（环境科学专业论文）利用斑马鱼胚胎发育技术对芳香胺染料中间体以及染料的致毒机理和致畸性的研究.pdf

利 用 斑 马 鱼 胚 胎 发 育 技 术 对 芳 香 胺 染 料 中 间 体 以 及 染 料 的 致 毒 机 理 和 致 畸 性 的 研 窒 9 9 硕史淑洁 第一章 前言 近几十年来，我国的染料工业迅猛发展，已经成为染料生产大国。然而， 目前我国整个染料行业的现状是:生产布局分散、规划失控、污染严重，其中 以染料工业废水污染最为突出。特别是一些小型企业生产工艺落后，对排放的 废水缺乏实用有效的治理技术，绝大多数废水未经处理直接排入水体，造成了 严重的环境污染。 染料废水是典型的高浓度难降解有机废水，其中不仅含有大量的有机污染 物，而且还含有浓度相当高的无机盐。这类废水有的难以生物降解，有的甚至 具有生物毒性。如不加以处理直接排放，势必会对水源、土壤等环境造成污染。 染料废水数量庞大、成分复杂、浓度高、色度深、难降解，而且水质水量波动 大，忽视染料污水的毒性，无疑会对以人和生物为主要对象的环境保护的目的 带来极大的隐患。 国际上早在 8 0年代初期就制定了 针对化学品生物毒性效应的一系列标准和 工作指南，如美国环保署 ( u s , e p a ) 、国际经济与发展组织 ( o e c d )及德国标 准研究所 ( d i n ) 都 颁布了 一 整 套毒 性测 试的 方法 2 0 1严 格规定了 对生物的“ 无 害效应浓度 ( n o e c )” 。在此基础上，也陆续制定了针对判断污水毒性的标准方 法1 8 , 2 2 。到目 前为止，除了传统的鱼类和大型蚤急、 慢性实验， 应用最多的是 发光细菌法 ( m i c r o t o x ) 和毒性鉴别评价技术 ( t i e ) 。但由于这两种方法的某 些局限 性， 如发光细菌法灵 敏度比 传统的鱼类半致死浓度 ( l c 5 0 ) 低 1 -2个数 量级，而且菌种不易保存;而 t i e技术过分繁琐，耗时较长，而且技术尚不完 善。传统毒性测定方法的指标过于简单，应用范围受到很大的限制。而胚胎毒 性试验恰恰可以弥补这些缺陷，另外考虑到动物伦理学方面的因素，也促使我 们必须加快胚胎毒性试验方法的开发。 我们尝试将斑马鱼胚胎毒性实验作为急性毒性实验的一种替代手段，测定 了九种禁用二胺类染料中间体和七种染料的胚胎毒性和致畸性，以期可以初步 判断化合物的毒性效应类型及毒性大小，为综合污水的生态风险评价提供毒理 学依据。 型 型 丝 遵 $ 燮#x 巡丝lsc 竺id7 4 竺竺竺丝 1 . 1 . 3分 子 发育 生 物 学 研究 模型 的 历史 和发 展 9 9 硕史淑洁 果蝇 ( d r o s o p h i l i a ) 和线虫( c a e n o r h a b d i t i s e l e g a n s ) 作为无脊椎动物发 育生物学研究的模式种已开创了分子发育生物学的基础。这两个物种之所以成为 模型，其主要原因在于它们能够将胚胎学和遗传学强有力地结合起来。然而脊椎 动物中却一直没有找到这样地模式系统。鼠类由于其胚胎深埋在母体子宫内而无 法进行胚胎学观察:爪蟾 ( x e n o p u s l a e v i s )则因繁育太慢难以成为遗传研究的 选材。因此，具有繁育力强、体外产卵、体外受精且胚体透明等生殖特性的鱼类 自然成为发育生物学的首选研究对象。 美国 俄勒冈大学己故的著名遗传学家g e o r g e s t r e i s i n g e :首先被斑马鱼快 速的繁殖周期和极强的产卵能力所吸引，并于 1 9 8 1年在 n a t u r e ) 上发表了有 关于斑马鱼人工雌核发育的研究成果。与此同时， c h a r l e s k i m m e l 发现了斑马鱼 另一个对胚胎发育生物学研究极为有力的优点胚体透明且发育迅速。遗传学 和胚胎发育生物学的结合使斑马鱼很快成为理想的 研究材料 3 a , v ) 继俄勒冈大学斑马鱼研究中心的成立之后，到 1 9 9 0年，世界上已有十多家 发育生物学实验室开始采用斑马鱼作为研究对象。 1 9 9 4 年5 月， 几千尾突变体从 德、美两家实验室被筛选出来，第一个斑马鱼基因连锁图的发表以及冷泉港集会 的召开宣告了鱼类分子发育生物学研究的新时代的到来，斑马鱼已经完全具备作 为脊椎动物分子发育生物学甚至人类基因组计划模式种的条件 3 ， 。 1 . 2斑马鱼胚胎发育技术及其优势 在水生毒理学中，鱼类急性实验是一种测定化学物质对水生脊椎动物影响的 标准方法。 根据o e c d 指南n o . 2 0 3 c 可将急 性毒性试验分为两部分， 第一部分是 对有效浓度进行筛选，5 个浓度，每个浓度 1 0条鱼:第二部分用6 0条鱼来完成 主体实验。 这就意味着每个实验至少需要1 2 0 条鱼。 用来描述成鱼急性毒性的l c 5 是唯一的记录数据，并为对亚致死效应进行评价。而由l c ; 所得到的生态毒理学 信息不足以支持对慢性效应的正确推断。另外，伦理因素也要求用别的方法来替 代成鱼实验。而胚胎试验因其敏感度高、实验周期短等优点成为最佳的替代方法 之一。 