（环境工程专业论文）镉菲复合污染对安德爱胜蚓（eisenia+andrei）和白线蚓（fridericia+bulbosa）的生态毒理效应研究.pdf

上海交通大学博士学位论文摘要 本文采用室内模拟方法，开展了典型重金属( c d ) 典型多环芳烃 ( p h e ) 复合污染对安德爱胜蚓( e i s e n i aa n d r e i ) 和白线蚓( f r i d e r i c i a b u l b o s a ) 的生态毒理研究，在此基础上，对c d p h e 复合污染生态毒理 生物标志物的筛选和定量表征进行了重点而深入的研究，以期为有机 污染物重金属复合污染研究与诊治提供科学依据和实践指导，主要研 究结果如下： 1 从个体水平，分别采用人工土壤法和自然土壤法，研究c d 、 p h e 单一及复合污染对安德爱胜蚓( e i s e n i aa n d r e i ) 和白线蚂 ( f r i d e r i c i a b u l b o s a ) 的急性毒性。结果表明：安德爱胜蜗l ( e i s e n i aa n d r e i ) 对c d 污染 的耐受能力强；p h e 对安德爱胜蚂l ( e i s e n i aa n d r e i ) 的急性毒性高。c d p h e 复合污染对e i s e n i aa n d r e i 的急性毒性效应中p h e 为主效应。重金属 c d 和p h e 之间存在明显的交互作用，c d p h e 复合污染产生的拮抗作用 及其强度与c d 和p h e 的不同浓度组合密切相关。这两种污染物对白线 蚂l ( f r i d e r i c i ab u l b o s a ) 都具有潜在的毒性效应，毒性大小顺序为p h e 大 于c d ；c d 、p h e 染毒1 4 d 的理论l c s o 分别为4 5 4 8m gk g 一、4 4 8 2 m gk 百1 。 染毒1 4 d 后，当p h e 的染毒剂量为0 1m gk 百1 和1 6m gk g 。时，c d p h e 复合污染对白线蚓的急性毒性效应为协同作用，当p h e 的染毒剂量 2 5 6m gk g 1 时，c d p h e 复合污染对自线蚓的急性毒性效应为拮抗作 用，复合污染物的组成及各污染物的不同浓度组合是决定两者之间的 交互作用类型和毒性的重要因素。c d p h e 复合污染对白线蚂l ( f r i d e r i c i a b u l b o s a ) 的急性毒性效应中c d 为主效应因子。白线2 ( f r i d e r i c i a b u l b o s a ) 是一种可用于表征c d p h e 复合污染效应的指示生物。 2 从组织水平，采用人工土壤法，研究c d 、p h e 单一及不同浓度 i l 上海交通大学博士学位论文摘要 组合复合污染对安德爱胜r 蚂i ( e i s e n i aa n d r e i ) 抗氧化物酶系：过氧化氢酶 ( c a t ) 、超氧化物歧化酶( s o d ) 和谷胱甘肽过氧化物酶( g s h p x ) 活性的影响，结果表明：c d 、p h e 单一污染，c a t 活力最微弱，各处 理组g s h p x 活性与对照组的差异最为显著；c a t 活性变化趋势极 不稳定，s o d 、g s h p x 活性则均具有先升高后降低的趋势；其中复 合污染较单一污染对s o d 活性表现出较强的抑制作用；而复合污染较 单一污染对g s h p x 活性则表现诱导激活作用。g s h p x 可作为c d 、 p h e 单一及不同浓度组合复合污染的生物标志物，其活性变化可作为 表征c d p h e 复合污染的一项重要的参考指标。 3 从细胞和亚细胞水平，优化了蚯蚓体腔细胞提取方法。采用纤 维针法与超声波刺激法结合的方法提取的单位体重细胞数较多且存活 率较高，为后期的细胞形态学和细胞内d n a 损伤的实验打下了基础。 采用自然土壤染毒法，研究c d 、p h e 单一及复合污染对安德爱胜蚓 ( e i s e n i aa n d r e i ) 体腔细胞溶酶体膜中性红保持时间( n r r t ) 的影响， 并采用细胞流式技术( f c m ) 研究c d 、p h e 单一及复合污染对安德爱 胜蚂 ( e i s e n i aa n d r e i ) 体腔细胞质膜的损伤作用，探讨c d 和p h e 的跨膜 毒理机制。结果表明：n r r t 与c d 污染浓度和染毒时间存明显的剂 量效应关系。随染毒时间延长，c d 与p h e 复合污染对蚯蚓体腔细胞 毒性逐渐增加，蚯蚓染毒7 d 后和染毒1 4 d 后，c d 与p h e 复合污染对 蚯蚓体腔细胞溶酶体膜损伤的交互作用表现为协同作用；c d 是影响 c d p h e 复合污染对蚯蚓体腔细胞溶酶体膜n r r t 影响的主效应因子。 n r r t 是表征c d p h e 复合污染毒性的灵敏、准确、重复性好的生物标 志物。