（环境科学专业论文）耐铅优势菌的筛选及其应用研究.pdf

耐铅优势菌的筛选及其吸附应用研究 t h es c r e e n i n go f l e a d r e s i s t a n ts t r a i n a n ds t u d yo ni t sa p p l i c a t i o n a l o s t r a c t i no r d e rt os o l v et h ep r o b l e m so f r e s i s t a n c ea n da d s o r p t i v i t yw h i c hw e r ef a t e di nt r e a t i n g h e a v ym e t a lw a s t e w a t e rb yb i o f i l m s o u rs t u d i e sf o c u so nt h em i c r o o r g a n i s m si nb i o f i l mw e r e c u l t u r e dw i t ha c t i v es l u d g eo f s e w a g ed i s p o s a lf a c t o r yi nd a l i a nd e v e l o p m e n to f e c o n o m ya n d t e e h n i q u ez o n et h em i c r o o r g a n i s m si nb i o f i l mw e r ed o m e s t i c a t e di nd i f f e r e n tc u l t u r em e d i a w h i c hc o n t a i n i n go fp b z + a n dt h ed o m i n a n tb a c t e r i aw i t hh i g hr e s i s t a n c ea n da d s o r p t i v i t yw a s s c r e e n e do u t t h ed o m i n a n tb a c t e r i aw e r eo b t a i n e db yo o m p a r e i n gw i t ht h eu p t a k eo f p b z + t h e s t r a i nw a si d e n t i f i e da sk l e b s i e i l ap n e u m o n i a eb yt h e1 6 sr d n aa n a l y s i sa n dc o m p a r i n gw i l n c b ia n dt h ep h y s i o l o g ya n db i o c h e m i s t r yc h a r a c t e r i s t i c so f s t r a i na r cs i m i l a rw i t | lk l e b s i e l l a p n e u m o n i a e t h ea d s o r p t i v ee f f e c t sw e r ed i s c u s s e d t h ee x p e r i m e n t a lr e s u i t si n d i c a t et h a tl e a di o n r e m o v a lr a t ec a nr e a c hu pt 09 6 8 8 i nt h ef o l l o w i n gc o n d i t i o n s ：p h = 7 0 ，i n i t i a lm a s s c o n c e n t r a t i o no fl e a di o nw a s2 5 m g la n dt h em a s sc o n c e n t r a t i o no fb a c t e r i aw a sl g l t h e u p t a k eo fl c a di o nc a nr e a c hu dt ol5 0 m g gw h e ni n i t i a lm a s sc o n c e n t r a t i o no fl e a di o nw a s 3 0 0 m g lm e a n w h i l e t h es i m u l a t i o nr e s u l t so f l a n g m u i rm o d e ia n df r e n d l i c he q u a t i o ns h o w t i i a tt h em a i na d s o r p t i v em e c h a n i s mo fp b ”w a ss u r f a c ea d s o r p t i o n i na d d i t i o n i rs p e c t r u m a l s oc o n f i r m e dt h a tt h eh y d r o x y la n dc a r b o n y lg r o u p