基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法课件.ppt

基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法,江西省临床检验中心,应用聚合酶链反应（PCR）技术测定临床标本中的病原体核酸成分，是一种高度敏感，且最为直接的检测手段。由于临床标本中含有蛋白质、脂类等物质，可干扰PCR反应，故在做PCR反应前必须进行核酸提取。,经典的核酸提取方法通常是加去污剂（SDS等）裂解细胞，经蛋白酶处理、有机溶剂提取及乙醇沉淀等步骤。,由于样本的处理及保存对DNA和RNA（尤其是RNA）的影响较大，因此在核酸测定时标本的处理及适当保存对测定结果的准确有效非常重要。,临床常见的标本有血清（浆）、全血、分泌物、棉拭子、脓液、体液、新鲜组织、石蜡切片等，这些临床标本的处理和保存方法各有不同。,临床标本的处理,血清（浆）标本一些病原体，如乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）等的PCR检测常采用血清或血浆标本。,HBV：标本通常由医护人员采集，应注意避免溶血，如为血浆标本注意抗凝剂的选择，一般用EDTA-Na2或枸橼酸纳，不可使用肝素。标本为全血时，及时分离出血浆，提取病毒DNA进行检测。,HCV：检测RNA病毒。由于RNA极易降解，标本的制备和保存方式往往可以影响测定结果。若用血浆标本，应使用EDTA抗凝。严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制作用,且无法在核酸提取过程中去除。抗凝后6小时内分离血浆。如用血清标本，则应尽快（2小时内）分离血清进行检测，或-20oC保存。,全血标本通常用来提取外周血单个核细胞核酸：如基因组DNA、线粒体DNA、总RNA等。抗凝剂：一般使用EDTA-Na2、枸橼酸纳，不使用肝素。,前处理：1）加适量的红细胞裂解液（破膜液），裂解全血中的红细胞。2）再加适量的细胞核裂液（破核液），裂解白细胞中的细胞核，使核内DNA释放出来。3）然后再加SDS（十二烷基硫酸钠）等去污剂，溶解脂蛋白，解聚核蛋白。,SDS可与蛋白质结成复合物，使蛋白质变性沉淀，但SDS在以后的核酸提取过程中必须除去。,痰标本痰属于分泌物，临床上常用作结核杆菌DNA测定样本，由于痰标本中含大量粘蛋白和杂质，故在核酸提取时，一定要对标本进行前处理，即用4%NaOH液化，去除粘蛋白，然后用煮沸或蛋白酶、酚/氯仿等经典法提取DNA。,具体方法：,用无菌平皿取患者肺深部咳出的痰液1-3ml，加入4倍体积4%NaOH，摇匀，室温下放置30分钟左右液化取1.5mlEP管，加0.5ml液化痰液，再加0.5ml4%NaOH室温放10分钟,12000rpm，离心15分钟弃上清，加无菌生理盐水1ml，混匀，12000rpm离心5分钟弃上清，沉淀物用于DNA提取,棉拭子用PCR方法检测性病病原体时（衣原体、支原体、淋球菌、梅毒螺旋体、人乳头状瘤病毒等），临床标本一般为棉拭子。标本取材是关键，衣原体等病原体感染上皮细胞，因此取材一定要取到细胞。,具体方法：,加1ml无菌生理盐水，充分震荡混匀，12000rpm，离心5分钟用棉拭子取尿道分泌物或宫颈分泌物（由医护人员采集），置无菌试管或EP管内弃上清，沉淀加无菌生理盐水1ml，打匀，12000rpm，离心5分钟,同上，重复洗涤一次弃上清，沉淀即可用于DNA提取,5体液体液标本，包括胸水、腹水、脑脊液、尿液等，可直接离心，取沉淀物提取核酸。