此外，安德爱胜蚂 ( e i s e n i aa n d r e o 体腔细胞在受到c d 、p h e 单 i l l 上海交通火学博士学位论文摘要 及复合污染胁迫下的早期凋亡率可作为污染物毒性评价的敏感指标， 可用于对污染物毒性的早期预警。利用细胞流式技术对c d p h e 复合污 染胁迫下蚯蚓体腔细胞的类群的研究，是评价c d p h e 单一及复合污染 及其污染修复程度的一种合理可行的实验方法。 4 从分子水平，采用自然土壤法，用单细胞凝胶电泳技术( s c g e ) 研究c d 、p h e 单一及复合污染对安德爱胜蚂l ( e i s e n i aa n d r e i ) 体腔细胞 d n a 损伤作用。结果显示：c d 、p h e 单一污染均表现出致蚯蚓体腔 细胞d n a 损伤作用，c d 、p h e 单一污染与蚯蚓体腔细胞d n a 损伤存 在明显的剂量效应关系；c d p h e 复合污染对蚯蚓细胞d n a 的损伤远 大与单一的c d 或p h e 的污染，单一c d 污染下蚯蚓细胞的o t m 值较 低，c d p h e 复合污染下，随着p h e 剂量的增加o t m 值不断增大，说 明p h e 对c d 的毒性有显著的增强作用。染毒1 4 d 后，c d p h e 复合污 染对蚯蚓体腔细胞d n a 损伤表现为拮抗作用。c d 是c d p h e 复合污染 对蚯蚓体腔细胞d n a 损伤的主效应因子。 关键词：c d ，p h e ，安德爱胜蚓，白线蚓，复合污染，定量表征， 生态毒理效应 i v 上海交通大学博_ 上学位论文 摘要 s t u d yo ne c o t o c o l o g i c a le f f e c t so fc o m b i n e d p o l l u t i o nb e t w e e nc a d m i u ma n dp h e n a n t h r e n eo n e r a t h w o r m ( e i s e n i aa n d r e oa n de n c h y t r a e i d ( f r i d e r i c i ab u l b o s a ) i ns o i l a b s t r a c t w i t ht h er a p i de c o n o m i cd e v e l o p m e n t m o r ea n dm o f ep o l l u t a n t se n t e rt h es o i l e n v i r o n m e n t i ti se s t i m a t e dt h a tm o r et h a n9 0 o ft h et o t a lb u r d e no f p o l l u t a n t sr e s i d e s i nt h es u r f a c es o i l s h e a v ym e t a l s ( h m ) a n dp o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ( p a h s ) m f r e q u e n t l yf o u n dt o g e t h e ra sc o n t a m i n a n t si ns o i l sa n dh a v ea t t r a c t e dm u c ha t t e n t i o ni n r e c e n td e c a d e s h o w e v e r ，t h e ya r em o s t l yc o n c e n t r a t e do nt h ee f f e c to fa s i n g l eo r g a n i c p o l l u t a n t sa n dh e a v ym e t a l s i nf a c t ，c o n t a m i n a t e ds o i l su s u a l l yc o n t a i nm i x t u r e sr a t h e r t h a nap u r es u b s t a n c ei nt h er e a le n v i r o n m e n t i ti sv e r yi m p o r t a n tt oi n v e s t i g a t et h e c o m p o u n dp o l l u t i o nb e t w e e nh e a v ym e t a la n do r g a n i cp o l l u t a n tf o rt h em a n a g e m e n t a n dd i a g n o s i so fs o i lp o l l u t i o n e a r t h w o r m sa n de n c h y t r a e i da r et h er e p r e s e n t a t i v eo r g a n i s m si ns