so f p o l y s a c c h a r i d ea n dp r o t e i ne x h i b i t e d r e ds h i l l si nv a r i o u sd e g r e e s ，t h ep e a kw i d t ho fc - o - ca n dh y d r o x y lg r o u p sw i d e n e dal i t t l e b i ta n dt h ea b s o r p t i o ni n t e n s i t i e so fa l lp e a k sd e c r e a s e d 1 1 1 ea f md e t e c t i o n si n d i c a t et h a tt h e e l a s t i c i t yo fb a c t e r i ad e c r e a s e s 。t h ea d h e s i v e n e s si n c r e a s e sa n dt h em y c e l i u ms h r i n k sa f t e r a d s o r p t i o n w h i c hi i l u s t r a t e st h a tl e a dw a sa c c u m u l a t e di nt h em y c e l i u m t h ed o m e s t i c a t e dc o n d i t i o n sw e r es t u d i e di nt h i sp a p e r t h eb i o f i l m sw e r er e s p e c t i v e l y c u l t u r e db ya c t i v a t e ds l u d g e ，t h ed o m i n a n ts t r a i n ，t h em i x e dd o m i n a n ts t r a i na n da c t i v a t e d s l u d g ef o rd e a l i n gw i t hw a s t e w a t e rc o n t a i n i n gl e a dc o n c e n t r a t i o no f1 0 0m g lu n d e ro p t i m a l c o n d i t i o n s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h er e m o v a io fl e a da n dc o df o rt h eb i o f i l m sc o n t a i n i n g t h ed o m i n a n ts t r a i n sw e r e m o r et h a n9 0 c o m p a r e i n gw i t ht h e8 0 o f t h eb i o f i l m s & a c e p t i n g t h ed c i m i n a n ts t r a i n s b i o f i l mb e f o r ea n da f t e rt r e a t i n gw a s t e w a t e rc o n t a i n i n gl e a df o r1 2 d a y s ，w e r ea n y s i s e da tt h ea t o m i cf o r c em i c r o s c o p ea n ds t u d i e db yi r i n f r a r e ds p e c t r o m e t r y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h em a i na d s o r p t i v em e c h a n i s mo fp b e + w a ss u r f a c ea d s o r p t i o n t h e c o n t e n t so fo r g a n i cc o m p o n e n t si ne x t r a c t i o no fe x t r a c e l l u l a rp o l y m e r sf r o mb i o f i l m sw e r e r e s p e c t i v e l y d e t e r m i n e d t h ec o n t e n t so fa m y l a s e ，p r o t e i d e ，d n aw e r ea l l b i g g e ra f t e r 一一 大连理工大学硕士学位论文 a d s o r p t i o nl e a di o n , t h ec o n t e n t so fa m y l a s ew a st h eb i g g e s t , w h i c hs h o w e dt h a tt h ec o n t e n t s o fa m y l a s em a