利 用 斑 马 鱼 胚 胎 发 育 技 术 对 芳 香 in 9l 1 0+ 中 回 协 旦 型燮塑堕鲤墅些些竺些 9 9硕史淑洁 3 . 3 有机试剂 大量有机试剂山于其在环境中广泛存在性，更加成为毒理学工作者的研究重 点， 斑马鱼胚胎胚胎技术更是得到了 广泛的 应用 2, 1 ( 表1 . 5 ) 0 表1 . 5 有机试剂的斑马鱼胚胎毒性试验结果 有机试剂 4 8 h l c s o ( m o l几) 澳化十六碳炕基_ 三 甲胺 ( h e x a d e c y l t r i m e t h y l a m m o n i u m b r o m i d e ) 3611121520肠404156 2 , 4 一 二 硝基苯酚 ( 2 ,4 - d in it r o p h e n o l ) 4 - 苯胺 ( 4 - a m i n o p h e n o l ) 丙 烯醛 ( a c r o i e i n ) 3 . 5 一 二氯苯酚 ( 3 , 5 - d i c h l o r o p h e n o l ) 3 , 4 一 二氮苯 胺 ( 3 , 4 - d i c h l o r o a n i l i n e ) 十二烷基磺酸钠 ( s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e ) 2 , 6 一 二抓苯胺 ( 2 , 6 - d i c h l o r o a n i l i n e ) 4 - 硝基苯酚 ( 4 - n i t r o p h e n o l ) 2 , 4 , 6 - -氯苯 胺 ( 2 , 6 - t r i c h l o r o a n i l i n e ) 对苯二酚 ( h y d r o q u i n o n e ) 卜日八 卜hqnq 匕行了11，1 四水合硝酸铬 ( c a d m i u m n i t r a t e . 4 h 2 0 ) 2 , 4 - -抓苯酚 ( 2 , 4 - d i c h l o r o p h e n o l ) i 一 辛醇 ( 1 - o c t a n o l ) 2 , 4 - -氯苯胺 ( 2 , 4 - d i c h l o r o a n i l i n e ) 9钊乙. q口5 .月匕1 3 - 氛苯胺 ( 3 - c h l o r o a n i l i n e ) 4 - 硝基苯甲酸 ( 4 - n i t r o b e n z o i c a c i d ) 7月1 了了 下止11 2 - 硝基苯胺 ( 2 - n i t r o a n i l i n e ) 次氮基二乙酸 ( n i t r i l o t r i a c e t i c a c i d ) 1 0 利 用 斑 马 鱼 胚 胎 发 育 技 术 对 芳 香 胺 染 料 中 间 1生 vj 些 4 6 竺 到1,t n 鲤丝9 h 6 fn 9 9 硕史 淑洁 d月n门 q口0 ic乙 4 - 氯苯胺 ( 4 - c h l o r o a n i l i n e ) 2 - 氯苯胺 ( 2 - c h l o r o a n i l i n e ) q乙un 八n污了 00 苯甲 酸 ( b e n z o i c a c i d ) 4 - 氯苯酚 ( 4 - c h l o r o p h e n o l ) 5q 门0卜u 乙且左u 2 一 乙基- 1 一 己醉 ( 2 - e t h y l 一 1 - h e x a n o l ) 苯酚 ( p h e n o l ) 2 , 6 一 二甲基一 4 一 庚酮 1 2 3 0 e d t a - -钠盐 ( d i s o d i u m s a l t ) 1 3 6 0 苯胺 ( a n i l i n e ) 1 5 6 0 2 一 甲基吠喃 ( 2 - m e t h y l f u r a n ) 51 2 0 1 , 2 一 乙二胺 ( e l t h y l e n d i a m i n e ) 6 3 2 0 4 , 6 一 二硝基一 。 一 甲 酚 ( 4 , 6 - d i n i t r o - o - c r e s o l ) 0 . 0 3 6 有机试剂 ( o r g a n i c r e a g e n t ) 9 6 h l c :. ( m o l / l ) n 一 甲胺 ( n - m e t h y l a m i n e ) n , n - -甲胺 ( n , n - d i m e t h y l a m i n e ) 2 - 氨基乙醉 ( 2 - a m i n o e t h a n o l ) 异丙胺 ( i s o p r o p y l a m i n e ) n 一 甲基苯胺 ( n - m e t h y l a n i l i n e ) n , n 一 二甲基苯胺 ( n , n - d i m e t h y l a n i l i n e ) 苯醒 ( q u i n o n e ) 氯乙醛 ( c h l o r o a c e t a l d e h y d e ) 环己醇 ( o y c l o h e x a n o l ) . 