（分析化学专业论文）基于二茂铁为电子介体的电化学生物传感器的研制.pdf

摘要 摘要 生物传感器是一类特殊的化学传感器，它是将生物技术、材料技术、纳米技 术、微电子技术等结合起来形成的新兴高科技产品，也是目前最活跃的电化学和 电分析化学的前沿领域电化学生物传感器由于其价格低廉、设计制造简单、灵 敏度高、所需仪器设备相对简单、选择性好等优点，被广泛研究并逐渐应用于临 床医学、环境检测和食品工业等领域本文利用二茂铁及其衍生物为电子媒介体 制备了第二代生物传感器，并对其性能进行了系统研究，主要开展了以下工作： l 、在s i 0 2 纳米粒子溶液中加入3 - - 氨基乙氧基硅烷( a p t e s ) ，使s i 0 2 纳米 粒子表面氨基化( a s n p s ) ，再与羧基二茂铁( f m c ) 通过酰胺键结合生成 f m c - a s n p s 复合纳米材料，将f m c - a s n p s 与多壁碳纳米管( m w n t s ) 以及葡萄 糖氧化酶( g o d ) 固定于壳聚糖( c s ) 中，涂布到玻碳电极表面，构建具有良好生物 相容性的f m c - a s n p 姗n t s c , - o d c s 复合膜生物传感器。采用循环伏安法研 究了传感器对葡萄糖的电催化氧化行为实验结果表明，该传感器对葡萄糖具有 良好的电催化氧化性能，对葡萄糖检测的线性范围为4 0 x 1 旷- 6 5 x l o 3m o l l ， 检测限为1 o x l o 刁m o l l 该复合膜有望用于其他酶和生物分子的有效固定 2 、将自行合成的己硫醇二茂铁( h s ( c h 2 ) 6 f c ) 自组装于金纳米粒子表面， 获得己硫醇二茂铁复合金纳米粒- 子( a u s ( c h 2 ) 6 f c ) ，进而把a u s ( c h 2 ) 6 f c 滴 涂到玻碳电极表面，制备了a u s ( c h 2 ) 6 f c 修饰电极。采用紫外吸收光谱、红 外吸收光谱、循环伏安等方法对修饰电极的制各过程进行了表征，将制备的修饰 电极用于对神经递质多巴胺的催化氧化性能研究。结果表明，该修饰电极对多巴 胺具有显著的催化氧化作用，线性范围为1 0 l o 6 x l o - 3m o f l ，检测限为 3 0 x 1 0 7 m o l l 。该修饰电极具有良好的灵敏度、重现性和稳定性。 3 、通过希夫碱反应将甲酰二茂铁( f c - c h o ) 键合到氨基化的多壁碳纳米管 ( m w n t s ) 表面，获得水溶性较好的m 帅f c 复合纳米材料，采用傅立叶红 外光谱对合成的复合纳米材料进行了表征。利用壳聚糖( c s ) 成膜性好这一优点， 将此复合纳米材料、c s 以及葡萄糖氧化酶( c o d ) 固定于玻碳电极表面，制得葡 萄糖生物传感器。通过循环伏安法和计时电流法研究了酶电极的电化学特性以及 对葡萄糖的电催化氧化性能。结果表明，将电子媒介体与m w n t s 直接键合后修 饰到电极表面，解决了一直以来电子媒介体容易从电极表面泄漏的难题，从而增 摘要 强了传感器的灵敏度和稳定性，拓宽了其线性响应范围。传感器对葡萄糖检测的 线性范围为1 2 x 1 0 5 3 8x l o 3 m o l l ( r - - o 9 9 9 5 ) ，检测限为3 o x l o 击m o l l 。 关键词：生物传感器；葡萄糖氧化酶；辣根过氧化酶；多巴胺；多壁碳纳米管； 壳聚糖；电子介体；二茂铁 a b 曲 a c t a b s t r a c t t h eb i o s e l l s o ri san o v e la n a l 蛳c a lm e a s u r e m e n t , w l t i c hh a sb e e nam o s t b u r g e o n i n ga n do n o o ft h em o s tf l o u r i s hr e s e a r c hr e a l m si nt h ee l d ：h d d 地m i g 时a n d e l e e t r o m n l y t i cc h e m i s t r ys i n c ei tw a sd e v e l o pi nt h em i d d l eo f t o 啊砖a d v a n t a g e so f t h eb i o s e m o r i n c l u d i n g t h e i r i n 日| p 印s i i n s t r u m e n t a t i o n , s i m p l e - d e s i g n , h i g h - s e m i t i v i t y , l o w - e o s ta n df a i rs e l e c t i v i t ya t t r a c ts u b s t n i n l i a lr e s e a r c he f f o r t s d i r e c t e dt ot h ed 胛e l o p m e t l t so f8 0 m en 删e l e c t r o c h e m i c