d eam a i nr o l ei na d s o r p t i o nl e a di o n d o u b t l e s s l y ，t h i sr e s e a r c hh a sp a v e dt h e w a yf o rh e a v ym e t a lw a s t e w a t e rt r e a t m e n tw i t hb i o f i l m k e yw o r d s ：k l e b s i e l l ap n e u m o n i a e b i o s o r p t i o n l e a d ；b i o f i l m 独创性说明 作者郑重声明：本硕士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得大连理 工大学或者其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意 作者签名：e 盘点鞋 日期：2 龃：丝：! ! 大连理工大学硕士研究生学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“大连理工大学硕士、博士学位 论文版权使用规定”，同意大连理工大学保留并向国家有关部门或机构送 交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连理 工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，也 可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。 作者签名： 导师签名： 趣盔蕴 一垫2 竺i j l 2 盟! 年乜月j 殳日 大连理工大学硕士学位论文 引言 随着工业经济的快速发展，城市人口的剧增，工业废水和生活污水排放量也与日俱 增。水体中的许多重金属因其具有较大的毒性、不可降解性以及生物积累效应而使重金 属污染成为一个极其重要的环境问题。重金属污染对人类健康造成的威胁己引起世界各 国科学工作者的普遍关注，对其治理成为目前研究的难点和热点。处理重金属废水的方 法很多，传统方法在处理低浓度的重金属废水时，处理费用较高且有二次污染【”等缺点。 近年来，生物法以其高效，与环境友好而引起广大研究者的高度关注。国内外使用到的 生物吸附剂有菌体、藻类、细胞提取物、木质烈2 1 、蟹壳粉末嗍、麦麸h 1 等等。p e t rb a l d r i a n i s 主要用白腐菌株p c h r y s o s p o r i u m 研究了白腐菌吸附重金属的能力，它对c d 2 + 、c u 2 + ， h g ”、n i 2 十和p b z + 的吸附量分别为11 0 、6 0 、6 1 、5 6 和1 0 8 m g g 干重菌体，而且不同菌 株的白腐菌对不同的重金属吸附量各不一样，由此可选择不同的白腐菌菌株处理含不同 重金属的废水。使用细菌固定化技术，把生物吸附剂固定在藻酸钙或多聚糖上，这样可 大大改善生物吸附剂的机械性能，有利于重复使用，且比单独使用生物吸附剂的吸附效 果明显要好 6 - 9 生物膜因其各种微生物之间在化学，物理和遗传水平上的协同作用，使之对环境条 件变化具有较强的适应能力，并可同时处理有机污染物和一些无机离子，这使国内外学 者 i o - 1 2 】对生物膜处理重金属有机废水尤为关注。但由于重金属离子对微生物的毒害作 用，使生物膜处理重金属废水受到限制。 为了解决上述问题，以大连经济技术开发区某水质净化厂的活性污泥接种培养的生 物膜中微生物群作为研究对象，选用不同培养基，对生物膜中的微生物菌群在铅离子存 在条件下进行驯化，从中纯化若干单菌株。并通过做单菌株吸附铅离子的对比实验，从 中得到高耐受性、高吸附性的优势菌株。通过1 6 sr d n a 测序并与n c b i 数据库资源对 比，分析其同源性，并作相关菌株的系列生理生化特性实验，鉴定高效菌株的菌属。探 讨各种因素对优势菌吸附铅离子的影响和吸附机理，同时研究驯化生物膜的最佳条件， 在此条件下利用优势菌培养生物膜处理含铅废水 耐铅优势蕴的筛选及其吸附应用研究 1重金属危害及处理 1 1 重金属来源及危害 重金属废水的来源可谓十分广泛，主要来源于工业废水：电镀、采矿、化工等部门； 来自矿山排水、废石场淋浸水、选矿厂尾矿排水、有色金属冶炼厂除尘排水、有色金属 加工厂酸洗水、电镀厂镀件洗涤水、钢铁厂酸洗排水。以及电解、农药、医药、油漆、 颜料等工业的废水。我国工业废水中重金属的排放量达几千吨。目前人类生存的环境中 含重金属离子的废水不论从数量上还是种类上都大大增加了，其存在形态随不同生产种 类而异，差异很大i l ”。 重金属废水形成特点：( 1 ) 除被悬浮物带走的外，会冈吸附沉淀作用而富集于排污 口附近的底泥中，成为长期的次生污染源；( 2 ) 水中各种无机配位体( 氯离子、硫酸离子、 氢氧离子等) 和有机配位体( 腐蚀质等) 会与其生成络合物或螯合物，导致重金属有更大 的水溶解度而使已进入底泥的重金属叉可能重新释放出来；( 3 ) 重金属的价态不同，其 活性与毒性不同。其形态又随p h 和氧化还原条件而转化。