3 . 4 多元混合物 另外，斑马鱼胚胎技术还被应用于测定多元混合物对胚胎发育、种群繁殖的 影响。o b e r e m m等人 2 . in ， 的研究表明，纯微藻素对鱼卵没有急性毒性，而蓝藻 1 l film 里 丝 些 丝 竺 燮 丝 ijsc 塑 型 些 竺 竺 进 初步提取物可以增加毒素的吸收， 从而增加了毒性， 导致了 斑马鱼胚胎生长抑制、 畸形和高死亡率。 另外， 当微藻素- l r 的染毒浓度为5 0 u g / l 时， 成鱼活动显著减 少， 产卵活动及其成功率也会降低。磨香酮对斑马鱼的繁殖和早期幼鱼的存活都 有负面 作用 4 ， 。 对3 , 4 - :. 氯苯 胺 / 林丹二 元 混 合 物 n . 4 9 毒性 研究的 结果表明 暴露 时间和开始暴露生命阶段都会对繁殖毒性产生影响。 染毒铜络合物 s . 川也会延迟 斑马鱼胚胎的发育和孵化。近年来，国内外的学者已经尝试将斑马鱼胚胎发育技 术应用于综合污水毒性监测，并发现斑马鱼胚胎的高敏感性和多指标性符合综合 污水毒性测定的要求 卜 j j 。 此外，修瑞琴 ” 、们 对化工沉积物、 脱和苯脱的 研究则进一步证明，与海洋 生物卤虫技术、河口生物美丽猛水蚤技术、淡水生物大型蚤技术及斑马鱼成鱼技 术相比，斑马鱼胚胎技术具有最高的敏感度，是一个能够反应毒物对鱼类长期效 应的快速实验技术，值得推广。 1 . 4选题意义 直接染料具有黄、橙、红、紫、蓝、棕、灰、黑各种颜色，是色谱最齐的一 类染料，具有应用方便，合成简单，价格低廉等优点。直接染料可用于针织、丝 绸、 棉印染、线带、皮革、毛麻、巾被及造纸等行业，用途十分广泛。作为当今 使用频率最高、 应用范围最广的染料， 研究和掌握直接染料的生态毒理特性具有 至关重要的意义。 直接染料在生态毒理方面的一个致命伤则是结构中的致癌芳香胺问题。众所 周知， 任何芳香胺都是有毒的，只是毒性大小不同而已。随着芳香胺类中间体生 产的发展和科学技术的进步，本世纪初，关于芳香胺类中间体的生产和应用会导 致膀肤癌即见诸报道。1 8 8 9 年， 德国人第一次提出蔡胺是致癌的因素。 此后， 关 于芳香胺的致癌性问题日益引起世界各国的关注，并进行了大量的研究。直至 1 9 5 4 年， 通过对大量膀肤癌患者统计数字的研究， 人们才证实2 -禁胺、 联苯胺、 4 一氨基联苯、1 一蔡胺、联氯苯胺、乙烯亚胺等均属于致癌性物质，1 一氨基一2 一蔡酚、联大茵香胺、 硫酸二甲醋为可疑性致癌物质 涌 10 其中，联苯胺系中间体的整个共辆系统各原子团处于同一平面上，从而显示 吟呼塑 哩 丝 暨 坐 翌 竺 些 鲤 些 四 丝 塑 二 一 一 99 w m ya 出最大的共辘效应。用联苯胺系作为中间体合成的染料染色深度好，是合成染料 的重要中间体。 7 0 年代初， 联苯胺成为第一只遭到指控并宣布为能产生环境性膀 肤癌的致癌物的芳香族二胺类化合物，致膀肤癌的潜伏期长达 1 0 -2 0年。而联 甲苯胺和联大茵香胶的毒性相当于 联苯胺的二十分之一，在身体中的致癌潜伏期 比联苯胺长 1 0倍。所以当联苯胺遭到禁用的同时，联甲苯胺和联大茵香胺作为 联苯胺的代用品被广泛的应用。 随着科学技术的进步，人类环境保护意识和自身保护意识的强化，芳香胺类 中间体的致癌性在9 0 年代被再次提出。 1 9 9 4 年， 德国a m a k 委员会按m a k 分类法 ( 5 a ， 将2 2 种禁用中间体分为两大类; ( 1 )肯定对人体致癌的芳香胺类中间体 ( 川 a i ) 共计四个品种。 ( 2 )怀疑对动物致癌的芳香胺类中间体 ( 川 a l l )共计1 8 个品种，其中属于二 胺类化合物者有9 个，即 a 联苯胺:联苯胺国内有生产。尽管化工部三令五申，国内仍有生产和应用， 主要集中在乡镇企业和民营企业，个别合资企业也有用它生产染料的。联苯 胺大量用于直接染料，合成品种多，产量大， 其中一些重要品种应用广泛， 影响较大;少量用于酸性染料、硫化染料等，也用于医药及化学试剂。 b .聚甲苯胺:聚甲苯胺国内大量生产。主要用于直接染料，品种多，产量大， 自8 0 年代以来已经成为联苯胺的主要代用品种。 少量用于酸性染料、 有机颜 料、冰染染料、活性染料等，其试剂级产品是钻、铜、铬等金属的测定剂， 也可用作氧化还原指示剂和测定水分的试剂。 c .联大茵香胺 接铜盐染料 联大茵香胺国内大量生产，主要用于直接染料，尤其是用于直 少许用于有机颜料、冰染染料、活性染料等，并用它测定金、 铜、钻，钒等元素。 d . 联氯苯胺: 联氯苯胺国内大量生产， 国内不用于染料， 主要用于有机颜料( 黄、 橙色品种) 。用量很大，难以替代。 利 用 斑 马 鱼 胚 胎 发 育 技 术 对 芳 香 胺 染 料 中 ial 1奎 一丛望鲤竺塑竺哩燮巡哩 9 9 硕史淑洁 f . 4 , 4 一 二氨基二苯甲烷:国内无生产。 f . 4 , 4 一 二氨基一3 , 3 - 7 _ 甲基二苯甲 烷:国内 有几家厂家生产。 g . 4 , 4 一 二 氨基一3 , 3 一 二 飞 氯二苯甲 烷:国内 有生产。 它本身即硫化剂m o c a 。