 7 年报道表 达于老鼠的中枢神经系统中【2 1 1 。由于它和果蝇a r i s t a l e s s 基因相似度很高，故 而命名为a r x ( a r i s t a l e s s r e l a t e dh o m e o b o x ) 。2 0 0 2 年才发现人源a i 基因【2 2 2 3 1 ， 并发现其功能紊乱与人类各种x 连锁的智力发育迟缓症和癫痫症有关。通过同 源比较分析发现，人类的a r x 与鼠的a r x 在氨基酸水平上具有9 5 的同源性。 a r x 属于a r i s t a l e s s 相关基因家族，是成对同源异型结构基因中的一份子。这 些基因被认为是脊椎动物胚胎发生期的重要调节子，包括中枢和外周中枢神经 系统的发育【2 4 1 。研究发现a r x 对前脑，胰腺和睾丸的发育起重要作用。 1 2 1 2a r x 基因 a r x 基因定位于x p 2 2 ，邻近于p o l a ( d n a 多聚酶i ，d n a p o l y m e r a s ei ) 基因。它是一个长约1 2 5 k b 的小基因，有5 个外显子( 图1 2 ) 。除了在脑和骨骼肌 中有一个约2 8 k b 的转录本之外【2 2 1 ，n o r t h e r nb l o t 实验结果证实心脏内存在较长 的转录本( 约4 4 k b 和约5 9 k b ) 【2 3 ，2 5 1 。而在骨骼肌中存在较短的转录本( 约2 5 k b 和2 1 k b ) 2 2 1 。然而，应用e s t 和它的同源性分析其基因结构表明a l 编码区的 可变剪切可能并不存在。这些不同的转录本可能是由于p o l y a 的长度变化以及 6 前言 3 端u t r 区域的变化引起的。a r x 的开放阅读框包含1 6 8 6 b p ，且g c 含量高达 7 2 5 ，使得对a r x 基因进行p c r 和测序造成了一定的困难。a r x 除了编码区 外显子之外，其基因周围存在一些值的注意的保守元件。有报道称邻近a r x 基 因有1 1 个极端保守的元件，其中至少有一些可能是a r x 的增强子【2 6 1 。c o l l o m b a t 发现在小鼠中，这些极端保守元件的其中之一接近p a x 4 蛋白接合位点【2 7 】，而 至少在胰腺中，p a x 4 和a r x 可以调节彼此的表达，从而控制着细胞的特化 2 7 ， 2 8 。目前，只有a r x 基因的编码区检测出突变。然而，那些潜在的或者已经 证实的调节序列，如a r x 相关的极端保守元件，也应进行突变的检测。 1 9 6 b ps 7 7 却4 6 峥3 2 9 b p烈i 1 7 4 3 却2 6 1 8 却勰如2 猢b p 图1 2 人a r x 基因的基因组结构 f i g1 2t h eg e n o m es t r u c t u r eo fh u m a na r xg e n e 资料来源：r o h i r a , e ta im o l e c u l a rg e n e t i c sa n dm e t a b o l i s m , 2 0 0 2 ，7 7 ：1 7 9 1 2 1 3a r x 基因的表达方式 a r x 在胚胎发育期主要表达在神经系统中，主要定位于端脑和腹侧丘脑， 除此以外在底板，体节，胰腺和发育的睾丸中也检测到a r x 的表达。而在成 人阶段，除了脑部、在心脏和肌肉组织中也发现a r x 的表达，但其在脑中的 表达量降低【2 3 1 。 c o l o m b o 发现鼠科的a r x 同源物在前脑早期形成过程以及此后的神经元迁 移和细胞特化过程中具有高动态表达模式f 2 9 】。在胚胎发育期，a r x 最早在三体 节阶段表达，当发育到十体节阶段时，它则表达于前神经板区域。在其后的发 育阶段，整个端脑结构如神经节突起，大脑皮层及海马都有表达f 2 8 2 9 , 3 0 1 。在大 部分的中脑和间脑结构除腹侧丘脑外没有发现表达【2 & 3 0 1 。小鼠胚胎脑冠状面切 片表明a r x 在背侧和腹侧脑具有不同的表达方式，在背侧脑中，a r x 在正在发 育的侧面神经节突起和中间神经节突起的缘层的分化细胞中有高表达，但在这 一区域的增生层不表达相反的，a r x 在发育中的皮层的脑室层高度表达1 3 1 】。