在过去的几十年中，大量的 相关研究结果显示，熏金属在水环境中固液相表面的分配情况是影响其迁移转化的关 键。在自然水体中，重金属并不主要以自由离子的形态存在，而是结合在水中的生物体、 悬浮颗粒物，以及表层沉积物等固相表面上。研究表明，重金属在水相中的浓度和存在 形态、水相的物理特性如p h 和离子浓度、水相中吸附性基团的存在情况以及固相的类 型、表面特征和表面积等是影响固相上重金属吸附机制的主要因素。 重金属，特别是汞、镉、铅、铬等具有显著和牛物毒性，众多研究表明其危害性是 空前的【。含重金属离子的废水造成海产品的产量下降、农作物的减产、林业的衰退、 土地的破坏、各种生物无法适应这么严重的重金属废水的污染而濒于灭绝、食物链被严 重破坏、导致大气和水环境质量的进一步恶化、环境也失去平衡，对人类生存与生命也 岌岌可危【”】。如镉的毒性很大，在人体内蓄积会引起泌尿系统功能变化，还会影响骨骼 发育，如1 9 5 5 年发生在日本神通川地区的“痛痛病”，就是因为该地区的土壤一植物系 统受到镉的污染；1 9 5 3 年日本水俣氮肥厂的乙酸乙醛反应管排出含有氯化甲基汞的汞渣 流入水体，有毒物质被鱼、虾、贝类食人后，由食物链进入人体，导致了“水俣事件” 的发生。铅能伤害人的神经系统，特别对幼儿的智力发育有极其不良的影响。铅是类 具有神经毒性的重金属元素，在生物体内可造成多系统的损害。铅很容易被胃肠吸收， 其中一部分破坏血液使红血球分解，一部分通过血液扩散到全身器官和组织，并进入骨 骼。沉积在内脏器官及骨髓中的铅化合物从体内排出的速度极慢，逐渐形成慢性中毒。 大连理工大学硕士学位论文 慢性中毒最初只是疲倦，食欲不振，体重减轻。严重时呕吐、腹泻，并出现末梢神经障 碍，造成桡骨神经麻痹及手指震颤症。再严重时导致铅毒性脑病，有机铅急性中毒会神 经错乱，因急性脑病而死亡。 对于含铅废水的处理已成为全人类共同攻克的一个重大课题。随着今后经济社会的 发展，入口的剧增，各种资源结构调整及自然灾害损毁等，可利用的水资源将进一步减 少。迄今为止，无论是国内或国外，对重金属废水的治理仍不够完善和彻底，远未消除 重金属废水对环境造成的污染。因而如何有效地控制及治理水源中重金属的污染，改良 水体质量，将成为生态环境保护工作中十分重要的一项内容。我们应当越来越多地投入 更多的精力来探索重金属废水危害的探究和治理方案，这将成为人们不可回避的工作。 1 2 重金属的处理方法 目前，针对重金属废水的危害性，处理技术的方法多种多样，大体可归纳为中和沉 淀法、化学沉淀法、氧化还原法、气浮法、电解法、蒸发和凝固法、离子交换法、吸附 法等物理法、化学法、物理化学法，生物法和高效集成法。其中以壳聚糖及其衍生物作 为吸附剂来处理废水中的重金属研究较多。罗道成等 1 6 1 制备了改性的壳聚糖在静态条件 下对重金属离子p b 2 + 、p b 2 + 、c d 2 + 、z n 2 + 、n i ”的吸附，发现重金属离子的去除率达到9 7 以上，净化效果和活性炭相当。庄华等m 以壳聚糖为原料合成交联聚氨基球状熬合树脂， 结果表明，对高浓度重金属离子的吸附量大小为h 矿+ p b o z n ”，对z n 夸几乎不吸附；而 在低浓度时，对三种离子具有很高的吸附率。然而随着科学技术的发展与人类社会的进 步，一些传统的处理方法已不适应现代的节奏，当用于处理低浓度的重金属废水时，往 往操作费用和原材料成本相对过高，经济上不合算【l8 】。f - j 时由于处理后产生的固体废物 与废液处理更为困难，因此说这些方法从现代工业角度来看并不实用。 与传统的废水处理方法相比，生物吸附技术以其商效、成本低廉的优点引起人们极 大的兴趣。而且目前的研究多集中在利用活体及非活体微生物吸附重金属 1 9 - 2 4 1 。利用微 生物吸附重金属具有显著的优势：( 1 ) 在低浓度下，金属可以被选择性去除：( z ) 对钙镁 离子吸附量少；( 3 ) 处理效率高；“) p h 和温度条件范围宽；( 5 ) 投资小，运行费用低； ( 6 ) 可有效地叵i 收一些贵重金属。 生物技术的广泛应用使得越来越多的人关注微生物群体形成的生物膜来改善环境 的污染，近来，生物膜在处理重金属有机废水方面的潜力已引起研究者的兴趣。生物膜 处理可以同时去除重金属有机污染物和一些无机离子，生物膜中各种微生物之间在化 学，物理和遗传水平上的协作使微生物对环境条件变化具有更强的适应能力。这些优点 使生物膜处理重金属有机废水具有潜在的应用前景。因此最具发展前途的生物膜法已逐 耐铅优势菌的筛选及其吸附应用研究 渐地成为发展的趋势方向，其经济、快速、无二次污染的处理方法与手段将成为新时代 科学研究的新课题。 1 3 水体中的生物膜 1 3 1 自然水体中的生物膜 自然水体生物膜主要是附着于水环境中固相的表面卜，由活跃的生长发育着的单一 或混合的微生物群体和铁、锰金属氧化物、有机质及少量的矿物质组成的活性膜。这种 活性膜的吸附作用影响着水环境中重金属的迁移、转化、生物可利用性以及最终归宿。 给水管网中细菌的生长繁殖包括在水溶液中悬浮生长和在管内壁附着生长两种形式。由 于饮用水属于贫营养生长环境，细菌在管壁的附着生长远比悬浮生长占优势，即形成生 物膜【2 5 j ( b i o f i l m ) 。