本品 用作浇注型聚氨醋橡胶的硫化剂，聚氨酷涂料和粘合剂的交联剂，也可用于 固化环氧树脂。 h . 4 , 4 一 二氨基二苯4 醚:国内 有生产。主要用于聚酞亚胺树脂、 环氧树脂的原料和交联剂，也可用于直接染料和酸性染料，8 0 胺的代用品用于染料生产。 聚酞胺树脂、 年代作为联苯 在德国 政 府1 9 9 4 年公 布的1 工 8 种禁用染料 4 6 中 ， 涉及到含有二胺化合物的 染料共计8 4 个，其中直接染料占7 3 种，酸性染料8 个，冰染染料3 个。所涉及 的二胺类化合物有联苯胺.联甲苯胺、联大茵香胺和联氯苯胺，各种二胺化合物 合成的禁用染料品种的详细分布情况如下表。 表 1 . 6各类禁用染料中间体分类表. 直接染料酸性染料冰染染料小计 联苯胺 .1 7 4 1 4 2 联甲苯胺1 9 联大茵香胺1 6 聚氯苯胺 小计 本次研究的对象为联苯胺、3 , 3 一 二氯联苯胺，3 , 3 一 二甲 基联苯胺、 3 , 3 一 二 甲氧基联苯胺、3 , 3 一 二甲基- 4 - 氨基一 偶氮苯、 4 - 氯联苯胺、4 , 4 ， 一 亚甲基二苯胺 4 , 4 一 亚甲 基一二临氯胺、 4 , 4 一 亚甲 基一二临甲 胺等9 种禁用的芳香胺类染料中 间体，以及直接深棕m 、直接黑( ; 、直接耐晒黄r s 、直接湖兰5 b 、直接耐晒大红 4 b s 、直接黄棕 d 3 g 、酸性媒介棕r h 等7 种染料。 本论文以联苯胺类化合物，和与之相关的染料产品为实验对象，选用斑马鱼 1 4- 利 用 斑 马 鱼 胚 胎 发 育 技 术 对 芳 香 胺 染 料 中 间 休 以 及 染 料 的 致 毒 机 理 和 丝 呻 丝 的 竺 多 9 9 硕史 淑洁 受精卵作为试验材料， 通过观察在胚胎发育期间染毒所导致斑马鱼鱼卵发育形态 上的变化及最终孵化率的减少得到胚胎毒性数据，分析各类物质的具有代表性的 毒性效应表征及特定的毒性作用时间，填补有毒染料及其中间体的水生生物毒性 资料的短缺，为制定安全的环境影响浓度，并对其进行妥善的风险评价和管理提 供毒理学依据。并以寻求污染物理化特性或类型与胚胎发育指标之间的对应关 系，由此判断复合污染的致毒机理，以及致畸作用机制为预期目标。 利 用 斑 马 鱼 胚 胎 发 育 技 术 对 芳 香 胺 染 料 id 竺竺塑塑全丝些鲤竺1: 9 h 巡 9 9 硕史淑洁 第二章 九种芳香胺染料中间体的单一毒性研究 芳香胺类化合物是树脂、橡胶、染料等产品的生产原料或中间体，在化工合 成中有着广泛的应用。它对环境造成污染主要通过生产过程的泄漏、工业废水的 排放以及印染织物的漂洗等过程进入环境体系。芳香胺类化合物对哺乳动物的致 癌性己经得到证实，但其对水生尘物的毒性研究还比较缺乏，这部分工作急待加 强。 因此，我们利用斑马鱼胚胎发育技术研究了联苯胺、3 , 3 联苯胺 ，3 , 3 一 二甲基联苯胺、3 , 3 一 二甲氧基联苯胺、 一 二氯 一 二 甲 基一 4 - 氨基一 偶氮苯、 4 - 氯联苯胺1 4 , 4 一 亚甲基二苯胺 4 , 4 一 亚甲基 一二临氯胺、4 , 4 一 亚甲基一二临甲胺的胚胎毒性和致畸性。 2 . 1仪器与试剂 n 2 8 6 7自 动控光控温水族箱二 缸外过滤机:广东日生集团有限公司; c k 4 0 - f 2 0 0 倒置显微镜:日 本奥林匹斯有限公司: 1 6 0 x 双目 立体显微镜:北京电子光学设备厂; n u n c多孔细胞培养板:丹麦n a l g e n u n c i n t e r n a t i o n a l ; s h p - 2 5 0 g 光照培养箱:天津天宇机电有限公司 实验仪器冻干设备分公司; 钻石牌机械秒表 ( 测量心率) :上海秒表厂; s t e p p e r 4 1 1 可调节连续加样移液枪:瑞士 s o c o r e x ; 自 制的鱼卵收集器:玻璃缸 ( l xw xh = 3 0 c m x 1 8 c m x 6 c m ) ，上盖孔径为 3 m m 的不锈钢丝网，网上固定玻璃或塑料的植物仿造物作为产卵的诱导物; 用来收集卵的吸液管，以及用来准备不同浓度试液和稀释水的玻璃器具 ( 烧 杯，量筒，有刻度的量筒及移液管) 。 利 用 斑 马 鱼 胚 胎 发 育 技 术 对 、 香 iris ;l史 n 翌 鲤巡 燮 竺些巡些些型些塑 9 9硕史淑洁 4 -氨基联苯、 联苯 胺、 3 , 3 一 二甲 基联苯胺 ( 联大茵香胺) 、 3 , 3 一 二氯联苯胺 ( 联氯苯胺) 、 3 ,3 一 甲氧基联苯胺、 4 ,4 一 亚甲 基一 二苯胺、 4 ,4 一 亚甲基一 二氯苯胺、 4 ,4 一 亚甲 基一 二邻甲 服、 3 ,3 一 二甲基 - 4 - 氨基偶氮苯， 均为分析纯， 国际化学品编号 及结构式见表21 o2 a . 表2 . 1 待测芳香胺化合物的名称、化学编号和结构式. 化 合物 4 一氨基联苯 化学品编 号 结构式 c a s n 0 . 9 2 一 67 一1 nh 2 联苯胺c a s n 0 . 9 2 一 8 7 一 5 3 , 3 一 二甲基联苯胺c a s n 0 . 