血性胸腹水，可使用红细胞裂解液处理：,加等体积红细胞裂解液，震荡混匀，置5-10分钟10000rpm，离心5分钟，弃上清可根据情况重复2-3次，沉淀物用于DNA提取,6脓液粘稠脓液：同痰标本处理，先用4%NaOH液化，再离心取沉淀提取DNA。水样脓液：直接离心，沉淀用生理盐水洗2-3次后用于DNA提取。,7组织组织有新鲜组织和石蜡切片。新鲜组织的处理步骤：先用生理盐水洗二次，然后将其捣碎或剪碎（用眼科剪），加蛋白酶K消化后提取核酸,石蜡切片用于核酸提取，需先用二甲苯脱蜡，再用蛋白酶K消化后进行DNA提取。,标本的保存,血清（浆）HBV：分离出的血清（浆）如不立即提取核酸，保存于-20oC待检。HCV：尽快分离血清(浆),如不立即提取RNA，保存于-20oC待检。,长期保存：吸取200l血清，加20uRNasin（RNA酶抑制剂），保存于-70C。已发出结果报告的标本应及时转移至冰箱保存，并由专人负责管理，保存1-2周（时间长短根据报告单上的承诺而定）。,全血标本全血标本如用于DNA提取，可4oC下短期保存（数天），时间长易降解，如用于RNA检测，应在取血后尽快提取RNA。最好将DNA或RNA提取后，置-70oC保存。,痰液化的痰标本如不立即用于核酸提取，可保存于-20oC。处理后的棉拭子、体液、脓液如不立即用于核酸提取，可保存于-20oC。,组织新鲜组织最好保存于50%乙醇中，具体方法：先用生理盐水将组织洗一次，切成小块，加入适量生理盐水，然后边摇边加入无水乙醇至终浓度为50%，这样固定的组织标本室温下可保存数日，4oC可保存6年。,总而言之，标本的保存及适当的预处理对核酸模板的成功提取具有决定性作用。要强调的是，所有用于上述处理的容器如试管或离心管，均应在使用前压灭菌。,2019/12/13,31,可编辑,核酸的提取,核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，核酸提取的主要步骤为：裂解细胞去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。,沉淀核酸纯化核酸，去除盐类，有机剂等杂质,(一)DNA提取的经典方法DNA提取的经典方法，即所谓的酚-氯仿提取法。因为使用两种不同的有机溶剂交替抽提更容易将蛋白除去，提取次序为酚、酚/氯仿（1：1）、氯仿，这种方法提取的DNA纯度高、片段大、效果好，缺点是较为繁琐。,经前处理的标本加入蛋白酶K,摇匀56oC温育1小时,或37oC消化6小时以上/过夜加入等体积饱和酚,充分混匀,12000rpm,离心5分钟将上层水相移至一干净离心管内，加等体积酚/氯仿(1:1)混合液，混匀,12000rpm，离心5分钟取水相，移至一干净离心管内，加等体积氯仿，混匀后12000rpm，离心5分钟取水相，移至一干净离心管内，加2倍体积预冷的无水乙醇，沉淀DNA摇匀，可见白色絮状DNA，置-20oC，30分钟或过夜,12000rpm，离心5分钟弃上清，用预冷70%乙醇洗两次，室温干燥5分钟加适量TE缓冲液或无菌去离子H2O溶解DNA，混匀紫外分光光度仪测OD值，4oC备用,说明：回收上层水相时，一定不要接触两相的界面，以免将蛋白质等物质吸入新离心管。沉淀DNA，无水乙醇是首选的有机溶剂。另：异丙醇、醋酸钠等。,70%乙醇漂洗DNA，是为了去除残余的盐类，去除过量SDS和酚等杂物，因为SDS在70%的乙醇中保持溶解状态，不与DNA共沉淀，从而通过弃上清液去除这种去污剂,避免对以后PCR反应的影响。TE缓冲液：10mmol/LTris-Hcl1mmol/LEDTApH8.5或8,RNA的提取RNA提取条件较DNA要求严格，主要是因为临床标本及实验室环境中，存在大量对RNA有强烈降解作用RNase。RNase是一类生物活性非常稳定的酶类。这种酶耐酸、耐碱、耐高温，如煮沸也不能使之完全失活。