o i l a n i m a l s ， w h i c hh a v eb e c o m eab i o i n d i c a t o ro fs o l lc o n t a m i n a t i o n t h e r e f o r et h ea c u t ea n d c h r o n i ct e s t so fc a d m i u m ( c d ) a n dp h e n a n t h r e n e ( p h e ) t oe a r t h w o r m sa n de n c h y t r a e i d w e r ep e r f o r m e di nt h i ss t u d yi no r d e rt ok n o wt h et o x i c i t ya n dm e c h a n i s mo ft o x i c o s i s o ft h e s et y p i c a lh e a v ym e t a la n dt y p i c a lo r g a n i cp o l l u t a n to ne n v i r o n m e n t a lo r g a n i s m s i nt h i sp a p e r , q u a n t i t a t i v ee x p r e s s i o na n de f f e c to fc o m b i n e dp o l l u t i o nb e t w e e nc da n d p h ew e r es t u d i e d t h er e s u l t sa r es h o w e da sf o l i o w ： 1 t h ea c u t et o x i c i t yo fc da n dp h et oe a r t h w o r m s ( e i s e n i aa n d r e ow a ss t u d i e db y t h em e t h o d so fa r t i f i c i a ls o i lt e s t t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h es i n g l et o x i cs e q u e n c eo f c da n dp h ew a sp h e c d t h ev a l u e so f t h e i r l c 5 0w e r e7 8 8 71m gk g - i4 2 5li n gk g 一， r e s p e c t i v e l y t h ed i f f e r e n c em a yd e p e n do nt h eb i o l o g i c a lm e c h a n i s m so ft h e 上海交望大学堕主兰堡垒茎 塑要 e a r t h w o r mp o p u l a t i o n c da ta l lc o n c e n t r a t i o n ，i tc o u l dd e c r e a s et h et o x i c i t yo fp h e ， a n dt h et o x i c i t yo fp h ed e c r e a s e dw i t ht h ed e c r e a s eo fc dc o n c e n t r a t i o n p h ea tl o wa n d m e d i u mc o n c e n t r a t i o n ，i tc o u l dd e c r e a s et h et o x i c i t yo fc d ，a n dt h et o x i c i t yo fc d d e c r e a s e dw i t ht h ed e c r e a s eo fp h ec o n c e n t r a t i o n ，a th i g hc dc o n c e n t r a t i o n ，i tc o u l d i n c r e a s et h et o x i c i t yo fp h e n e r c f o r e ，t h ec o m p o n e n ta n dd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no f c o m b i n e dp o l l u t a n ta r et h es i g n i f i c a n tf a c t o r st od e t e r m i n et h et o x i c i t yo fc o m b i n e d p o l l u t a n t p h ew a st h em a i nf a c t o ro fc o n t r i b u t i o no fa c u t et o x i c