1 1 9 - 9 3 一 7 3 , 3 一 二氛联苯胺c a s n 0 . 9 1 - 9 4 - 1 3 , 3 一 甲氧基联笨c a s n 0 . 1 1 9 - 9 0 - 4 胺 4 , 4 一 亚甲基一 二苯c a s n 0 . 1 0 1 一 7 7 一 9 胺 -4 , 4 一 亚甲基一 二氯c a s n 0 . 1 0 1 - 1 4 - 4 苯胺 4 , 4 一 亚 r甲基一 _ _ c a s n 0 . 8 3 8 一 8 8 一 0 邻 甲 胺 nh2 nh2 h 3 c qoc h3 h z nnh2 nh 2 nh 2 nh 2 3 , 3 一 二甲基- 4 - 氨 基偶 氮 苯 c as n 0. 97 一 5 6一 3 1 7 利 用 斑 马 鱼 胚 胎 发 育 技 术 对 芳 香 胺 染 料 中 间 体 以 及 一毕 空 丝望鲤兰些塑些壑些 9 9 硕史 淑洁 2 . 2斑马鱼胚胎毒性实验 为了尽量避免实验过程中自来水中所含物质干扰实验结果，整个实验过程中 的实验用水，包括稀释水和清洁用水，均为统一配制、充氧饱和、温度保持 2 6 士1 恒定的重组水。我们参照 工 s o 标准7 3 4 6 / 3 ，并根据实际本地水质来配制重 组水，具体组分见表 2 . 2 0 表2 . 2 i o o o m l 重组水中各组分的含量( m g ) 和硬度( c a c 0 3 m g / l ) m 9 s 0 a . 7 h 2 0 c a c i , . 2 h 2 0 k c i硬度 61 . 6 1 4 72 . r 3 6 . 2 5 8 . 3 4 6 9 本实验采用斑马鱼受精卵作为实验材料。将成年斑马鱼 ( 雌雄鱼数量比约为 1 : 2 ) 饲养在经活性炭过滤并充分曝气的水体内， 水温保持在 2 6 11 左右， 最佳 p h 值控制在8 左右，总硬度为6 8 m g / l( 以c a c o 。 计) 。每日 喂食2 次经过消毒处 理的冷冻红线虫，并辅助混合干饲料以增加产卵量。光照/ 黑暗周期控制为 1 4 h : 1 0 h 。为了防止成鱼掠食鱼卵，用不锈钢丝网覆盖收集器， 将塑料水草固定 在钢丝网上作为产卵基质。 每天开灯之前将收集器放入缸内，给光3 0 m i n 内完成 交配和产卵， 一小时后将鱼卵收集器取出。 用重组水迅速清洗鱼卵以除去残留物， 用于进行毒性试验。 按 照t 1 a g e l x.; . 2 ， 等 人 的 长 期 研 究 和o e c d指 南 a 1 设 计 胚胎 毒 性 试验。 用 立 体显微镜挑选发育正常的受精卵进行实验。未受精卵 ( 不分裂) 、分裂时呈明显 的不规则 ( 不均衡，水肿) ，或是卵壳损伤的拣出丢弃。选用2 4 孔细胞培养板作 为染毒器具，实验时每孔加入 2 m 1 试液，放一枚受精卵。每个 2 4 孔细胞培养板 为一个实验浓度组，其中4个孔为空白对照，其余 2 0孔为同一实验浓度。用胶 带密封以避免蒸发改变实验浓度。将密封好的多孔板放在温度为 2 6 11 的光照 培养箱中孵化。 由于化合物作用时间，作用靶器官各不相同，对于一些化合物，必须在受精 卵 产出 后马上进行实验，即。 h p f ( h o u r s p a s t f e r t i l i z a t i o n ) 染毒实 验的基础上， 补充 不同发育时间段的染毒实验， 例如6 h p f ( 即原肠胚期) 、 2 4 h p f ( 心跳、 血液循环 竺 鲤 至 坐 些 追 些 竺 于些 竺 些 竺 哩 鲤 鲤 发 育 时 期 ) 染 毒 实 验 ， 以 便 进 一 步 分 析 毒 物 作 用 模 式 在 倒 置 显 微 镜 下 观 察 胚 胎 发 育 ， 纪 录 发 育 过 程 中 具 有 代 表 性 的 毒 理 学 终 点 ， 用 浓 度对 数一 概率 单 位法 计 算e c ;, l c 二 等 毒 性数 据。 具体实验设计参见f 面列表2 . 3 : 测试化合物 o h p f 染毒实 验6 h p f 染毒实 验2 4 h p f 染毒实 验 4 一氨荃联苯 联 苯 胺 3 , 3 一 二 甲基联 苯胺 3 , 3 一 二氯联苯胺 3 ， 3 一 二甲氧基联苯胺 4 , 4 一 亚甲基一_ 苯胺 4 , 4 一 亚甲基一 _氯苯胺 4 , 4 一 亚甲基一 二邻甲胺 3 , 3一 二甲基- 4 - 氨基偶 氮 苯 2 . 3九种芳香胺胚胎毒性实验结果 1 ) 联苯胺 . 马上染毒试验 ( 0 . 7 , 1 . 7 5 , 3 . 5 , 7 . 0 , 1 7 . 5 m g / l ) 6 h影响正常卵裂的 e c ; 1 = 9 . 6 2 m g / l ; 1 2 h影响原肠胚正常发育的 e c ; - 1 2 . 3 0 m g / l ; 联苯胺对胚胎 1 2 -2 4 h内 体节、眼点以 及主 动活动等发育几乎 没有显著影响; 3 2 h 未形成正常血液循环的e c . , 1 3 . 1 5 m g / l ; 4 8 h 影响色素正常发 育的 e c . 8 . 6 2 m g / l ;影响 5 8 h胚胎孵化率的 e c .;1 9 . 