芹菜素对小鼠T淋巴细胞体外增殖、 细胞周期和凋亡的影响.doc

芹菜素对小鼠T淋巴细胞体外增殖、 细胞周期和凋亡的影响 作者：梁兆端, 曾耀英, 黄秀艳, 贺芳【摘要】 目的: 研究芹菜素（AP）对小鼠T 细胞体外增殖、 细胞周期和凋亡的影响。方法: 无菌分离小鼠淋巴结和胸腺细胞, MTT 法检测不同浓度（25、 50、 100、 150、 200 mol/L）的AP 对多克隆刺激剂刀豆蛋白A(ConA)诱导的T 细胞增殖的影响, PI 染色结合流式细胞术（FCM）分析细胞周期的分布, Annexin V-FITC/PI 双染色结合FCM 检测AP 对T细胞凋亡的影响, 以及AP与地塞米松（DEX）共同作用下T 细胞凋亡的变化, 并用MTT 法检测该药物浓度对T细胞的毒性作用。结果: 25200 mol/L AP对T细胞无药物毒性作用, 并明显抑制ConA诱导的T 细胞增殖(P<0.01), 使细胞周期停滞在G0/G1期, 且呈剂量依赖关系; 各浓度AP对T细胞凋亡均具有抑制作用, 并明显抑制DEX诱导的T细胞凋亡(P<0.01), 且呈剂量依赖关系。结论: 在一定浓度范围内, AP 明显抑制ConA诱导的小鼠T细胞体外增殖, 使细胞周期停滞G0/G1期, 并明显抑制T 细胞凋亡。 【关键词】 芹菜素 T淋巴细胞 增殖 周期 凋亡Abstract AIM: To study the effect of Apigenin (AP) on the proliferation, cell cycle and apoptosis of mouse T cells in vitro. METHODS: The lymphocytes were prepared from lymph nodes and thymus of mice. The effect of AP on the proliferation of T in response to ConA at different concentrations (25, 50, 100, 150, 200 mol/L) was detected by MTT. Cell cycle was measured by PI staining and FCM. The effect of Apigenin and Apigenin with DEX on T cell apoptosis was measured by Annexin V-FITC/PI double staining and FCM. The effect of different concentrations of AP cytotoxicity to T cells was measured by MTT. RESULTS: 25-200 mol/L of AP didnt have cytotoxicity to T cells, but it had some inhibitory effect on T cells in response to ConA(P<0.01), arresting cell cycle at G0/G1 in a dose-dependent manner. Different concentrations of AP inhibited the apoptosis of T cells, especially those induced by DEX(P<0.01). CONCLUSION: AP can inhibit the proliferation of mouse T cells in response to ConA, arrest cell cycle at G0/G1 and inhibit the apoptosis of T cells.KeywordsApigenin; T lymphocyte; proliferation; cell cycle; apoptosis芹菜素（Apigenin, AP）, 又名4, 5, 7-三羟基黄酮, 分子式C15H10O5, 是一种无诱导突变的黄酮类化合物, 也是一种植物雌性激素, 广泛存在于绿色植物中1, 2。AP具有抗增殖、 抗炎、 抗病毒微生物和清除自由基等功能, 同时也是信号通路中几种蛋白激酶的抑制剂, 其4, 5, 7位置的三个羟基和C2C3双键决定了其独特的生物学特性3-5。目前, AP广泛应用于肿瘤研究中, 具有抑制多种肿瘤增殖的潜能, 但在免疫学方面的研究罕见报道。目前, 以淋巴细胞增殖、 细胞周期和凋亡为研究靶点, 成为筛选和开发新型免疫调节药物的新策略。在当今开发新型化学药物极为困难的情况下, 从食物提取物中筛选具有免疫调节作用的药物具有很大的空间。1 材料和方法1.1 材料 清洁级BALB/c近交系小鼠(雄性, 810周龄, 质量2225 g; 34周龄, 质量1216 g), 购自广东省医学实验动物中心。