皮 层的脑室层存在皮层的兴奋投射神经元，是锥细胞的产生区域。其他类型的皮 层神经元，含g a b a ( v 一氨基丁酸) 的中间神经元，都产生于腹部端脑的神经突 7 前言 起。这些神经元经下述途径中的一种迁移到腹部端脑皮层：第一条途径出现于 小鼠胚胎的1 2 5 天左右，定位于发育中的皮层的缘层( m z ) 。第二条途径似乎 稍迟( e 1 2 5 1 4 5 ) ，定位于皮层的侧脑室附近的脑室下带( s v z ) 和中间层( i z ) 【强j 。 这些正在迁移的中间神经元的通道可用a r x 的抗体所标记。事实上，双标记实验 证实a r x 在皮层g a b a o 经元中表达，但不在径向迁移的投射神经元中表达。在 成人中，a r x 的表达被限制于含有g a b a 的神经元的区域，比如皮层，海马，视 丘下部，杏仁核体，尤其在嗅球中表达比较强。不过并不是所有包含g a b a e r g i c 神经元( n e u r o n st h a tp r o d u c eg a b a a st h e i ro u t p u t ) 的脑内区域都表达a r x ，比 如小脑内抑制性p u d ( i 面e 细胞不表达a r x 【3 2 】。 a r x 于胚胎发育第9 5 天在老鼠的中枢神经系统中表达。而c o l l o m b a t 发现 在这个阶段在胰腺原基中也检测到a i 表达。在胰腺发生期，a r x 表达在增殖 的胰腺上皮细胞中，在分化的胰腺前体细胞中，以及接下来的成熟胰岛中【2 8 】。 1 2 1 4a r x 蛋白结构 a r x 蛋白属于三个最大的同源框结构蛋白类之一的成对结构( p r d ) 蛋白， 它是这个类别的特定亚类成员之一。这一亚类的成员在同源框结构区附近的第 5 0 个位点存在一谷氨酸残基( q 5 0 ) ，这个残基在果蝇的a r i s t a l e s s 蛋白中也被发 现。体外实验发现，一般来说，q 5 0 同源框结构蛋白能够有效地结合上包含两 个t a a t 半位点( h a l f s i t e s ) 的回文结构d n a 序歹i j 【3 3 1 。a r x 蛋白的同源框结构 由三个螺旋结构组成，形成螺旋转螺旋结构，而结合的特异性大多取决于识 别螺旋( 螺旋i i i ) 【3 4 】 除了成对的q 5 0 同源异型结构域( 氨基酸3 2 8 _ 3 8 7 ) ，a r x 还有多种重要 的功能结构域( 图1 3 ) ：a r i s t a l e s s 结构域( 氨基酸5 2 7 5 4 2 ) ，八肽结构域( 氨 基酸2 7 _ - 3 4 ) 、酸性结构域( 氨基酸2 2 4 2 5 5 ) ，4 个p o l y a 簇( a l a l ，a a 1 0 0 - 1 1 5 ；a l a 2 ，a a1 4 4 - 1 5 5 ；a l a 3 ，a a 2 7 5 - 2 8 1 ；a n d 越a 4 ，a f t 4 3 2 - 4 4 0 ) 和三个核定 位序( n l s l ，a a8 2 8 9 ；n l s 2 ，舱3 2 5 - 3 3 2 ；a n dn l s 3 ，a a 3 7 9 - 3 8 6 ) 。这些结构域的功 能只有很少的一部分被研究清楚，还有很大的研究空间。 由1 4 个氨基酸组成的无刺( a r i s t a l e s s ) 结构位于a r x 在c 端。这个结构的功 能目前未知，有研究认为a r i s t a l e s s 结构域是一个激活结构域【3 5 1 ，它可能涉及指 导a r x 识别某一特定基因从而调节其转录。a r i s t a l e s s 结构域在o t p ( o r t h o p e d i a ) 前言 同源异型结构域蛋白中是高度保守的，o t p ( o r t h o p e d i a ) 同源异型结构域蛋白是 对腹间脑的区域化起着重要作用的一类蛋白家族的一个成员。缺失a r i s t a l e s s 结 构域使o t p ( o r t h o p e d i a ) 同源异型结构域蛋白的转录活性降低【3 6 】。 a r x 蛋白的n 端具有一个高度保守的八肽结构域。因为这一八肽结构域和 e h 1 的抑制性结构域相似【3 。7 1 。