1 4 m g / l ; 7 2 h胚胎畸形率 e c w = 1 3 . 7 9 m g / l .1 3 . 7 9 m g / l o 利用斑马鱼胚胎发育技术对 香 胺 染 料 中 间 体 以 及 染 料 的 致 毒 机 理 和 0 014 性 的 竺 9 9 硕史淑洁 . 2 4 h p f 染毒试验 ( 3 . 5 , 7 . 0 , 1 4 . 0 , 1 7 . 5 , 2 1 . 0 m g / l ) 由于化合物对胚胎前2 4 h 的发育影响并不显著，所以补充 2 4 h 染毒试验。影 r m 3 2 h 血液循环形成、 4 8 h 色素细胞发育、 5 8 h 孵化率的e c 、 分别为 1 8 . 9 4 , 1 3 . 9 0 , 4 . 1 5 m g / l ; 7 2 h 各组的孵化率均达到 1 0 0 % e 综合两组实验结果，联苯胺对斑马鱼胚胎发育毒性试验的最敏感指标为 4 8 h 黑色素细胞的发育以及 5 8 h 胚胎孵化率，马上染毒毒性效应最强。 2 ) 3 , 3 ， 一 二甲氧基联苯服 . 马上染毒试验 ( 0 . 4 2 , t , 0 5 , 2 . 1 , 5 . 1 5 , 1 0 . 3 m g / l ) 6 h影响正常卵裂的 e c , ,= 2 . 7 7 m g / l ; 1 2 h影响原肠胚正常发育的 e c m = 1 0 . 2 2 m g / l ;对胚胎 1 2 h俊尾巴、 眼点、 耳石、 血液循环以 及色素细胞的发 育几乎没有显著影响; 影响5 8 h 孵化的e c 阅 4 . 9 7 m g / l ， 而7 2 h 时各浓度组与对照 组的孵化率基本不存在差异;7 2 h 最高浓度组的死亡率不超过2 5 % a 3 ) 3 , 3 一 二甲基联苯胺 . 马上染毒试验 实验浓度为 ( 2 . 1 6 , 4 . 3 2 , 6 . 4 8 , 8 . 6 4 , 1 0 . 8 0 m g / l ) , 8 h影响外包活动的 e c . , 6 . 5 8 m g / l ; 2 4 h 时， 浓度) 4 . 3 2 m g / l 的试验组2 0 s 内的主动活动显著减少， 2 4 h l c . , 7 . 4 6 m g / l ; 3 2 h 时， 浓度) 8 . 6 4 m g / l 的 试验组内 幸存的胚胎1 0 0 % 出 现血 液循环障碍， 但对心律没有显著影响; 4 8 h 时低浓度 ( 2 . 1 6 和4 . 3 2 m g / l ) 明显刺 激色素细胞发育， 影响色素细胞发育的 e c ;5 . 9 9 m g / l , 4 8 h l c ; = 6 . 6 3 m g / l ; 7 2 h 各组 ( 包括对照组)的胚胎孵化率均低于 7 0 % ，无明显差异。 . 6 h p f 染毒实 验 实验浓度为 ( 5 . 4 0 , 1 0 . 8 0 , 1 6 . 2 0 , 2 1 . 6 0 , 2 7 . 0 0 m g / l ) , 8 h 影响外包活 动的e c .; = 7 . 5 6 m g / l ; 2 4 h 时，浓度)1 0 . 8 0 m g / l 显著影响主动活动、眼点、尾巴 的发育;对 3 2 h 血液循环的发育影响显著，浓度)1 0 . 8 0 m g / l的染毒组内的胚胎 - 2 0- 利 用 斑 马 鱼 胚 胎 发 育 技 术 对 芳 iyu 担 些业迷丝些塑s 堕n 1 巡些 9 9 硕史淑洁 心律显著减慢; 4 8 h 影响色素细胞发育的e c w 1 5 . 3 1 m g / l , 浓度)1 6 . 2 0 m g / l 的染 毒组内出现水肿畸形的胚胎数量显著增加;了 2 h 低浓度组 ( 5 . 4 0和 1 0 . 8 0 m g / l ) 明显刺激孵化，影响孵化率的e c ; = 1 5 . 9 0 m g / l o 综合两组实验结果， 3 , 3 一 三甲基联苯胺斑马鱼胚胎毒性试验的最敏感的作用 指标为8 h 外包活动和 4 8 h 色素细胞发育，而不同的染毒时间基本不影响最终得 到的毒性数据，也就是说 斑马鱼胚胎对 3 , 3 一 二甲基联苯胺并没有特定的作用时 间。 4 ) 3 , 3 ， 一 二氯联苯胺 . 马上染毒实验( 0 . 2 , 0 . 4 , 0 . 8 , 1 . 2 , 1 . 6 m g / l ) 各染毒浓度对1 . 5 h 的卵 裂均无显著影响: 影响8 h 外包形成的e c . 0 . 7 9 m g / l ; 对于2 4 h 后幸存胚胎尾巴 和眼点的 发育几乎无影响， 2 4 h l c . 0 . 7 7 m g / l ; 3 2 h 时， 浓度- o . 8 m g / l的 试验组内 幸存胚胎出现血液循环障碍的显著增加; 4 8 h时对色 素细胞和心律的发育无影响， 但出现水肿现象:影响5 8 h 孵化的e c . = 0 . 4 4 m g / l , 染毒组成功孵化的幼鱼伴随色素细胞发育不良 得现象。 . 6 h p f 染毒实验 ( 0 . 2 , 0 . 4 , 0 . 8 , 1 . 2 , 1 . 