刀豆蛋白A(ConA)、 L-谷氨酰胺、 -二巯基乙醇、 二甲基亚砜(DMSO)、 碘化丙啶（PI）、 地塞米松(DEX)、 噻唑蓝(MTT, 用PBS配制成5 g/L的工作液, -20贮存备用)、 芹菜素（AP, 用DMSO溶解成265 mmol/L的储存液, 分装, -20保存, 临用前用含100 mL/L DMSO的PBS稀释成10 mmol/L的工作液）和RNase均购自美国Sigma公司。青霉素和链霉素购自华北制药公司。RPMI1640和胎牛血清(fetal calf serum, FCS)购自美国Gibco-BRL公司。Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司。无水乙醇购自广州化学试剂厂。FACSCalibur流式细胞仪为美国Becton Dickinson公司产品。1.2 方法1.2.1 淋巴结细胞和胸腺细胞的制备 将BALB/c小鼠断髓处死, 无菌分离双侧颌下、 腋窝、 锁骨下、 腹股沟浅表和肠系膜淋巴结以及胸腺, 去掉被膜, 于200目尼龙网筛研磨过滤, 于4, 125 g离心5 min, 并收集细胞, 4磷酸盐缓冲液(PBS, pH7.2)洗涤, 同上条件离心1次, 2 mL/L台盼蓝染色, 活细胞百分率达96%, 并用含100 mL/L FCS 的RPMI1640培养液悬浮淋巴细胞并调整淋巴结细胞和胸腺细胞的密度分别为2109/L和1109/L。1.2.2 MTT法检测AP对ConA诱导的小鼠淋巴结T细胞增殖的影响分别设置Control组、 ConA组、 ConA+AP 25mol/L组、 ConA+AP 50 mol/L组、 ConA+AP 100 mol/L组、 ConA+AP 150 mol/L组和ConA+AP 200 mol/L组。细胞接种于96孔细胞培养板, 每孔加10 L不同浓度的AP（终浓度分别为25、 50、 100、 150、 200 mol/L）, 每一浓度设3个复孔, 每孔定容200 L, 于37、 50 mL/L CO2培养箱预孵育2 h, 然后加入ConA (终浓度5 mg/L)继续培养。加ConA后48 h, 每孔加入20 L MTT工作液, 于37、 50 mL/L CO2培养箱孵育4 h, 300 g离心5 min, 吸掉上清液体, 每孔加100 L DMSO, 振荡10 min, 免疫酶标仪490 nm波长检测吸光度（A值）, 并计算细胞相对抑制率（%）。抑制率=(1实验组A均值)/对照组A均值100%。1.2.3 PI染色分析细胞周期分布 按1.2.2的分组及培养方法进行培养, 48 h后收集细胞, 冷PBS洗涤, 于4, 125 g离心5 min, 300 L含100 mL/L普通级小牛血清的PBS重悬, 边轻荡边加入700 L冷无水乙醇, 4固定30 min, 于4, 125 g离心5 min, 弃去上清, 2 mL冷PBS重悬洗涤, 同上条件离心2次, 弃去上清, 收集沉淀细胞, 边轻荡边加入300 L PI染液（含RNase）, 避光15 min, 立即进行FCM分析。1.2.4 Annexin V-FITC/PI染色检测凋亡细胞 分别设置Control组、 AP 25 mol/L组、 AP 50 mol/L组、 AP 100 mol/L组、 AP 150 mol/L组、 AP 200 mol/L组、 DEX组、 DEX+AP 25 mol/L组、 DEX+AP 50 mol/L组、 DEX+AP 100 mol/L组、 DEX+AP 150 mol/L组和DEX+AP 200 mol/L组。胸腺细胞接种于24孔细胞培养板, 每孔加50 L不同浓度的AP（终浓度分别为25、 50、 100、 150、 200 mol/L）, 定容1 mL, 于37、 50 mL/L CO2培养箱预孵育2 h, 然后加入DEX (终浓度1 mol/L)继续培养。6 h后收集细胞, 冷PBS洗涤离心(125 g, 5 min, 4), 弃上清液体, 加入100 L染料结合缓冲液(Binding buffer)重悬后加10 L Annexin V-FITC染色, 混匀后室温避光静置15 min, 补加200 L Binding buffer和5 L PI 染液（50 mg/L）, 混匀静置5 min, 立即进行FCM分析。1.2.5 FCM分析 FITC在荧光1(FL1)通道检测, PI在荧光2(FL2)通道检测。先在前散射(FSC)对侧散射(SSC)二维散点图中划出淋巴细胞区R1, 然后对R1细胞群作DNA倍体分析, 并对R1细胞群FITC/PI荧光强度进行检测, 每管样品检测10000个细胞。全部数据经FACSCalibur流式细胞仪和CELLQuest软件获取和分析, 检测周期的数据用ModFit软件进一步分析。