m c k e n z i e 认为具有转录调节活性的t l e 辅因子蛋 白t l e l 5 - i 能和a r x 相互作用1 3 引。事实上，至少其中一种，i i i t l e l 已证实可以 通过八肽结构域和a r x 结合从而调节a r x 的转录抑制活性。 p o l y a 序列在a r x 蛋白和其它一些蛋白中的功能知之甚少。基于它们在转录 因子，特别是同源异型基因中出现率高，可以认为，它们可能和转录调节有关 1 2 引。在a r x 蛋白中存在有4 个p o l y a 序列，它们的保守程度并不一样。而p o l y a 序 列突变也是最为多发的a r x 突变。 通过序列分析比对发现，a r x 蛋白具有三个入核信号，一个位于n 端，另两 个分别位于同源框结构域的两端【2 7 1 。但a r x 蛋白的入核机制尚未有具体研究， 这三个信号如何起作用并不清楚。 乾 3 2 6 麓垃扪鞠b6 嚣5 2 | i 目一 l 一匡煎图画_囫 1 钉甜 1 1 61 4 4 1 6 6 口：o c t a p e p t i d e 圆：p r d h o m e d o m a l n 目：n l 8 囫：a r i s t a l e s sd o m a i n - ：p o l y a l a n i n et r a c t s 图1 3a r x 蛋白结构示意图 f i g1 3t h e s t r u c t u r es c h e m eo fa r x p r o t e i n 1 2 2 a r x 蛋白的生物学功能 1 2 2 1a r x 在脑发育中的作用 为了了解a r x 蛋白在脑发育中的作用，研究人员先后构建了不同模式生物， 如小鼠、线虫、蟾蜍的过表达或缺失功能的a r x 表达系统，这些研究的结果归纳 如下，表明a r x 在胚胎发育中涉及多个过程。 9 前言 1 2 2 1 1a r x 在细胞增殖中的作用 k i t a m u m 将小鼠a r x 的2 号外显子用l a c z 替换，产生基因敲除小鼠，观察 到其与人类x l a g ( x 1 i n k e dl i s s e n c e p h a l yw i l t ha b s e n tc o r p u sc a l l o s u ma n d a m b i g u o u sg e n i t a l i a ) 非常相似的表型【3 8 】。杂合子小鼠出生比野生型稍早，出生 半天后死亡。新生突变小鼠的特点是较小的脑部和较小的嗅球。用溴脱氧尿苷 进行脉冲追踪试验发现皮层的脑室层增殖减少，这可能是其变小的原因。 t u n e l 实验没有表现出细胞凋亡的增加，排除了凋亡是所观察到的头小 畸形的原因【3 8 】。这些结果表明a r x 在皮质细胞增殖中起作用。 1 2 2 1 2a r x 在区域化中的作用 为了更细致的研究突变老鼠大脑的表征缺陷，研究人员用原位杂交来研究 不同标记物的定位【3 8 1 。他们发现失活的a r x 导致w n t 8 b ：和l h x 9 在胚胎第1 2 5 天的 丘脑突起中表达减少。同样，在同一发育阶段d l x l 在腹侧丘脑表达降低。其后 果是丘脑部分发育不全，造成第三脑室扩张，和海马发育不全( 尤其是齿状脑回 和c a 3 区域) 、丘脑皮层辐射异常。连同先前发现的a r x 在腹侧丘脑的表达【2 王 3 9 j ，这些结果表明a r x 的表达对于形成正确丘脑结构是必需的。 a r x 在区域化中的作用的最有力的一个证据来自于爪蟾中x a r x 过度表达和 失活表达的研究【4 0 l 。来源于爪蟾的a r x 同源基因除了它只有一个多聚丙氨酸束 而在哺乳动物基因中有四个之外同脊椎动物基因的相似很高( 5 9 6 4 氨基酸相 同，6 6 7 2 氨基酸相似) t 4 1 1 。x a i x 在前脑分化和成形的胚胎发育早期表达【4 l 】。 当x m r x 注入预期形成前段中枢神经系统区域时，造成了明显的前段截断：前脑前 端缩短增厚、眼睛缺陷如c o l o m b “网膜色素上皮发育不完全) 和独眼畸形 4 0 l 。 少数胚胎甚至缺少头部。眼睛异常是多样的，从无眼、缺少一只眼睛到眼部 轻微缺陷。这些表型也许可以由在被注入胚胎的前壁部分缺乏脊索及基板标记 物s h h 表达来解释。