6 m g / l ) 因为3 , 3 一 二 氯联苯胺对斑马鱼胚胎前2 4 h 的发育并无显著影响， 所以 补充 6 h 染毒实验。各染毒浓度对原肠胚的形成，眼点、尾巴、主动活动、血液循环、 心率的发育均无显著影响; 4 8 h 黑色素细胞发育的e c ., - 2 . 0 9 4 m g / l ; 7 2 h 胚胎的孵 化率均超过8 0 % ，成功孵化的胚胎中出现多头和尾鳍畸形的个别情况. 综合两组实验结果 标为卵裂活动和孵化率 ， 3 , 3 - -氯联苯胺斑马鱼胚胎毒性试验的最敏感的作用指 马上染毒毒性效应最强。 5 ) 4 , 4 一 亚甲基三苯胺 . 马上染毒实验 ( 0 , 0 . 7 4 , 2 . 2 2 , 4 . 4 4 , 8 . 8 8 , 1 7 . 7 6 m g / l ) 4 h 影响囊胚形成的e c .;5 . 2 6 m g / l ; 8 h 影响外包发育的e c .r ,- 5 . 5 3 m g / l ; 2 4 h 利 用 斑 马 鱼 胚 胎 发 育 技 术 对 芳 香 胺 染 科 中 r 1奎 些 圣 翌丝竺醚哩型鲤些塑竺 9 9 硕史 淑洁 尾部不延展的e c ; , 4 . 5 7 m g / l ; 3 2 h 时浓度蕊8 . 8 8 m g / l 对心律基本没有影响;4 8 h 影响色素发育的 e c . = 7 . 7 8 m g / l ,最高浓度也不影响心律;7 2 h影响孵化的 e c ; = 1 . 2 0 m g / l , 浓度) 2 . 2 2 m g / l 时孵化的鱼苗 偶尔出现脊柱弯曲的现象。 . 6 h p f 染毒实验 ( 0 , 2 . 2 2 , 6 . 6 6 , 1 3 . 3 2 , 1 4 . 8 , 1 9 . 9 8 m g / l ) 2 4 h 尾部不延展的e c ; = 5 . 3 0 m g / l ， 最高浓度组对眼点的发育和主动活动略有 影响;浓度多1 3 . 3 2 m g 八 的实验组内3 2 h 血液循环发育和4 8 h 影响色素发育明显 受到抑制，基本不影响心律:7 2 h 影响孵化的e c m = 7 . 9 2 m g / l ，最高浓度组出现水 肿胚胎。 对比两组实验结果，我们不难发现 4 , 4 一 亚甲基二苯胺斑马鱼胚胎毒性试验 的最敏感的作用指标为2 4 h 尾部延展发育缓慢，7 2 h 孵化率。不同的染毒时间对 毒性强弱的影响不大，也就是没有特异性的毒性效应时间。 6 ) 4 , 4 一 亚甲基一 二 邻氯胺 . 马上染毒试验 ( 0 , 0 . 2 3 , 1 . 1 5 , 2 . 3 , 4 . 6 , 9 . 2 m g / l ) 4 h 影响囊胚形成的e c ; = 6 . 1 7 m g / l ;浓度超过 1 . 1 5 m g / l 显著影响8 h 外包活 动， 2 4 h 主动活动，眼点及尾部的发育:最低浓度 ( 0 . 2 3 m g / l ) 也会抑制3 2 h 血 液循环的发育， 对心律没有显著影响; 4 8 h 时浓度= 2 . 3 m g / l 的染毒组内出现水肿、 色素缺乏等发育缺陷， 对心律没有显著影响;影响7 2 h 孵化率的e c . 0 . 3 4 m g / l a . 6 h p f 染毒试验 ( 0 , 1 . 1 5 , 2 . 3 , 4 . 6 , 6 . 9 , 9 . 2 m g / l ) 2 4 h l c . = 9 . 3 4 m g / l ; 3 2 h影响血液循环的 e c . = 1 . 8 8 m g / l ; 4 8 h出现水肿的 e c ; , 2 . 4 7 m g / l , l c ; = 4 . 0 9 m g / l o 对比两组实验结果，我们不难发现 4 , 4 一 亚甲基二邻氯胺的斑马鱼胚胎毒性 试验的最敏感的作用指标为3 2 h 血液循环和4 8 h 出现水肿的现象， 6 h p f 开始染毒 毒性更强。 利 用 斑 马 鱼 胚 胎 发 育 技 术 对 芳 香 !依 染 料 中 间 1垫 丛夔塑竺塑垄竺堕鱼鲤丑 9 9 硕史淑洁 7)4 ， 4 一 亚甲基一 邻甲服 . 马上染毒试验 ( 0 ，1 . 1 ，2 . 2 ，4 . 4 ，6 ， 6 ，8 . s m g / l ) : 最高浓度也不会显著影响4 h 2 4 h 浓度)66 m g /l明显影响眼点 囊胚的发育;sh外包行为的ec。 值巧. 6 4 mg/ l ; 、 尾部和主动活动的发育; 响血液循环和心律的发育;最高浓度也不会显著地影响4 8h 响7 2 h 孵化的e c 、 ，= 1 . ， 1 二 9 / l 。 3 2 h 最高浓度显著影 色素细胞的发育;影 . 6 h p f 染毒试验 ( 0 ，2 . 2 ，4 . 4 ，8 ， 8 ，1 3 . 2 ，1 7 . 6 m g / l ) sh外包行为的ec. 值二 116 o m g /l; 2 4h尾部不延展的e 嗡刀. 2 6 mg/l，出 现眼 点发育和主动活动障碍的染毒浓度分别为1 3 . 2 和8 . s m g / l ; 浓度超过8 . 