i t yo ne a r t h w o r m s ( e i s e n i aa n d r e 0 t h ea c u t et o x i c i t ym a yb eu s e dt oe x p r e s st h ec o m b i n e dp o l l u t i o n b e t w e e nc da n dp h e t h et o x i ce f f e c t so fs i n g l ea n dj o i n ts t r e s so fc d ( c a d m i u m ) a n d p h e ( p h e n a n t h r e n e ) o ne n c h y t r a e i d ( f r i d e r i c i ab u l b o s a ) w e r ei n v e s t i g a t e db yn a t u r a l s o i lt e s t s m o r t a l i t yo fs i n g l ea n dj o i n ts t r e s so fc da n dp h ew a ss i g n i f i c a n t ( p 2 ) 。亚相加，即拈抗，指复合污染效应小于各污染物单独效 应之和( 1 + 1 q ) 。 有的学者提出，按照复合污染的性质和程度，可以进行再分类。加强作用可 再分为单向加强、双向加强。拮抗作用可再分为单向拮抗、双向拮抗。单向是指 s 上海交通大学博士学位论文第一章前言 一种无活性物质影响另一种污染物的效应。双向则是指两种污染物之间相互影响 对方的效应。在相加作用中，又可在分为剂量相加和效应相加。 总之，不管哪一种联合作用，按其所产生的效应，可以分成三种：即相加、 协同和拮抗。严格地说，复合污染必然会产生协同或拮抗，绝对的相加作用是不 存在的。因此，复合污染中交互作用更具有普遍性，也是目前复合污染研究中的 重点。 人类是暴露在一个复杂的多元介质中，过去对单一污染物研究基础上制定的 环境标准，可能由于污染物间的拮抗、加和或协同作用，在应用中遇到困难，需 要加以修订，因而，采用现有的对单一污染物的标准进行复合污染评价当然也是 不合理的。当前对复合污染的分类术语通常是描述实际效应与预期效应之间的关 系，而效应的性质往往与所暴露的剂量、时间和对象有关。在一个剂量水平上出 现的某种联合作用，在另一剂量水平上不一定能见到。因此，在环境污染物复合 污染研究中，必须设定发生复合污染效应的具体条件。此外，尽管目前分类及其 亚分类尚未在环境污染评价和实际管理工作中得到全面的应用，但现行的分类方 法及术语等基本概念，对研究复合污染的理论和治理工作，是十分重要和必须的 基础。 1 2 2 复合污染研究方法 1 2 2 1 受试生物的选择 长期以来，复合污染研究中的受试生物多以水生生物为材料，主要是因为人 工水生生物系统受环境干扰少、便于测定和控制，实验周期短，物种对污染变化 敏感、容易表征等。这些受试物种有藻类、蚤类、鱼类、软体动物和发光细菌等 2 2 - 2 6 1 。在土壤实验中，多以蚯蚓和土壤昆虫作为受试生物，以土壤微生物、高等 植物作为研究对象的较少【2 7 1 。 1 2 2 2 实验方案的选择 目前，国内外对土壤复合污染的研究尚未建立起一整套标准的实验方法。为 9 上海交通大学博士学位论文 第r 章前言 了使实验设计科学、合理、可行，要从具体实验的污染物种数、浓度水平、平行 样重复数和现有的实验条件出发进行设计。目前大致有以下四种方法。 ( 1 ) 完全设计法( c o m p l e t ed e s i g n ) 。先根据试验要求，确定研究因素和浓度水 平，再将每一个因素的不同水平两两组合做同样数目的试验。当污染物数量和浓 度水平较少时，人们常用完全设计法。 ( 2 ) 正交设计法。先确定因子数目和浓度水平，再选定正交方案，最后用多 元回归、方差分析和逐步分析法得到结果。此法具有的优点是试验数量较少，所 获信息多，适用于3 种以上土壤污染物的复合污染研究。 ( 3 ) 均匀设计法( u n i f o r md e s i g n ) 。每一个方法多有其局限性，正交试验也 不例外，它只适用于水平数不多的试验。水平数增加，会使研究者望而生畏。均 匀设计的特点是每个因素，每个水平只做一次试验【2 8 1 。 ( 4 ) 交叉组合法。这是两种设计方法联合应用的一种试验方法。常用的是完 全设计和因子设计相结合【2 4 】。 复合污染方案设计中，浓度选择是影响结果的重要的因素之一。目前，复合 污染研究主要集中在急性和亚急性毒性实验【2 9 】，因而l c 5 0 ( e c 5 0 ) 是经常考虑的因 素。 1 2 3 复合污染定量表征 复合污染定量表征，基本上是以b l i s s ( 1 9 3 9 ) 提出的表征方法进行的，他将多 元素之间的相互作用分为以下三种形式： ( 1 ) 加和作用( a d d i t i v e ) 。 t = t1 + t2 + + t n ( 2 ) 拮抗作用( a n t a g o n i s m ) 。