a lb i o s e m o r sa n dh a v eb o e l a u s e di ne t i n i e a l , a l v i r o n m m t a lc o a t i , a n df o o dc r u a l i t yc o n t r o l , e t c i n 也c 西3 - t h e s e c o n dg e 目a e t a f i o ns m l x z o m e t r i cg l u c o s eb i a 啪fa n dh y d r o g e np e r o x i d eb i o s a a s o r i sp l e p a t a l i o nb y 伽暇l u 锄ge l e c t r o nm e d i a t o r n 地m a i nw m l c smi n c l u d e d 鹪 f o l l o w s ： 1 an o v e la m p e r o m e t r i eb i o s o n s o rf o rg l u c o s ew a l ld e v e l o p e db ye n t r a p p i n g g l u c o s eo x i d a s e ( g o d ) i nae l a i t o s 如c o m p o s i t ed o p e d 谢l hf e r r o e e n e m o n o e a r b o x y l i ca e i d - a m i n a t e ds i l i c an a n o p 盯t i e l e sc o n j u g a t e ( f m c - a s i c p s ) a n d m u l t i w a l lc s l b o l ln a n o t u b e so 婀t h e 唧e df m c - a s n i p sc o n j u g a t e p e r f o r m e de x c e l l tr c d o xd e e t r o d a e m i s t r ya n dt l a cp i e $ 1 m c eo fm w n t $ i m p r o v e d t h ec o n d u c t i v i t yo ft h ec o m p o s i t ef i l m t h i sm a t r i xs h o w e dab i o o o m p a t i b l e m i e r o e n v i r o n m e n tf o rr e t a i n i n gt h en a t i v ea c t i v i t yo ft h eh i 位叩p e dg o da n dw a si n f a v o ro ft h ea c c e s s i b i l i t yo fs u b s t r a t et ot h ea e t i v es i t eo fg o d ，t h u st h ea f f i n i t yt o s u b s t r a t e si si m p r o v e dg r e a t l y u n d e ro p t t m lc o n d i t i o n st h i sb i o s e m o rw a - qa b l et o d e t e c tg l u c o s e 而t had e t e c t i o nl i m i to f1 0p m ( s i n ；3 ) i nt h el i n e a rr a n g eo f 0 0 4t o 6 5 m m t h ep r o x i m i t yo ft h e s et h r e ec o m p o n e n t sf m c a s n p s m 仆r r sa n dg o d e n h a n c e dt h ee l e c t r o nt r a n s f e rb e t w e e nt h ef i l ma n de l e c m 硇e i n sc o m p o s i t ef i l m 啪b ee x t e n d e dt oi m m o b i l i z eo t h e r 如z y m 髓a n db i 响o l e c u l e s ，w h i c hw i l lg r e a t l y f a c i l i t a t et h ed e v e l o p m e n to f b i o s e r 啪r sa n do t h e rb i o e l e c m ) c h e m i c a ld e v i c e s 2 t h ea u s ( c h 2 ) 6 f em o d i f i e de l e c t r o d ew a s p r e p a r e db ys e l f - a s s e m b l yw i l h h s ( c h 2 ) 6 f ew h i c hi ss y n t h e s i z e db yo u r s e l v e s t h ep r e p a r a t i o na n dt l 璩 e i e c 昀c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fa u s ( c h 2 ) 6 f cm o d i f i e de l e c t r o d eh a v eb e e n i n v e s t i g a t e d t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o wt h a tt h ea u s ( c h 2 ) 6 f em o d i f i e d i i i a b s t r a c t e l e c t r o d eh a ss t r o n gc a t a l y t i ce f f e c tt o w a r d st h ee l e e t r o e h e m i c a lo x i d a t i o no f d o p a n f i n e ( d a ) 1 kl i n 删毋o fd ai nt h er a n g eo fi o x l 0 由- 2 6 x l o - jm o l lw i t h d e t e c t i o nl i m i to f3 o x lo 7m o v la n dt h et o n e l a t i o nc o e f f i c i e n to f0 9 9 9 7a o b t a i n e df r o mt h ec u r r e n tr e s p o n s e so fd a n er e s u l t i n gm o d i f i e de l e c t r o d eu n d e r o p t i m a lc o n d i t i o n ss h o w sh i g hs e n s i t i v i t y , l o n g - t e r mo p e r a t i o n a ls t a b i l i t y , a n df a s t r e s p o n s et i m ea n dw i d e - r a n g ed e t e c t i o ma n dt h i sm e t h o dc a nb eu s e df o rt h e d e t e r m i n a t i o no f d o p a m i n ei nr e a ls a m p l e ， 3 a k i n do f n a n o c o m p o s i t e sw i t hg o o dd i b 删o ni nw a t t l - w a sp r e p a r e dt h r o u g h s c h i f fb a s er e a c t i o no f f e a r o c a n e c a r b o x a l d e h y d e ( f c - c h o ) a n df u n c t i o n a l m u l t i w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e s ( v l c r s ) f o re l e c t r i cc o m m u n i c a t i o nb e t w e e ng l u c o s e o x i d a s ea n de l e c t r o d e 1 k 加唧s i 恼o 确刑t 3 - f c ) i sc h 砸c t l b r i z e db yu s i n g f 卜ts p e c t r o s c o p y w i t ht h e a i do f e h i t o s a n , g l u c o s eo x i d a s ea n dm w n t s - f cw a st i m m o b i l i z e d0 1 1t h ee l e c t r o d et of o r mar e a g e n t l e a sa m p e r o m e t r i c i k q o rf o rg l u c o s e t h ep r 锚c n c eo fb o t hf c - c h oa n dm 个r r sa sc o n d u c t o re n h a n c e dg r e a t l yt h e e n z 掣m a t i or e s p o n s et ot h eo x i d a t i o no fg l u c o s e 驰en o v e lb i o s e n s o re x h i b i t e df a s t l - e s p o n s et o w a r d sg l u c o s ew i t had e t e c t i o nl i m i to f 3 0 x l o 七m o l l ( s n = 3 ) a n dt h e l i n e a r r a n g e i s1 2 x l o 。