8 略/ l 严 重影响3 2 h 影响血液循环、 4 8b水肿和心律的发育; 最高浓度也不会显著影响4 8h 色素细胞的发育:影响了 zh孵化的e c 沁 =l， 1 5 mg/l。 对比两组实验结果， 我们不难发现4 ， 4 一 亚甲基二邻甲胺的斑马鱼胚胎毒性 试验的最敏感的作用指标为sh外包活动和7 2h孵化率，没有特定的染毒时间。 8 ) 4 一 氨基联苯 . 马上染毒实验 ( 0 ，2 ，4 ，6 ，8 ，1 0 m g / l ) 6 h内浓度)6 呢/l 会推迟外包的形成，开始出现受精卵凝结的现象。10h pf 后， 浓度) 6 mg/l的染毒组内 凝结卵的数量显著增加。 2 4 h p f 时最低浓度组( z mg/ l) 也出 现无主动运动现象。 4 8 hpf 时最低浓度组( z mg/ l)也出现色素缺陷。 而7 2 h p f 后浓度)6 m g /l 的染毒组孵化成功的仔鱼全部伴有水肿或脊柱弯曲等畸形。最敏 感参数依次为4 8h 无色素、s h 未形成囊胚以及 10h 无原肠胚发育，ec， ， 值分别为 31 9 m g / l ，3 . 8 8 m g / l ，5 . 5 0 m g / l 。2 4 h l c 。 二 5 . 6 0 m g / l 。 . 6 h p f 后才染毒 ( 0 ，1 ，6 ，1 0 ，2 0 ，3 0 m g / l ) s h p f观察最低浓度组 ( 1 用 9 / l) 也出现大量未形成外包的胚胎，说明 6 一sh 是最敏感的时期。 2 4 h p f 浓度 6 mg/l 的染毒组胚胎主动运动显著减少; 4 8hp f 浓 利 用 斑 马 鱼 胚 胎 发 育 技 术 对 芳 h itm 0l 少 iul 塑全塑些丝鲤墅些些9 j s) f l i 9 9 硕史淑洁 度 6 m g / l 的染毒组内大量胚胎表现出 色素细胞发育不健全的现象， 而3 0 m g / l 组 全部死亡;7 2 h p f浓度) 6 m g / l的染毒组内 孵化成功的胚胎大多 伴随脊柱弯曲的 现象， 2 0 m g / l 组的胚胎也全部死亡。 最敏感参数依次为8 h 未发育外包、7 2 h 孵 化率、3 2 h无血液循环以及 4 8 h无色素，e c 、 值分别为 0 . 0 4 m g / l , 2 . 9 6 m g / l , 3 . 9 6 m g / l 和 3 . 8 8 m g / i 。 对比两组实验结果，我们不难发现 4 -氨基联苯的斑马鱼胚胎毒性试验的最 敏感的作用指标为8 h 外包活动和4 8 h 色素细胞发育障碍，6 h p f 开始染毒毒性更 强。 9 ) 3 , 3 一 二甲基一 4 - 氨基一 偶氮苯 . 马上染毒 ( 0 , 0 . 1 2 6 , 0 . 2 5 2 , 0 . 5 0 4 , 0 . 7 5 6 , 1 . 0 0 8 m g / l ) 8 h 时两个较高浓度 ( 0 . 7 5 6 和1 . 0 0 8 m g / l ) 全部凝结， l c w , 0 . 4 6 1 m g / l ; 大于 0 . 1 2 6 m g / l 的染毒浓度明显影响此后的各项胚胎发育指标:2 4 h l c . = 0 . 4 2 7 m g 儿。 . 6 h p f 染毒试验 ( 0 , 0 . 1 2 6 , 0 . 3 7 8 . 0 . 7 5 62 6 , 2 . 5 2 m g / l ) 所有浓度均不影响8 h 外包发育;2 4 h 尾部延展的e c ; o 1 . 7 2 m g / l ，最高染毒 浓度显著影响眼点、主 动活动的发育; 3 2 h 血液循环的e c . 1 . 9 1 m g / l ，对心律无 显著影响; 4 8 h 影响色素发育的e c , 0 . 6 3 m g / l ， 对心律无显著影响: 染毒7 2 h 后， 最低浓度 ( 0 . 1 2 6 m g / l ) 组的孵化率不足3 0 % ， 最高浓度组 ( 2 . 5 2 m g / l ) 组内有将 近 8 0 % 的胚胎出现出血症状。 . 2 4 h p f 染毒试验( 0 , 0 . 6 3 , 1 . 2 6 , 2 . 5 2 , 5 . 0 4 , 1 0 . 0 8 m g / l ) 最高浓度组 ( 1 0 . 0 8 m g / l )内， 3 2 h 时1 0 0 % 未形成正常血循， 4 8 h 死亡率高达 9 0 % ， 幸存卵1 0 0 % 水肿， 而5 . 0 4 m g / l 组出 现水肿现象的卵达到3 0 % ; 7 2 h 影响孵 化和色素形成的e c 、 值分别为0 . 9 9 和2 . 4 3 m g / l o 浓度多2 . 5 2 m g / l 组水肿现象显 著。 对比以上三组实验结果，我们不难发现 鱼胚胎毒性试验的最敏感的作用指标为3 2 h 3 , 3 一 二甲基一 4 - 氨基一 偶氮苯的斑马 血液循环和4 8 h 色素细胞发育障碍， 利 用 斑 马 鱼 胚 胎 发 育 技 术 对 芳 香 itk 卿些1 1 1 竺丝塑些 111 哩型9 t1 些 9 9 硕史 椒洁 o h p f 开始染毒毒性