,蛋白质变性剂可使之暂时失活，但变性剂去除后，又可恢复活性。除细胞内RNase以外，环境中灰尘、各种实验器皿和试剂、人体的汗液及唾液中均存在RNase，因此在提取RNA时，关键要避免RNase对标本的污染及防止RNase对提取的RNA的降解。,1提取RNA所用器皿的处理及溶液的准备塑料制品：如试管、EP管、Tip头，使用灭菌的一次性用品。,玻璃用品：如烧杯、试管和其他用品，常被RNase污染，使用前必须于180oC干燥8小时以上，或用0.1%DEPC水(焦碳酸二乙酯)浸泡处理。,DEPC是RNase的强抑制剂，作用机制是通过与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。37oC浸泡2小时，然后用灭菌水漂洗数次，于100oC干烤15分钟，去除器皿上残余DEPC。,所需溶液的配制：必须用高压灭菌的水和RNA提取专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，把溶液装入无RNase的玻璃器皿。,严格来说，所有溶液均应用0.1%DEPC于37oC处理12小时以上，然后于100oC加热15分钟或高压灭菌15分钟，去除残余DEPC。,2RNA提取中RNase污染的控制最主要的潜在污染源是操作人员的手，手直接触摸之处毫无疑问会留下RNase，另外，说话带出的唾液也富含RNase，故在涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套和口罩。,实验中，如接触了“脏的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能污染RNase，因此RNA提取实验中，应勤换手套。,RNA提取方法下面以异硫氰酸胍结合氯仿-酚提取法介绍RNA的提取。异硫氰酸胍是一种强用力的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。,RNase虽可耐受多种处理，（如煮沸）而不失活，但却会被4mol/L异硫氰酸胍和-巯基乙醇（破坏RNase蛋白质中的二硫键）等还原剂所灭活，因而可从组织中分离出完整RNA分子。因此上述试剂是制备RNA的常规试剂。,200l血清（浆）加入200l20%PEG60004oC，3小时，12000rpm，4oC离心15分钟弃上清，加500l裂解液（含异硫氰酸胍、-巯基乙醇等），混匀,加50lNaAc，500l饱和酚：氯仿：异戊醇（50：49：1），充分混匀，冰浴10分钟4oC12000rpm，离心5分钟小心吸取上层水相移至一新离心管中，避免吸取两相之间的蛋白质，用氯仿-异戊醇再抽提一次,加2.5倍体积无水乙醇，冰浴30-60分钟4oC12000rpm，离心10分钟弃上清，沉淀用70%乙醇洗二次，65oC烘干用10lDEPC水溶解RNA，并加2uRNasin-20oC保存备用,（三）核酸提取的其他方法(简单介绍):胍盐提取结合二氧化硅吸附法二氧化硅具有特异吸附核酸的特性，异硫氰酸胍可使细胞裂解,因此在高浓度异硫氰酸胍存在下，从细胞(包括细菌)或病毒颗粒中释放出来的核酸成分可以结合在二氧化硅上，利用此特性可提取血液和尿液中DNA和RNA。,2.TRIzol试剂提取RNA方法：TRIzol试剂盒是由GIBCOBRI公司推出的产品，其操作方法简单方便，一小时内即可完成。用TRIzol试剂裂解细胞，再加入氯仿，离心后可见三层，上层为透明的水相含有RNA，中间层含DNA，下层为红色的有机相，含蛋白质。,3.旋转离心柱提取旋转离心柱技术是用于微量核酸分离纯化的较为简单的方法，属于硅吸附方法的一种，市场上的离心柱虽各有特色，但在原理上通常可分为三个部分：利用裂解