1.2.6 MTT法检测药物毒性作用 分别设置Control组、 AP 25 mol/L组、 AP 50 mol/L组、 AP 100 mol/L组、 AP 150 mol/L组和AP 200 mol/L组。淋巴结T细胞接种于96孔细胞培养板, 余下处理同1.2.2（不加ConA）, 并计算细胞相对存活率(%)。存活率=（实验组A均值/对照组A均值）100%。1.2.7 统计学处理 获得的结果用xs表示, n为样本量。统计软件用SPSS.10, 统计方法用one-way ANOVA。2 结果2.1 AP对ConA诱导小鼠淋巴结T细胞增殖的影响 如表1所示, 培养48 h, Control 组A值为0.1110.002, 而ConA组A值明显增加, 为0.8500.112（P<0.01）, ConA+AP 25 mol/L组A值与ConA组无统计学意义（P>0.05）, 其余各浓度组A值明显低于ConA 组（P<0.01）, 并具有浓度依赖性。表1 AP对ConA诱导的T细胞增殖的影响（略）Tab 1 The influence of Apigenin on the proliferation of T cells in response to ConAbP<0.01 vs control; dP<0.01 vs ConA.2.2 AP对ConA诱导小鼠淋巴结T 细胞细胞周期阻滞分析 如图1所示, 各组均有晚期凋亡或坏死的细胞, Control组细胞大部分处于G0/G1期, 即为静止状态, ConA组细胞明显进入S 期和G2/M 期（P< 0.01）, ConA+AP 25 mol/L组细胞周期分布与ConA组无统计学意义（P>0.05）, 其余各浓度组细胞周期分布与ConA组均有统计学意义（P<0.01）, G0/G1期明显增高, 而S期和G2/M期明显降低, 并具有浓度依赖性。图1 AP对ConA诱导的T细胞细胞周期阻滞分析（略）Fig 1 The analysis of AP to T cell cycle blockage in response to ConAa: Control; b: ConA; c: ConA+AP 25mol/L; d: ConA+AP 50mol/L; e: ConA+AP 100mol/L; f: ConA+AP 150mol/L; g: ConA+AP 200mol/L.2.3 AP及AP与DEX共同作用下对胸腺T细胞凋亡影响 Annexin V-FITC是一种标记有荧光素的钙依赖磷脂结合蛋白, 可特异性地与早期凋亡细胞外翻的细胞膜磷脂酰丝氨酸(PS)结合, PI能进入细胞膜不完整的晚期凋亡和坏死的细胞, 故Annexin V-FITC/PI双染色细胞可呈现3个细胞群, 即正常细胞(Annexin V-FITC-/PI-)、 早期凋亡细胞(Annexin V-FITC+/ PI-)、 晚期凋亡和坏死细胞(Annexin V-FITC+/PI+)。如图2所示, 培养6 h, Control组胸腺T细胞自发凋亡率低（7.78%）, 地塞米松(DEX)诱导的胸腺T细胞凋亡率明显增加（63.84%）（P<0.01）, 各浓度AP明显抑制T细胞自发凋亡, 并对DEX诱导的T细胞凋亡具有明显抑制作用（P<0.01）。图2 AP对胸腺T细胞凋亡影响和AP与DEX共同作用下胸腺T细胞凋亡变化（略）Fig 2 The influence of Apigenin on the apoptosis of thymus T cells and the change of Apigenin with DEX on the apoptosis of thymus T cellsa: Control; b: AP 25 mol/L; c: AP 50 mol/L; d: AP 100 mol/L; e: AP 150 mol/L; f: AP 200 mol/L; g: DEX; h: DEX+AP 25 mol/L; i: DEX+AP 50 mol/L; j: DEX+AP100 mol/L; k: DEX+AP 150 mol/L; l: DEX+AP 200 mol/L.2.4 MTT法检测AP对T细胞的药物毒性作用 如表2所示, 25200 mol/L AP作用48 h后, 细胞相对存活率大于50%。故培养48 h, 25200 mol/L AP对小鼠T细胞无药物毒性作用。表2 AP对T细胞的药物毒性评价（略）Tab 2 The value of AP cytotoxicity to T cells3 讨论 MTT法检测AP对ConA诱导的小鼠淋巴结T细胞增殖影响的结果显示, 在一定浓度范围内（50200 mol/L）, AP明显抑制ConA诱导的小鼠淋巴结T细胞的增殖, 具有浓度依赖性, 并与该浓度药物对T细胞的毒性作用无关。PI染色分析细胞周期分布结果表明, AP抑制ConA诱导T 细胞增殖, 并使细胞周期停滞在G0/G1期。上述结果与A