3 8x l o m o l l ( r - - - o 9 9 9 5 ) k e y w o r d s ：b i o s e n s o r , g l u c o s eo x i d a s e ；h o r s e r a d i s hp e r o r d d a s e ；d o p a m i n e ； m u l t i w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e s ；c h i t o s a n ；d e c u o nt r a n s f e rm e d i a t o r , f e r r o c e n e 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得直昌盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名( 手勖藐签字日期。1 引堋堋 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解直昌去堂有关保留、使用学位论文 的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁 盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权直昌盔堂可以将学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究 所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向 社会公众提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名新礁导师签名暑w 聋 【 i 签字日期：乒司年f 瑚沙日签字日期：砷年f - 月珈日 f 7 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 引言 传感器是一种信息获取与处理的装置。而生物传感器【l 】是一类特殊的化学 传感器，它是将生物技术、材料技术、纳米技术、微电子技术等结合起来形成 的新兴高科技产品，是以生物活性单元( 如酶、抗体、核酸、细胞等) 作为生 物敏感基元。对被测物具有高度选择性的检测器。它通过各种物理、化学型信 号表达出来，从而得出被测物的浓度。国际纯粹与应用化学联合会( i u p a c ) 对 化学传感器的定义为：一种小型化的、能专一和可逆的对某种化合物或某种离 子具有应答反应，并能产生一个与此化合物或离子浓度成比例的分析信号的传 感器1 2 】由于生物传感器具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、操作简易和仪 器价格低廉等特点，可以进行在线甚至活体分析，可在医学及工农业等其他颁 域广泛地应用于检测分析【 习为生物医学、环境监测、食品医药工业和军事医 学等领域直接带来新技术革命。 最先问世的生物传感器是酶电极。1 9 6 2 年，c l a r k 和l y o 地【6 】最先提出酶电 极的设想，他们利用葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化反应，经极谱式氧电极检测 氧量的变化，制成了第一支酶电极。1 9 6 7 年，u p d i k e 和h i c k 【采用当时最新的 方法，将葡萄糖氧化酶固定在氧电极表面，研制成酶传感器。2 0 世纪7 0 年代中 期，人们注意到酶电极的寿命一般都比较短，提纯酶的价格也比较昂贵。而各 种酶多数来自微生物和动植物组织，因此就自然地启发人们研究酶电极的衍生 物即生物电极、细胞电极、动植物组织电极以及免疫电极等新型生物传感器， 使生物传感器的类型大大增多，经过4 0 余年的不断发展，生物传感器技术日新 月异。 1 2 生物传感器 1 2 1 生物传感器的原理 生物传感器将分析化学和生物学的技术及方法结合在一起，是一种利用生 物的因子或生物学原理来检测或计量化合物的装置。通常由分子识别部分( 敏 感元件) 和转换部分( 换能器) 组成。其基本构成及工作原理如图l 所示。敏 感元件由对被测定物质具有高选择性分子识别功能的膜构成；换能器则能把膜 第1 章绪论 上进行的生化反应中消耗或生成的化学物质，或产生的光、热等转变为电信号 然后把所得电信号经过电子技术的处理后，在一起上显示或记录下来。 