生物膜普遍存在于河流、湖泊、湿地环境中的岩石、表层沉积物、悬 浮颗粒物的表面。w i m p e n n y t 2 6 1 从微生物的角度研究了生活供水系统中表层生物膜发育 形成的条件和时间序列：( 1 ) 存在着清洁的可用于聚居的固体表面；( 2 ) 一种有机分子膜 快速形成；( 3 ) 聚结的细胞松散地附着；( 4 ) 聚居的细菌牢固地附着；( 5 ) 微生物群落形 成，产生胞外聚合物；( 6 ) 群落向上和向下扩展，形成规则和不规则的结构：( 7 ) 生物膜 成熟，新的菌种进入生物膜并生长，有机和无机碎片结合其中，溶液梯度形成，导致生 物膜空间的异相结构；( 8 ) 生物膜可能被噬细菌的原生动物捕食；( 9 ) 成熟的生物膜可以 脱落，使这种循环交替重复进行；( 1 0 ) 形成了一种顶级群落。其中，微生物分泌的胞外 聚合物对水环境中生物膜的形成至关重要：类似凝胶状的胞外聚合物首先附着到水环境 中的各种基质表面，使得各种微生物和矿物质逐步粘附到基质上，进而形成一个微生态 系统。 由于生物膜具有较大的比表面积，对污染物具有显著的吸附活性，因此，生物膜对 重金属离子有明显的吸附及富集作用 2 7 - 2 s l ，对于持久性有机污染物可以通过膜上细胞和 颗粒物的脱附和吸附作用进行有选择性地吸收和新陈代谢作用【”l 。董德明等阻划对自然 水体生物膜进行了大量的研究。研究主要集中在三方面：一、自然水体生物膜对金属的 吸附特征。研究表明，长春市南湖生物膜对金属的吸附容量次序是c u p b z n c d b a 。 金属吸附符合朗缪尔模型。最大吸附量，l “随金属标准电极电势的增加而增大，i 俨“ 随金属标准电极电势的降低和共价半径的增加而线性增大。吉林南湖生物膜对c o 、n i 、 c u 的吸附过程均符合朗缪尔模型。在溶液中重金属浓度 c u n i ；在溶液中重金属浓度 o 5 p m o l l 时，生物膜 对3 种重金属元素的吸附能力顺序是c u c o n i 。生物膜对c o ，n i 和c u 的吸附均在数小 时内达到平衡。吸附过程符合l a n g m u i r 等动力学曲线。向海自然保护区湿地水环境中直 大连理工大学硕士学位论文 接采集的生物膜对铅、镉的吸附符合f r e u n d l i c h 和l a n g m u i r q 及附等温线。在所研究的浓度 范围内，生物膜吸附铅的能力大于吸附镉的能力，而且随着生物膜浓度的增加，生物膜 吸附铅、镉的最大吸附量呈。f 降趋势，并具有显著的相关性。二、环境条件对自然水体 生物膜吸附金属的影响。p h 对湿地水环境中生物膜吸附铅和镉有影响，不同p h 条件下， 铅、镉在湿地水环境中培养的生物膜吸附热力学数据均与f r e u n d l i c h 和l a n g m u i r 等温吸附 曲线显著性相关，吸附溶液中的p h 值与铅、镉的最大吸附量呈正比，并具有显著线性关 系。湖水中的颗粒物能影响生物膜对铅和镉的吸附。生物膜上铁、锰氧化物含量与水中 总铁、总锰含量呈明显的线性关系，锰氧化物的含量受水中颗粒物粒径分布的影响很 大膜上铁、锰氧化物吸附铅、镉的能力随着湖水中颗粒物粒径的减小呈增强的趋势。 三，自然水体中生物膜不同化学组分对金属吸附的作用。自然水体中生物膜不同化学组 分对铅、镉吸附的作用不同，生物膜上锰氧化物是影响生物膜吸附铅的主要因素，有机 质对生物膜吸附铅的影响作用次之，铁氧化物和铝氧化物的影响相对较小：生物膜上铁 氧化物是影响生物膜吸附镉的主要因素，铝氧化物和有机物对生物膜吸附镉的影响作用 依次降低，锰氧化物的影响作用相对较小。 a l y s o nr w i l s o n 等d 1 在实验室模拟生物膜上铁、锰、铝氧化物和有机质对铅的吸附， 并在此基础上发展了一个用以量化铅吸附和p h 关联的模型，进而发展了一个加和模型用 以预测p b 在自然生物膜上的吸附。在实验的p h 范围内，模型预测值与p b 在c a y u g a 湖自 然生物膜上的吸附值相一致。实验结果表明，铁、锰氧化物能贡献p b 在c a y u g a 湖自然生 物膜上吸附的9 0 ，随着p h 升高，主要吸附作用从锰氧化物向铁氧化物转变。 1 3 2 人工生物膜 在模拟自然水体生物膜处理废水的基础上，针对水体污染物成份，高密度培养发 酵不同功能的活性菌，按比例混合制成制剂，形成生物膜，直接投放到被污染的水体中， 对富营养元素进行分解转化，实现净水目的。与传统的活性淤泥法相比，生物膜技术应 用于城市污水处理具有投资省，运行费用低、淤泥少，没有“二次污染，效率高等优 势。 生物膜技术的这些优势使许多学者专著于这方面的研究，y c s h i t a k es u z u k i 等闱用附 着着生物膜的活性炭处理含有少量有机污染物，少量重金属和大量钠盐的电镀工业污 水处理厂出水，5 0 的有机物和8 0 的铜3 0 的铬被去除，重金属被生物膜吸附，有 机物被生物降解和部分吸附。j a s c o t t 和a m k a r a n j k a r l l 3 1 用固定在颗粒活性炭上的生 物膜去除水中的金属离子，考察了溶液和生物膜培养液的p h 和温度对金属吸附的影响， 并对影响原因进行了解释。