t t i4 - t2 + + tn 式中，t 为复合污染综合效应；t l ，t 2 ，tn 为各污染物单独污染效 应。目前已有的其他很多模型处理方法，大多是基于实验数据的统计分析经验公 式。概括起来主要有以下几种：统计模型比较法、指数法、作图法、生理生化指 标比较法、综合评价法。其中，目前采用的较为广泛的一种方法是统计模型比较 1 0 上海交通大学博士学位论文 第一章前言 法，主要包括以下几种： ( 1 ) 多元线性回归扩展法。该方法先对两种污染物的复合污染效应进行多元 回归【3 0 1 ，即， y 2 a o + a i x _ + a 2 x 6 变换为 y = a o + a l ( r 一+ 口2 x 占a 1 ) 其中，a 1 、a 2 是回归系数；a 0 为截距；x a 、x b 为2 种毒物的毒性。y 为复 合污染效应。根据口2 口l 就可以判断复合污染性质。a 2 a l l 为协同作用，a 2 a i l 为拮抗作用：a 2 a l = l 为相加作用。 ( 2 ) 多元回归模型： y = f 1 0 + 届置+ 岛z x ，+ 占 i = 1 s 1 3 ) 中，先 是d n a 双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片分子量小即可进入凝胶中， 在电泳时断链或碎片离开核d n a 向阳极迁移，形成拖尾。细胞核d n a 受损愈重， 产生的断链或碱易变性断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移 的d n a 量多，迁移的距离长，表现为尾长增加和尾部荧光强度增强。因此，通过 测定d n a 迁移部分的光密度或迁移长度就可定量测定单个细胞d n a 损伤程度 瞄n 。该方法灵敏、简便、快速、低耗、重复性好，目前已被广泛应用于体内或者 体外各种有核细胞经受试物诱导的d n a 损伤和修复的研究。 ( 5 ) 解毒系统酶类诱导作用的检测 对于毒物代谢酶的研究在我国起步较晚，1 9 9 8 年的第3 届学术交流会，国 内毒理学界已开始了体内代谢外源物质有关酶的基因多态性研究。国家自然科学 基金委员会和卫生部科学研究基金也分别资助了有关“毒物与基因多态性研究” 的多项课题。现在一系列重要的人类外源化学物代谢酶基因相继被克隆，相应的变 异等位基因接连被发现，并推测其与表型上代谢多态性及可能的环境风险程度相 关联。近年来，研究最多的是细胞色素p 4 5 0 ( c y p s ) 酶系 4 6 1 【4 7 1 。 c y p s 参与广泛的内源和外源化合物的合成与代谢，其对药物的疗效、对化学 致癌物的代谢活化以及其基因多态性与癌的关系等问题备受关注，研究较多的有 1 a 1 、2 d 6 和2 e l 亚型。一般认为细胞色素p4 5 0 酶系与入类癌症的关系十分密切， 大多数化学致癌物均需经c y p s 代谢活化才能成为终致癌物发挥致癌作用，如多 环芳烃、黄曲霉素、芳胺、亚硝胺掣4 8 j 4 9 】。近年来对有机磷和拟除虫菊酯杀虫剂 的神经毒性机制进行了比较深入的研究，研究表明这些化合物可通过影响神经递 质代谢，而引起神经元功能变化i s o 1 5 1 s 2 j 。 ( 6 ) 环境毒物对细胞的影响 细胞是生物的结构单位，不同种类的细胞，具有不同的形态结构和功能，对 污染物的敏感性也不一样。污染物对细胞的损伤，可表现为细胞结构和功能的改 上海交通大学博士学位论文 第一章前言 变，研究污染物与细胞结构和功能损伤的关系，不仅可以阐明污染物毒害作用的 本质，而且可以评价污染物有害性及在早期警报污染物对生态系统的影响【1 9 1 。 1 4 蚯蚓生态毒理学 蚯蚓生态毒理学是指利用蚯蚓作为载体对可能造成土壤环境污染的化学物质 进行测试，并根据这些化学物质对蚯蚓的毒害程度来评价其可能对环境的危害程 度。也就是说利用蚯蚓作为土壤环境的一种指示生物。这方面的研究工作早在上 世纪四、五十年代就已经开展i s 3 】，但只是在近二、三十年来随着化学药品在农业 生态系统中的大量使用和城市及工业固体废弃物的大量排放，土壤污染问题日益 严重的情况下，蚯蚓生态毒理学研究工作才得到了较为普遍的重视和发展。1 9 8 1 年欧共体( e e c ) 做出规定：一种新的化学药品登记进入市场之前要求具有针对于一 种藻类，一种水蚤，一种高等植物，一种鱼类，一种蚯蚓和一种有富积作用的物 种的毒理试验资料以及生物降解试验资料1 5 4 j 。 1 4 1 土壤环境污染指示生物 为什么选择蚯蚓作为土壤环境污染的指示生物? 很显然这是因为蚯蚓对土壤 环境的重要性和认为它是土壤动物区系的代表类群。选择一种或一类生物作为环 境的指示生物必须至少满足下面两个条件【5 5 j ： ( 1 ) 可以从一个常常是随机选择的种类所测定的适度范围得出一个统计性结 论，也就是说可以通过对一个物种较少个体数量的毒理测试来决定某种化学药品 对整个土壤动物区系的安全水平； ( 2 ) 试验动物应对毒素敏感，易暴露于毒素，同时便于进行研究。 