与被测 i 表鏊燃旧到蛩 物浓度 有关的 物理化 学信号 图1 生物传感器的原理示意图 1 2 2 生物传薯罱的分类 生物传感器的分类和命名方法较多且不尽统一，主要有两大分类法，即依 分子识别元件分类和器件分类法根据生物传摩器中用作生物元件的材料划分 可以将生物传感器分为六大类，即酶传感器( z y ：眦鳓借呻，免疫传感器 ( i m m u n o l s e n s o r ) ，d n a 传感器( d n as e n s o r ) ，微生物传感器( m i c r o b i a ls e n s o r ) ， 组织传感器m s 蚰es e n s o r ) 和细胞传感器( o r g a n a l ls e m o r ) 同时根据生物传感器与 底物作用机理不同，可将生物传感器分为催化型传感器和亲和型生物传感器两 类，前者包括酶传感器、免疫传感器和受体传感器等。器件法是根据生物传感 器获取信号的物理元件划分进行分类：主要有电化学生物传感器、热生物传感 器和光学生物传感器。电化学生物传感器主要包括电位型、电流型、电导型和 电容型生物传感器等。光学生物传感器主要有荧光型和化学发光型等此外， 压电晶体( p i e z o e l e c l r i cq u a r t zc r y s t a l ) 、热敏电阻( t h e r m i s t o r ) 、场效应晶体管、表 面等离子共振( s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ) 和表面声波换能器( s u r f a c ea c o u s t i c w a v et r a n s d u c e r ) 等也已被用作为生物传感器的换能器。 电化学生物传感器是生物传感器领域中研究最多的一种类型，由于它具有 诸如以下的优点而被广泛研究：结构简单不需要昂贵的检测仪器设备；操作 简便，换能器将反应能转换成电信号，易于检测和转换成数字信号与计算机联 机，实现连续、实时、自动化检测分析：方法简单，如测定过程无需对生物样 品做任何分子标记、衍生等；灵敏度高；选择性好，复杂的样品往往不需要经 过分离或掩蔽处理就可以直接测定；快速实时，如检测一对生物分子自j 相互作 用通常用时不到1 h ，而且在检测过程中，就可以观察到生物分子白j 相互作用的 结果；易于小型化、微型化，更适合临床和现场的检测分析。其中电位型生物 第1 章绪论 传感器换能器主要有离子选择性电极i s e 和气敏电极。电流型电化学生物传感 器换能器主要有碳电极、惰性金属电极等。惰性金属电极中，金电极则多用于 自组装( s 枷) 技术【8 。比i 铂电极因其对酶反应产物h 2 0 2 有较灵敏的响应值应用 较多【1 3 - 1 5 。碳电极主要包括碳糊电极、玻碳电极、多孔玻碳电极【1 锄1 1 、石墨电 极和碳纤维电极。 随着生物技术的迅速发展和广泛应用，能够实时、在线获取各种生化信息 的生物传感器显得越来越重要。要实现生化信息的传感，首先要能够高灵敏、 高选择地识别被测对象，如各种与生命活动密切相关的离子、气体、有机分子 以及生物大分子等等。对于简单的离子、分子可以利用天然的或人工合成的 载体，如放线菌素、冠醚、杯芳烃等，通过一些较为简单的物理、化学手段制 成敏感膜，完成高灵敏选择性识别但是对于很多有机物、生物大分子，则需 要相应的酶、抗原、抗体甚至生物组织才能完成识别如何将这些生物活性单 元固定化制成相应的敏感膜，同时又要保持生物活性单元的固有特性，是生物 传感器研究的一个关键问题。酶作为一种生物催化剂，能在常温常压的温和条 件下高效地催化反应，并且具有很高的专一性，常被制成固定化酶，广泛地用 于生物传感器的构建。 1 2 3 生物分子固定化方法 为了研制廉价，灵敏度高，选择性好和寿命长的生物传感器，酶的固定化 已成至关重要的问题。酶的固定方法大致可分为以下几种： l 、吸附法1 2 2 - 斟1 ：吸附法又分为物理吸附和化学离子交换吸附。物理吸附是 通过氢键、疏水键和电子亲和力等物理作用将酶周定于不溶性载体的方法； 离子交换吸附是指在适宜的p h 和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离 子交换的相互作用而达到酶固定化的方法。物理吸附具有无需化学试剂、极少 的活化和清洗步骤，以及同其他化学法相比，很少发生酶降解，对酶分子活性 影响较小等优点。但对溶液的p h 变化、温度、离子强度和电极基底比较敏感， 需要对实验条件进行相当程度的优化，该方法还由于生物组分易从电极表面脱 落，而不被广泛采用，而且同其他固定技术相比，生物组分的寿命比较短。 2 、共价偶联法1 2 ”7 l ：共价偶联法是借助共价键将酶的活性非必需侧链基团 和载体的功能基团进行共价偶联以固定酶的方法。通常要求在低温( ) 、低离 子强度和生理p h 条件下进行，并常加入酶的底物以防止酶的活性部位与电极表 第1 章绪论 面发生键合。共价偶联法的特点是结合牢固，蛋白质分子不易脱落，载体不易 被生物降解，使用寿命长，缺点是操作步骤较麻烦，酶活性可能因化学修饰而 降低，制各高活性固定化酶较困难。多用于酶膜和免疫膜的制作。 3 、交联法【勰2 9 1 ：交联法是利用双功能或多功能试剂在酶分子与载体间、或 酶分子与惰性蛋白间进行交联反应以制备固定化酶的方法例如用戊二醛加小 牛血浆蛋白交联葡萄糖氧化酶交联法广泛用于酶膜和免疫膜的制备，操作简 单结合牢固。