溶液p h 降低，金属吸附量下降，他们认为这是因为生物吸 耐铅优势菌的筛选及其吸附应用研究 附包括细胞表面的吸附和胞外聚合物的吸附，溶液p h 降低，细胞表面和胞外聚合物带 正电，阻止了带正电的金属离子络合，质子化水平的改变影响金属与一c o o h 和- 0 i h 等 官能团的结合。生物膜培养液的初始p h ，在碱性范围内对金属吸附的影响很小。在酸 性范围内，p h 降低，金属吸附减少，这是因为在中性或弱碱性，细胞能产生最高浓度 的聚合物。溶液温度从5 c 升高到3 0 c ，金属吸附只提高1 0 ，表明生物膜一活性炭吸 附，主要是物理吸附，不是代谢活动。生物膜培养液温度从5 c 升高到1 5 c ，c d 吸附提 高3 0 ，1 5 升高到2 5 ，c d 吸附提高1 9 。这是因为温度升高，代谢活动提高，产 生了更多的细胞和胞外聚合物。 目前，关于生物膜中微生物群的研究主要集中生物膜对重金属的消除，以及生物膜 不同化学组分对重金属吸附作用的研究，而对生物膜中的微生物群本身进行耐受性、特 异性、功能性的驯化与筛选、并将筛选的高效菌株进行实际应用的研究还很少，而耐受 性、特异性的问题是限制生物膜处理重金属废水实际应用的关键，因此解决生物膜菌群 耐受性、特异性及其实际应用条件的问题正是本研究的所要解决的。 1 4 生物膜消除重金属离子的机理 生物膜消除重金属离子的机理包括生物膜中微生物对重金属的吸附、胞外聚合物对 重金属的吸附和生物膜的整体作用。 1 4 1 微生物吸附重金属的机理 微生物吸附金属离子的过程主要有两个阶段，第一个阶段是被动吸附过程1 3 7 4 b ( 表 面络合、离子交换、氧化还原等) ，即金属离子在细胞表面的吸附，同时还包括，另一 阶段是活体细胞的主动吸附i 习，即细胞表面吸附的金属离子与细胞表面的某些酶相结 合而转移至细胞内，包括传输和沉积。 通常所说的生物吸附仅指非活性微生物生物的吸附作用，而活性微生物具有的去除 金属离子的作用一般称为生物积累，因此生物吸附过程不包括生物的新陈代谢作用和物 质的主动运输过程，即使当利用活体生物作吸附剂时这些作用可能会同时发生。一般认 为生物具有的吸附能力是与细胞壁的结构、成分密切相关的 4 6 1 。大多数微生物对金属的 富集往往发生在细胞表面，对金属的吸附通常是一快速、依赖p h 的过程，一般认为细 胞表面吸附主要是由于金属离子与细胞表面活性基团络合、离子交换以及络合基团晶核 进行吸附沉淀。而胞内吸附是一个缓慢、复杂的过程。王亚雄等h 1 用细菌对c u ”、p b 2 + 等的吸附特性研究表明，类产碱假单胞菌( p s e u d o m o n a s p s e u d o a l c a l i g e n e s ) 和腾黄微 球菌( m i c r o c o c c u sl u t e u s ) 对c u ”、p b 2 + 的吸附能力很强，c u 2 + 和p b 2 + 在细菌表面 吸附与p h 值有关，吸附的最佳p h 值为5 6 ，细菌对c u 2 + 、p b 2 + 的离子吸附分为 一6 一 大连理工大学硕士学位论文 两个阶段：一是细胞表面的络合，在3r a i n 内吸附量达总吸附量的7 5 ；二是向细菌内 部缓慢的扩散过程。虽然活细胞吸附有生物积累过程，但在实际吸附过程中，活细胞的 吸附量并不因为有能量代谢系统的参与而比死细胞高 4 s l 。由于废水中要去除的离子大多 是有毒、有害的重金属或放射性金属，他们会抑制生物的活性，甚至使其中毒死亡，并 且生物的新陈代谢作用受温度、p h 、能源等诸多因素的影响，因此生物累积在实际应用 上收到了很大的限制。而生物吸附由于与生物的新陈代谢作用无关，因此将细胞杀死后， 经过一定的处理，使其有一定的粒度、硬度及稳定性，可以便于贮存、运输和实际应用。 赵玲等 4 9 1 用海洋赤潮生物原甲藻( p r o r o c e n t r u mm i c a n s ) 的活体和死体对c u 2 + 、p b 2 + 、n i 2 + 、z n 2 + 、a g + 、c d 2 + 的吸附能力进行研究，实验证明，金属离子混合液经 原甲藻吸附3 0 r a i n 后，各离子的浓度显著下降且达到平衡。原甲藻的活体和死体对这 六种金属离子具有相似的吸附能力。用干燥、磨碎后的绿藻( ul a c t u c a ) 和小球藻吸附 铅的吸附率最高可达9 0 以上。李明春等脚1 利用活性和非活性假丝酵母菌( c a n d i d as p ) 对c u ：+ 、c d 2 + 、n i 2 + 的吸附能力进行研究，实验表明，3 0 r a i n 时吸附量已达到总吸 附量的9 0 以上。将含曲霉、毛霉、青霉以及根霉的丝状真菌菌丝培育物干燥、磨碎 并经筛分，使其成为可贮存的生物体，用于处理含c d 、p b 、n i 、z n 的工业废水。在 p h 为7 时，可除去9 8 的p b 、9 7 的z n 、9 2 的c d 以及7 4 的n i t 5 1 1 。 1 4 2 胞外聚合物消除金属离子的机理 胞外聚合物是生物膜的主要成分【5 冽，主要来源于细胞内分泌、细胞自溶和从废水 中吸附得来。