蚯蚓在土壤中有机物质的分解转化上具有重要作用，同时其活动可以改善土 壤的结构，增强土壤的透气和排水保水功能。因此在土壤中保持健康的蚯蚓生态 种群对于土壤环境的保护具有重要价值。而从生态学上来看，蚯蚓处于陆地生态 食物链的底部，对大部分杀虫剂和重金属都具有富积作用。这些被富积的化学物 质可能并不对蚯蚓造成严重的伤害，但却可能影响食物链中更高级的生物。同时 1 9 上海交通大学博士学位论文第一章前言 蚯蚓对某些污染物比许多其他土壤动物更为敏感，因此利用蚯蚓作为土壤环境的 指示生物，可以提供一个保护整个土壤动物区系的安全域值。此外蚯蚓体型较大， 分布广泛，易于养殖，因此十分便利于研究和监测工作的进行。 1 4 2 蚯蚓生态毒理学的研究内容 据1 9 9 1 年国际蚯蚓生态毒理学专题讨论会( 英国s h e f i e l d ) 、1 9 9 6 年国际土壤 动物科学讨论会( 爱尔兰d u b l i n ) 、1 9 9 8 年国际蚯蚓生态学讨论会( 西班牙v i g o ) 资 料，当前蚯蚓生态毒理学研究工作主要涉及下面内容： ( 1 ) 用于试验的蚯蚓物种的选择； ( 2 ) 作为指示物种对化学药品影响整个土壤动物区系的潜在意义； ( 3 ) 蚯蚓自然种群半致死量的影响及其测试方法的进展： ( 4 ) 对于自然种群动态和人类活动影响有关的田间试验结果的解释： ( 5 ) 连续评估和测试体系的建立和对蚯蚓有毒害的化学物质的标准的划分。 1 4 3 蚯蚓生态毒理学的研究方法 蚯蚓的生态毒理学研究包括实验室急性试验和慢性试验以及在真实的生态系 统中所进行的田间试验。严格地讲前者并不是真正意义上的生态毒理学试验，但 因其实用价值而得到重视和发展，尤其是急性试验通过简单、快速的方法对某种 化学物质对蚯蚓的毒性进行测试，从而对这种化学物质的生态毒性作出初步的判 断。 针对实验室毒理试验，世界各地的研究人员提出了许多不同的方法【2 6 】。涉及 毒物对蚯蚓的生理、代谢、染色体以及基因等多层次各方面的研究，这些方法在 试验的标准化程度、方便程度和可操作性，结果的准确性以及相对于对现实生态 系统的影响的相关性等方面各有利弊【5 6 1 ： 1 4 3 1 急性毒理实验 急性毒理实验是通过简单、快速的方法测试毒物对蚯蚓的毒性，从而对这种毒 上海交通大学博士学位论文 第一章前言 物的生态毒性作出初步的判断。 ( 1 ) 滤纸接触试验( c o n t a c tf i l t e rp a p e rt e s t ) ( o e c d g u i d e l i n e n o 2 0 7 ) 。这种方 法是通过1 个成体e i s e n i a f o e t i d a e i s e n i aa n d r e i 在填充标准化的滤纸条的玻璃瓶中 与不同浓度的化学药品接触4 8h 后来测定其死亡率。其优点是快速，简便易行， 并可以通过标准化的统计方法得到l c 5 0 值。缺点是仅仅给出通过皮肤接触所产生 的毒性信息。因此很难评估化学物质对环境的真实影响，其结果与下面介绍的人 工土壤试验的结果相关程度很小。 ( 2 ) 人工土壤试验( a r t i f i c i a ls o i lt e s t ) ( o e c d g u i d e l i n e n o 2 0 7 ) 。这是在人工土 壤中进行的试验。这种人工土壤由1 0 的苔藓泥炭细土，2 0 的高岭粘土( 高岭土 大于5 0 ) ，6 9 的工业石英砂( 含5 0 以上0 0 5 o 2 m m 的细小颗粒) 和1 的 c a c 0 3 ( 化学纯) 组成。使用的蚓种仍为e i s e n i af o e t i d a e i s e n i aa n d r e i ，试验时间为 1 4d 。利用这种复杂的人工土壤进行试验的主要目的是尽可能模拟一个蚯蚓生活 的真实环境，从而使试验结果尽可能真实地反映污染物在自然界中的实际影响。 实验的结果也确实显示了这方面的优点。然而方法的设计者忽略了实验应当简便 易行这一原则，因此人造土壤试验方法被提出来了。 ( 3 ) 人造土壤试验( a r t s o l t e s t ) 【5 7 1 。这是一种在人工土壤法上进行改进，以一 种无定形水合性的二氧化硅粉( 商品名：l v i l i t e ) ，并在其中加入直径1 5 - 2 c m 的玻 璃球以代替人工土壤的试验方法。这种方法的优点是使用确切定义的物质作为基 质i 便于操作，其结果也更具有可比性。而且由于这种物质的化学惰性，基本上 可以确定不会与试验容器及被测物质发生化学反应。同时加入玻璃球一方面创造 了一个类似土壤结构的环境，另一方面增加了接触被测物质的面积。从试验的结 果来看，与人工土壤试验一样也能较好反映污染物的真正影响。根据两种方法对 比研究的结果，其相关性系数在0 9 以上。 ( 4 ) 自然土壤试验m a t u r a ls o i lt e s t ) 。直接选取特定的、需要进行污染评价 的土壤用于对蚯蚓染毒的载体，并参考以上标准实验方法，试验时间为1 4d 。