在人体中s h h 缺失表达造成脑部和眼睛两侧发育对称性的更 新丧失，例如，独眼畸形和前脑发育畸形症【4 2 】。进一步分析发现，注入胚胎的腹 侧脑部分扩增、可能是背侧前脑的腹型化的结果。在分子水平，s e u f e r te ta 1 发 现许多标记基因表达减少或缺乏，包括标记端脑、间脑及神经阶段胚胎的视网膜 分子标记。这些基因稍后以一种不正常的形式表达【加l 。以上结果说明a r x 过表 达刺激脑部特异化和区域化的消失或延迟。s e u f e r te ta l 利用反义吗啉寡聚核苷 1 0 前言 酸在发育中的脑中失活a r x ，观察到前脑和眼睛的大小只有胚胎注入的一半。端 脑和视网膜的分子标记，例如，基因n k x 2 1 和p a x 6 ( 配对同源异型结构域基因 6 ) 表达降低。综上所述，这些发现证实了a 在脑特异化和发育中起着不可 忽视的作用。 1 2 213a r 】【在正切方向神经迁移中的作用 由于a 在表达g a b a 神经元中表达，k i t a m u r ae ta 1 研究在突变小鼠中这 些神经元从它们的起源区腹侧前脑区的迁移情况 3 s 】。他们将3 溴1 苯基2 丙 烯的晶体放在脑切片的( 中间神经节突起) m g e 区域，标记的神经元在两天 后迁移到发育中的皮层。在正常对照中，神经迁移在( 中间层) i z 和( 脑室 下层) s v z 水平有两种截然不同的途径，而在突变切片中，前一种途径消失。 然而这些结果与已被广泛接受的在i z s v z 低水平上神经元迁移只有唯一途径 不符h 3 出，4 5 1 。而他们所谓的c a l b i n d i n 标记神经元( 可能的g a b a 神经元前体) 的部分缺失也不明确，故而不能得到a r x 在皮层中间神经元迁移过程中起作用 的有力证据。 k i t a m u r ae ta 1 他们用原位杂交的方法检验了一些转录因子来试图解释他 们所观察到的切向迁移缺吲3 8 】。n k x 2 1 州k 2h o m e o b o x1 ) ，是m g e ( m e d i a l g a n g l i o n i ce m i n e n c e ) 的一个标记分子，发现其在突变小鼠的e 1 4 5 天它的表达扩 展到( 侧面神经节突起) l g e 的( 脑室下层) s v z 。他们还观察到l l l x 6 和d l x l 也有类似的变化有趣的是，虽然缺失n l ( x 2 1 ，d l x l d l x 2 ( d i s t a l l e s sh o m e b o xg e n e ) 和l h x 6 ( l i m h o m e o b o xp r o t e i n6 ) 可以抑制g a b a 中间神经从m g e 迁移到新皮 层【4 3 , 4 6 , 4 7 】，a r x 的缺陷并没有造成m g e 中n k x 2 1 ，l h x 6 表达下降，说明这种切向 迁移的损伤可能不同于和上述两种基因相关的机制。c o b o s 以鸡和老鼠胚胎为 模型研究发现d l x 基因可控制觚的表达，且并不受d l x 单一突变的干扰，提出 d l x l ，d l x 2 ，以及d l x 5 其中的任一基因都可调节a r x 基因【4 8 1 。但a r x 的缺失是 否直接或间接的影响切向迁移损伤仍很难下定论。 1 2 214a r x 在辐射迁移中的作用 k i t a m u m 等详细研究突变小鼠e 1 3 天和产后第三天的皮层结构，观察到了 一定程度的不规则薄层f 3 8 】。但是他们不能确定这些不规则结构是异常辐射状迁 前言 移的结果或者是细胞增殖缺陷的结果。当然这也有可能是由于锥体细胞分化过 程中产生的问题而造成的：可能细胞迁移正常，但由于没有正确的分化信号而 未能正常分化。 值得注意的是，虽然a r x 在皮层锥体神经元中不表达，但其缺失可能导致这 些细胞一定程度的混乱。有一种可能性是，在( 脑室区) v z 中表达的a r x 控 制细胞增殖和锥体细胞迁移的时间【4 9 】。事实上，分裂后的神经元以有序波的形 式离开v z ，以由内到外的顺序产生出细胞层，这样那些早期产生的神经元定位 于最深层，而后来出生的细胞迁移穿过已存在的细胞层，形成表面层。因此， 何时迁移对神经细胞迁移的命运是非常重要的。