胞外聚合物中所含多糖的种类较多，厌氧菌产生的胞外多糖主要是由鼠李 糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖组成。胞外多糖含有多种功能团，如羧基、羟基和磷酸基， 这些基团对不同类型离子表现了强烈的亲和性。在负电性的胞外聚合物中，金属离子可 以起到架桥的作用。例如铬可以与胞外聚合物相互作用，导致胞外聚合物结构变化，并且 在絮凝物中形成疏水性区域。胞外聚合物主要由多糖和蛋白质构成，多糖和蛋白质上的 带负电的官能团如丙酮酰基、磷酰基、羟基、琥珀酰基和糖酰基等，能与金属产生强烈 络合作用。因此生物膜能提供一个高局部金属浓度、高二氧化碳浓度、适宜的p h 的微 环境，更加有利于金属沉淀。 1 5 微生物吸附重金属的影响因素 微生物吸附重金属离子取决于许多物理和化学因素，如p h 值、温度、金属离子的质 量浓度和共存离子等，也取决于某些生理条件，如微生物细胞的活性。此外，生物的生 理条件、溶液初始质量浓度，吸附时间以及生物量等因素对生物吸附重金属离子也有影 响。 一，一 耐铅优势菌的筛选及其吸附应用研究 1 5 1p h 值的影响 水溶液p h 值是这些因素中最重要和最基本的，它直接影响溶液中固相表而的电荷 和各组分的形态，决定阴阳离子在液相和固相间的分配，进而影响它们的移动性、反应 活性、生物可利用性、生物积累特征以及毒性。 水环境中的大多数氧化物和氢氧化物 都显示出两性表面特性，在低p h 值时得到质子，产生带正电基团，高p h 值时失去 质子，带负电。微生物细胞同样带有随p h 值变化而变化的电荷，这种电荷由细胞表面 的羧基和氨基的质子化或去质子化获得。金属水解以及金属和溶解态配体的络合程度也 与p h 值有关，即存在吸附金属的最佳p h 值范围，在生物膜吸附重金属的实验研究中发 现，随着溶液p h 值的升高，生物膜吸附重金属的能力逐渐增大。 溶质在固相表面的吸附要由溶液本体经外部扩散到达吸附剂表面，在此发生离子交 换、表面络合等外层结合作用，然后由吸附剂表面向吸附剂内部扩散( 又称粒子内扩散) ， 向结合作用更加紧密的吸附位迁移，可能发生沉淀反应等慢速过程。吸附速率的大小即 由以上过程中的反应速率和扩散速率共同决定网。 1 5 2 吸附时间的影响 生物膜对重金属的吸附过程大致可分为三个阶段：初始阶段、过度阶段、平衡阶段。 在初始阶段，生物膜对重金属有较明显的吸附，吸附液中金属浓度有显著的降低。研究 者们认为在吸附过程中发生的化学配位反应和吸附都是快速过程，因此能够很快建立平 衡【s ”。说明生物膜吸附重金属离子开始以细胞表面的吸附为主 5 6 1 。 1 5 3 生物量的影响 随着生物膜量的增加，溶液中的吸附率增大；但是单位质量生物膜的吸附量却下降 了这是因为生物对不同的金属的吸附性能不同。因此，在生物膜吸附重金属离子的过程 中，适当增加体系的生物膜量，将会缩短吸附时间，同时也可提高吸附率。 1 5 4 温度的影响 微生物对重金属的吸附受温度影响比较小，为达到较好的吸附效果，选择2 5 3 5 1 2 的 范围较为合适，但由于吸附反应为放热反应，温度高于4 0 ( 2 时，反而会使吸附量下降。 1 5 5 离子强度的影响 目标金属以外的其他金属阳离子对生物吸附的影响主要体现在竞争效应上，溶液中 的阴离子也会对生物吸附产生影响，这主要是因为一些阴离子会与金属离子形成络合 物，从而阻止生物吸附剂对金属离子的吸附，并且生成络合物的稳定常数越大，这种影 响越明显，因此研究多种离子共存状态下的生物吸附性能非常重要。 一8 一 大连理工大学硕士学位论文 总之，离子强度主要通过两种方式影响重金属的行为，一是影响溶液中各形态的反 应活性，高的离子强度降低活性或参加反应的组分的有效浓度；二是影响界面的电荷扩 散区的厚度，高离子强度降低该区的厚度。因此高离子强度通常会减少溶液中金属与固 相表面功能团之间的表面络合反应的数量p 7 - s s 。 1 6 影响生物膜处理效果的因素 生物膜是一个半稳定的、开放的动力学系统，生物膜的形成及其组分处于动态的变 化中：水环境中的各种成分在生物膜上发生着合成、聚结、转化、降解等作用，从而成 为生物膜的一部分，还会随着生物膜的脱落重新进入水相中p 1 删。 影响生物膜形成的主要因素包括水的流速、基底类型、水体中微生物的种类和数量、 营养水平和光照、温度等。其中控制生物膜生长的最主要参数是水的流速，高流速使生 物膜易于形成单层结构，而低流速使生物膜形成复杂结构。此外，粗糙的基质也有利于 生物膜的生长。光照能够影响生物膜的结构，无光照条件下生长的生物膜中小颗粒物分 布比较多，而在有光照条件下，则有利于形成较大的颗粒，并且含有较多的叶绿素、藻 类和较少的营养物质 1 7 本课题研究的意义及内容 目前，生物膜法处理重金属离子废水遇到了很多障碍，由于重金属的毒害，导致部 分耐受性差的微生物死亡，影响生物膜的处理效果。故人们对生物膜去除重金属的作用 机理、环境因素影响的研究，特别是构建高效复合生物膜等研究成为生物膜法处理重金 属废水的热点。对生物膜中的微生物群进行耐受性、特异性、功能性的驯化与筛选，得 到对重金属离子高耐受性、高吸附的菌株并研究吸附条件对实际吸附的影响是面对我们 的新课题。 