这 种直接利用自然土壤进行试验的主要目的是使试验结果真实地反映污染物在自然 界中的实际影响。 2 1 上海交通大学博士学位论文第一章前言 蚯蚓的急性毒理实验，由于短的暴露时间只能粗略的评价土壤生态系统的安 全性，有些毒物及其代谢物由于低剂量对土壤生物不造成直接的威胁，但由于长 期的胁迫效应而对蚯蚓存在慢性毒性作用。 1 4 3 2 蚯蚓慢性毒理试验 蚯蚓慢性毒理试验是指有害的化学残留物质对蚯蚓的生殖、生理、代谢、染 色体以及基因等更深层次影响的研究。这是一个十分有意义的研究领域。尤其是 从分子、基因水平探索污染物对土壤生态系统的的污染，对土壤生态系统的早期 快速诊断具有重要意义，目前针对该方向的研究较少，主要是把蚯蚓的毒理生殖 实验作为如让生态系统安全检测的手段，o e c d ( 2 0 0 0 a ) 带1 订了蚯蚓的1 1 0 周分段 生长指标和生殖毒性实验标准方法。但在实践中不便于推广使用，因为一种化学 药品的生态毒性不仅与其本身的毒性大小有关，而且与环境中生物的行为和功能 密切相关。然而一种试验动物的确定，并不仅仅与试验的效果相连系，而是常常 受到许多与试验无关的因素的制约，如繁殖能力、养殖成本等。因此，试验动物 的选择及其标准化仍然是困扰蚯蚓生态毒理学发展的一个重要因素。此外，目前 对污染物低剂量长期效应对蚯蚓的研究中，选用幼蚓作为指示生物来检测污染物 对土壤生态系统的影响，效果显著。 1 4 3 3 田间生态毒理试验 蚯蚓的田间生态毒理试验是指在现实的生态系统中直接测试某种化学物质对 蚯蚓种群的生态毒性的试验。由于试验直接在现实的土壤环境中进行，因而其结 果也更直接地反映被测物质对环境的实际影响。尽管蚯蚓田间生态毒理试验在评 价化学药品的生态毒性上很有价值，但在试验方法的标准化方面和评价标准的制 定上还有许多工作要做。 1 4 3 4 生物检定 蚯蚓生态毒理学研究的另外一个方面是生物检定( b i o a s s a y ) ，即在可能已经受 到污染的土壤中直接进行蚯蚓采样研究，并与没有被污染的同类型土壤中的蚯蚓 种群进行比较，同时在实验室分析化学药品的残留情况，从而对某种或某类化学 药品的生态毒性作出评估。这种研究方法的优点是评价可能同时针对几种混合使 上海交通大学博士学位论文 第一章前言 用的化学药品，费用较低，而且结果直接反映化学药品对整个土壤动物区系的生 态毒性。缺点是生物检定不能对化学药品的生态毒性提前作出评估。 1 4 4 生物标志物在蚯蚓生态毒理学研究中的应用 生物标志物揭示了污染物的致毒机理，反映污染物的剂量效应关系，因此完 整的生物标志物数据能够说明什么污染物进入了环境和生物个体，浓度多大，污 染程度如何；污染物是否引起相应的细胞学、遗传学或生化反应，生物个体本身 是否受到急性或慢性的生物学损害；细胞和分子水平上的反应是否与个体相关， 会否引起种群、群落或生态系统上的连锁反应等，即利用生物标志物能够快速检 测污染物含量，评价污染物的危险性。 1 4 4 1 生物标志物的概念、检测机理、特点及分类 美国国家科学院生物标志物委员会于1 9 8 7 年对生物标志物进行了系统论述 【5 8 】。迄今为止，生物标志物已被广泛应用于医学、考古学、地质学等领域。目前， 生物标志物在生态毒理学领域中也占有重要位置，其概念和研究方法均得到了进 一步扩展。在美国国家环保局发表的有关生物标志物的报告中，将生物标志物概 括为：穿过机体屏障并进入人类组织或体液的环境污染物或其产生的生物效应。 对它们的检测结果可作为生物体暴露、效应及易感性的指示物【5 9 1 。9 0 年代初， d e p l e d g e 和f o s s i 等1 6 0 “1 】曾先后提出生态毒理范畴的生物标志物，认为生物标志 物是生物体组织或体液样品中或在个体水平上所能检测到的生化、细胞、生理或 行为变化，这种变化可阐明生物体暴露和产生生物效应的信息。g o k s o y r 等【6 2 j 认 为这些生物标志物系统是生物体暴露于亚致死剂量下的有毒化合物而发生异常变 化的信号指标，这种指标不仅可为环境质量退化提供早期警报，而且可以特异性 地检测到环境中致癌、致畸、致突变化合物的生物可利用性。 1 生物标志物的检测机理 环境污染物首先必须进入生物体，到达靶位点后，才可能产生生物学变化。 广义上说，从暴露到效应产生，其间的级联生物效应都可用适当的生物标志物进 行检测，这些生物反应从分子相互作用到细胞损伤及至整个生物体的毒性显现都 上海交通大学博士学位论文第一一章前言 反映了生物系统与环境因子的相互作用，这些作用可发生在分子、细胞及个体水 平上，使生物体产生功能、生理、生化变化。如果这些生物反应先于严重的结构 损害，标志物就有助于确定生物体所处的污染状态及其潜在危害，为严重毒性伤 害提供早期警报。 2 生物标志物的特点及分类 确定一个与各毒性终点相关的实用标志物需多学科的合作研究。污染导致的 最初反应是从分子相互作用开始的，因此，基于分子机制的标志物研究显得更为 重要。使用与毒性相关的生物标志物可加速环境污染危险评价进程，增大其可靠 性，其体现出的优点是单纯的化学方法和常规生物检测方法无法比拟的： ( 1 ) 确定污染物与暴露风险的对应关系，从机理上了解生物体受到的毒害。 ( 2 ) 能了解污染物的生物有效性在时间与空间上的积累效应。 ( 3 ) 在分子和生化水平上的效应( 效应生物标志物) 与高级生物学水平上的 效应( 如生长、繁殖) 联系在一起，并将不同层次生物( 个体、种群、群落) 的系列 测定综合，通过生物标记物的短期变化可预测污染物的长期生态效应。 ( 4 ) 可用于不同生境或不同营养级的生物物种，揭示不同的污染途径，并能 表现混合污染的毒性相互作用关系。 ( 5 ) 能同时指示母体污染物与代谢产物的暴露与毒性效应。 ( 6 ) 具有一定的敏感性，生物标志物的敏感性高于一般生物检测指标。 ( 7 ) 具有一定野外应用价值，部分避免实验室数据外推引起的毒性波动与变 化。 从功能上看，生物标志物可分为三大类： ( 1 ) 接触标志物( 暴露标志物) 指示生物对污染物的暴露，即污染物引发的 生物体反应，如指示对重金属暴露的键联金属的蛋白质( 金属硫蛋白m t s , ) ，此类 标志物不能指示污染物的毒性效应，但有助于研究生物对化学分析法难以检测到 的环境中不稳定化合物的暴露。 ( 2 ) 效应标志物指示污染物对生物体健康状况的损害效应，如指示d n a 损 伤的d n a 加合物( d n a a d d u c t s ) ，它是生物体内某一内源性成分或测定机体功 上海交通大学博士学位论文第一章前言 能容量、产生疾病或障碍的改变等，可解释污染物毒性效应的分子反应机理，从 而确定环境样品中各污染物对生物体作用的相互影响【6 3 】。 ( 3 ) 敏感性标志物( 易感性标志物) 指示生物个体对污染物的敏感性。在污 染物与生物体相互作用过程中，机体因素是很重要的，性质与质量相同的污染物 可能使不同个体产生不同的反应，这取决于受作用个体的敏感性【鲫。 一般各个层次的生物组织，小到微观分子，大到生态系统，在污染物作用下， 都有各自相对应的污染效应和相对应的生物标志物( 表1 1 ) 【6 5 删。但目前的研 究多集中于分子或细胞水平，种群、群落和生态系统层次上的生物标志物正处于 研究的初始阶段【6 刀。 表1 - 1 生物标志物的体系 t a b l e1 - 1t h es y s t e mo f b i l o m a r k s 上海交通大学博士学位论文 第一章前言 1 4 4 2 蚯蚓生态毒理生物标志物的研究进展 最早以蚯蚓作为指示生物对污染土壤的评价是通过对蚯蚓体内污染物的残留 检测来评价土壤环境受该污染物的污染程度。在此基础上，对污染土壤中蚯蚓种 群、个体对重金属的生物利用度进行了深入研究，并分析了常见的重金属对蚯蚓 的毒理机制【6 8 - 彻。以蚯蚓在污染土壤中的迁移、交配频率等主要行为特征作为对 污染土壤的评价方法目前仍然存在着争议。 最早有关蚯蚓生态毒理学研究的生物标志物是谷光甘肽转移酶( g s t ) 、乙酰胆 碱脂酶( a c h e ) ，s t e n e r s e ne ta 1 ( 1 9 7 9 ) 和s t e n e r s e n ( 1 9 7 9 a ) 报道了重金属对谷光甘 肽转移酶( g s t ) 、乙酰胆碱脂酶( a c h e ) 酶活性的抑制反j 应【7 1 ，捌。随着现代生物学技 术的快速发展，基因测序技术、p c r 技术、蛋白质化学、基因芯片技术等现代生 物技术在蚯蚓生态毒理学研究中的应用，应用生物标志物来监测土壤污染程度和 进行风险评价的技术得到了迅速的发展【7 3 , 7 4 。目前，主要有以下几类： ( 1 ) 污染物胁迫下对蚯蚓细胞结构完整性和功能影响的研究。常见的是运用 中性红染色技术分析溶酶体膜的稳定性，溶酶体是细胞浆内一种小的结构细胞器， 是细胞内的一种膜性结构，由单层膜包围而成的微小囊泡状细胞器，其重要功能 是进行细胞内消化。目前已发现溶酶体内有五十余种酸性水解酶，这些酶对外源 性物质、衰老的细胞和包涵物等有消化、分解作用。以溶酶体作为生物标志物的 供试生物主要是蚯蚓。蚯蚓体腔细胞内的溶酶体能很快的吸收、保持和积累中性 红燃料，被污染环境胁迫的蚯蚓，其溶酶体膜的渗透性发生变化，并失去稳定性， 燃料就逐步泄露到周围的细胞质中，根据中性红的保持时间，可反映土壤污染对 蚯蚓的毒害效应。s v e n d s e n ( 1 9 9 6 ) 和w e e k s ( 2 0 0 4 ) 利用中性红在溶酶体膜上的保持 时间( n e u t r a lr e dr e t e n t i o nt i m en r r t ) 的变化分析了污染物胁迫下溶酶体膜的 稳定性【7 ，7 6 i 。g i g g l e m a n 和g o v e n 利用中性红在溶酶体膜上n r r t 的变化对有机 污染物和重金属的胁迫进行了免疫分析【7 9 】。v e r s c h a e v e ( 1 9 9 5 ) 和s a l a g o v i c ( 1 9 9 6 ) 报道了运用单细胞凝胶电泳分析污染物胁迫对蚯蚓遗传毒性的研究 s o s f l 。此外， 对蚯蚓细胞结构和形态的研究主要集中在对蚯蚓精子形态学研