视频显微镜实验表明，离开v z 是由细胞分裂的方向决定的。垂直分裂导致细胞重新进入细胞周期，而横向分裂 会产生一个将继续分裂神经母细胞，和一个将离开增殖区有丝分裂期后的细胞 5 0 , 5 1 , 5 2 , 5 3 。细胞分裂方向和分裂后的细胞的数目的控制机制仍未知。但是，最 近一项研究表明，在体内干扰g 蛋白三聚体的g d 丫亚基将改变细胞分裂方向， 使其由横向分裂转变为垂直分裂【5 4 】。目前流行的一种假说是，如同在果蝇中 观察到的那样，在神经祖细胞区域，神经元命运的决定子可能不均一的定位于 原始细胞的特定区域【5 5 1 。另一个由研究不规则薄层所得到的假说是锥体细胞需 要来自于中间神经元的特定信号使其正确的定位于皮质，在缺乏这些细胞时， 他们不能找到正确的位置。这一假说是不成立的，因为在缺乏d l x 或n k x 2 1 基因的小鼠中虽然它们的皮层缺乏大部份的中间神经元，但并没有辐射迁移损 伤 4 3 t4 6 。 1 2 2 2a r x 在细胞分化中的作用 双标记实验表明a r x 表达于那些同时也表达神经肽y 的前脑细胞中，在突 变小鼠中这些细胞在纹状体，海马和皮质中缺失，这说明a r x 在这些细胞的分化 过程中起着重要的作用【3 引。线虫实验也证实了a r x 在细胞分化中的作用。a l r - 1 ， 线虫的a r x 同源基因，据报道可以调节化学感应神经元的一种：a w a 嗅神经 元的分化【5 6 】。除了保守的同源结构域外( 同果蝇的a l 和人类a r x 分别有8 1 和 7 9 的同源性) ，a l r - 1 也具有一个的a r i s t a l e s s 结构域，只是不像同源结构域那样 保守。a l r - 1 突变使得a w a 嗅觉中间神经元的基因表达异常，并且造成其树突 缺失。由此看来，a l r - 1 不是a 、胀神经元产生的必要条件，但却在其分化中起 1 2 前言 作用。a l r - 1 似乎在a s g 化学感应神经元( 和a 、凇来源于同一前体细胞) 中 起抑制其产生类似a w a 细胞的作用【5 6 1 。已有研究表明，线虫l i m l 的同源基 因，l i n 1 1 特化a 、凇和a s g 神经元的命运【57 1 。a 、艄神经元中，胚胎晚期 到幼虫早期l i n 1 1 的短暂表达对于启动o d r - 7 的表达是必需的，而在a s g 神经 元中l i n 1 1 的表达在整个胚后期都有表达。这种l i n 1 1 不同的时序调节表达对 于细胞命运的正确特化是非常重要的。为了研究a l r 1 和l i n 1 1 的关系， m e l k m a na n ds e n g u p t a ( 2 0 0 5 ) 构建了突变产生a l r - 1 l i n 1 l 的双突变线虫，发现， 在幼虫晚期的筒a 神经元中，a l r 1 在l i n 1 l 的上游，下调l i n 1 1 的表达【5 6 】。 有趣的是，在果蝇腿部发育过程中，l i m i 也受到a l 的调节【5 8 1 。在小鼠，l i m 同源结构域蛋白质l m x l a 在顶板的发育过程中是必需的，这又是中枢神经系统 中背部细胞命运决定的关键【5 9 1 。有趣的是，如果l m x l a 缺失表达，背神经管将 发育不完全，这也可显示a r x l i m 1 通路在爪蟾中也是保守的，也许可以解释 之前所观察到的在过表达或失活x a r x 时所观察到的表型。总之，这些实验表明 a l r 1 在a 、聊以s g 分化中起作用，调节化学感应神经元的发育和分化。 m e l k m a n & s e n g u p t a 也发现了a l r - i 在g a b a e r g i e 中间神经元的分化中起作用。 以小鼠模式生物研究受d l x 基因调节的下游基因时，同样也观察到了a r x 在g a g a e r g i c 细胞分化中的作用【4 引。这些基因如果不是调控所有就是调控着 大部分端脑g a b a e r g i c 神经元的分化唧l 。将d l x 2 和d l x 5 注入小鼠脑切片中 诱发异位a r x 的表达，而a r x 的表现在d l x l 2 双敲除小鼠中剧烈减少【4 引。这些 结果与之前观察到的a r x 在神经突起的增殖层不表达相符，在增殖层几个皮层 g a