以大连经济技术开发区某水质净化厂的活性污泥接种培养的生物膜中微生物群作 为研究对象，选用不同培养基，对生物膜中的微生物菌群在铅离子存在条件下进行驯化， 从中筛选优势菌株，从而得到对铅离子具有高耐受性、高吸附性的优势菌株。通过1 6 s r d n a 测序并与n c b i 数据库资源对比，分析其同源性，鉴定商效菌株的菌属。进而研 究此菌株吸附铅离子的影响因素，探讨吸附机理，并运用优势菌株培养生物膜处理含铅 废水 一9 一 耐铅优势菌的筛选及其吸附应用研究 2 生物膜的培养及耐铅优势菌的筛选 2 1 试验设备及试剂 2 1 1 试验仪器设备 表2 1 实验中使用的主要仪器设备 t a b l e 2 1 t h e m a i n e x p e r i m e n t a l i n s t r u m e n t s a n d e q u i p m e n t s 2 1 2 试验材料 ( 1 ) 生物膜培养 生物膜来源：开发区某水质净化厂二沉池的活性污泥 生物膜载体：自制圆盘呢绒丝( 5 0 m m ) 容器；2 5 lp v c 白桶 辅助设备：恒温加热棒、多嘴曝气泵 人工废水( g l ) ：葡萄糖0 4 9 ；f n i - h ) 2 s 0 4o 2 9 ；f e s 0 40 0 1 9 ；m g s 0 40 0 0 4 9 ；k h z p 0 4 o 0 1 4 9 1 6 i 】 ( 2 ) 培养基 到| 化用n o 1 培养基( g ，1 0 ：牛肉膏3 9 ；蛋白胨 1 0 9 ；n a c i5 9 ； p h = 7 o 7 2 ： 大连理工大学硕士学位论文 驯化用n o 2 培养基( g ，l ) ：可溶性淀粉2 0 9 ：k n 0 3l g ：n a c i o 5 9 ： k 2 h p 0 40 5 9 ；m g s 0 4o 5 9 ；f e s 0 40 0 1 9 ：p h7 0 7 2 1 驯化用n o 3 培养基( g l ) ：n a n 0 32 9 ：k c l0 5 9 ；k 2 h p 0 4l g ：m g s 0 4o 5 9 ； f e s 0 4o 0 1 9 ：蔗糖3 0 9 ： 驯化用n o 4 培养基( g ，1 0 ：葡萄糖4 9 ；蛋白胨5 9 ；酵母膏l g ；甘油 1 0 9 ；p h = 7 0 ： 以上培养基的灭菌条件均为：1 2 1 ，2 0 m i n 6 2 ，6 3 】 2 1 3 试验主要试剂 表2 2 试验中使用的化学试剂 t a b l e2 2t h ec h e m i c a lr e a g e n t si ne x p e r i m e n t i i 耐铅优势菌的筛选及其吸附庶用研究 2 2 实验方法 2 2 1 模拟自然水体生物膜的培养 选择大连经济技术开发区某水质净化厂二沉池的活性污泥，用自来水清洗三次，沉 降弃上清。将一定量( 2 0 m l ) 的清洗过的污泥倒入2 1 l 人工废水( 自来水和8 4 9 葡萄糖， 4 2 9 ( n h 4 ) ：s 0 4 ，o 2 1 9f e s 0 4 7 h 2 0 、o 0 8 4 9m g s 0 4 ，o 2 5 2 9k h 2 p 0 4 ) 中，使其同定在自 制圆盘呢绒丝牛物膜载体上，在不同条件下培养生物膜，使用电恒温加热棒调节水温为 平均2 8 ，用多嘴曝气泵进行间歇有氧培养，培养成膜时间为1 8 天左右。膜片在使用前， 将其放入盛有洗涤剂的水中浸泡2 4h ，进行彻底洗涤并用去离子水清洗。然后放入6 ：1 ( v ， v ) h 2 0 ：i - 1 n 0 3 溶液中浸泡处理2 4 + 时。用去离子水重新清洗后，再次放入6 ：l ( v v ) h 2 0 ：h n 0 3 溶液中同样处理2 4 1 时，最后再用二次去离子水冲洗。 2 2 2 菌群的驯化 用玻璃片从生物膜卜刮下适量悬浮液，静置，弃去上清液。将得到的菌群水溶液分别 加入按2 1 2 2 方法配制的4 种培养基中。2 8 * ( 2 振荡培养2 4 h 。每天用移液枪吸取1 0 0 p l 前一天的培养液加入到新的液体培养基( 3 5 m l ) 中，培养基中的铅离子浓度是1 0 0 m g l 。 重复以上操作几次。 2 2 3 菌体的纯化 ( 1 ) 固体培养基的制备 向上述2 1 2 2 中的液体培养基加入一定量的琼脂和p b ( n 0 3 ) 2 ，搅拌均匀，即固体培养 基中的铅含量为1 0 0 m g l 。 将配制好的液体和固体培养基放入高压灭菌锅内在1 2 1 下灭菌2 0 r a i n 。 把灭菌后的固体培养基倒入培养皿内约1 3 1 2 高度处，平放好，冷却凝固制成平板。 本操作在无菌条件下进行。 ( 2 ) 菌体的纯化 将2 2 2 中在四种不f 弓培养基下驯化好的菌液分别取适量稀释一定的倍数，取1 0 0 p l 稀释液滴加在上述平板( 含铅量为1 0 0 m g l ) 中央，并立即用无菌玻璃刮刀涂抹均匀。以 上操作需无菌区内进行。接种后移入恒温培养箱中，在2 8 培养1 - 2 天，直到培养基表 面观察到菌落。 用灭菌牙签以无菌操作，从每组平板上挑取1 0 个颜色不问，形态规则的单菌落，植 于装有对应液体培养基( 含铅量为1 0 0 m g l ) 的小试管( 3 m l ) 中，2 8 振荡培养2