但是这种方法的主要缺点是生物膜与换能器表面结合力不强，固 定的稳定性差 4 、夹心法：将生物活性物质封闭在双层滤膜之间，形象地称为夹心法依 生物材料不同而选择不同孔径的滤膜如用于酶的滤膜孔径为1 0 - - - 3 0 0 i i m ，用 于微生物的为0 0 5 1 0 1 a m ，用于组织的膜孔为o 5 l o 呻n 这种方法操作简单 不需任何化学处理。固定生物量大，响应速度快，重用性好特别适应于微生 物和组织膜的制作，当用于制作酶膜时稳定性较差 5 、凝胶聚合物包埋法：包埋法实际上是酶在凝胶聚合物中的物理保留。 人们已经对许多聚合物作为捕集酶的基质进行了全面的研究，如明胶0 0 1 、环糊 精【3 i 】、聚苯胺【3 2 1 、聚氯乙烯【埘、聚丙烯氰【川、聚乙烯胺3 5 l 及其它许多聚合物以 及胶体【刈，利用它们的单体聚合时将酶一起包埋其中此法的优点是：a 、可采 用温和的实验条件及多种凝胶聚合物：b 、大部分酶可很容易地渗入聚合物膜 中，一般不产生化学修饰；c 、由于没有化学变化，对酶活性影响较小；d 、膜的 孔径和几何形状较易控制：c 、包埋的酶比较牢固，并可结合其它固定方法如共 价键合和交联进一步改进包埋的稳定性：f 可固定高浓度的活性生物组份等。 8 0 年代到9 0 年代用于生物传感器中酶包埋的技术主要时有机聚合物凝胶包埋 但是由于有机凝胶在水中的溶胀性使得其包埋效果不理想。寇文朋h 1 等人利用 聚合物接枝技术加以改进，将聚乙烯醇于4 乙烯基吡啶和丙烯酰胺的共接枝凝 胶固定葡萄糖氧化酶用于制各葡萄糖生物传感器，证明这种三元接枝物凝胶对 酶有良好的固定和生物相容性。 1 9 9 0 年，b r a u n 3 8 】研究小组首次报道将蛋白质固定于硅酸盐溶胶一凝胶 ( s 0 1 g e l ) 中。这种无机多孔材料具有物理刚性、化学惰性、好的生物兼容性及 热稳定性，又具有低温制各及在水中和有机溶剂中几乎不溶胀等优点。后来又 有报道将低温固化溶胶凝胶硅酸盐玻璃衍生物技术用于生物传感器的制型 溶胶一凝胶技术是将金属集成溶胶，再经蒸发、干燥转化为凝胶。这是一种低温 4 第1 章绪论 ( 常温) 制备技术，具有可控制备工艺。这类无机多孔材料中用于生物传感器 中研究得较多的是溶胶凝胶硅酸盐衍生物l 4 0 , 4 q 。另外还有a 1 2 qs 0 1 g e t c 4 2 4 j l ， t i 0 2s o l - g e l i 删等，它们的多孔凝胶网络结构尤其适合固定生物大分子，优点是 稳定性好，孔内的亲水环境可增加酶的稳定性。但成模条件对传感器的性能影 响很大，有时易造成脆裂，或响应慢。改进的溶胶兹胶克服了一般溶胶凝胶固 化时间长，易碎等缺点。b i n g q u m 3w a n g 等人 4 5 1 在s 0 1 g d 过程中加入聚乙烯醇 接枝4 乙烯基吡啶( p v a - g - p v p ) 共聚物使硅酸盐溶胶更适于酶的固定，其结合 媒介体亚甲基氯制得的过氧化物酶电极对h 2 0 2 响应线性范围0 5 1 t m o l l 1 1 6 m m o l l 1 其响应值在一周后仍保留9 1 如上所述，虽然用于固定生物材料的方法很多，但每种技术都有自身的优 势与不足，人们一直在努力探索生物材料新的固定方法，以达到高稳定固定、 高生物活性保持、简单实用、良好的固定重复性等目的。近年来的研究表明： 通过带相反电荷聚电解质在固体表面的层层组装可以形成非常稳定的自组装 膜 4 6 4 9 1 。常用的正电性聚电解质有聚乙烯亚胺、聚烯丙基胺、聚l 赖氨酸、聚 ( n - 乙基4 烯基毗啶) 、聚二甲基二烯丙基胺等；负电性聚电解质包括聚苯烯磺 酸、聚甲基丙烯酸、聚苯胺丙烯酸等。人们利用聚电解质的这种性质固定生物 材料构建生物传感器，传感器性能得到显著改善。s i r k a r 等利用s a u 共价结合 性质将1 1 巯基十一酸修饰到a u 电极表面，得到负电性表面，再交替将正电性 聚电解质：共价结合电子媒介锇一联吡啶络合物的聚乙烯吡啶与聚烯丙基胺共 聚物与负电性葡萄糖氧化酶及乳酸氧化酶组装到a u 电极表面，得到一个纳米复 合生物活性膜，用于对葡萄糖和乳酸的传感测定i f , o ；m i z u t a n i 等将a u 电极表面 自组装一层巯基丙酸，然后正电性的聚赖氨酸和负电性的聚苯烯磺酸交替组装 在其上再将葡萄糖氧化酶用戊二醛交联固定蓟聚赖氨酸层表面，构成测定葡萄 糖的酶电极，这种固定酶的方法所制备的葡萄糖传感器，可以极大地减小来自 抗坏血酸尿酸等的干扰【5 l i 。除此之外，还发展了一些其它新的生物材料固定方 法。例如利用聚合物材料水溶性对p h 变化敏感的特性，用阳极电化学氧化或阴 极还原水，使电极表面附近口h 发生改变，从而改变聚合物的溶解度。使其沉积 在电极表面，生物材料可随聚合物嗣时沉积在电极表面，从而将生物材料固定， 这种方法具有固定重复性高、生物组分活性良好保持等优点1 5 2 i 。 1 。2 。4 纳米材料在生物传感中的应用 第l 章绪论 体积小、灵敏度高、特异性强和易于集成化是传感器研究所追求的目标。 基于纳米材料的传感器正好满足了微型化与集成度的要求，因此受到研究者的 关注 纳米科学技术是2 0 世纪8 0 年代初迅速发展起来的新型前沿科研领域，1 9 9 0 年在美国巴尔的摩召开的第一届国际纳米科学技术会议，正式标志着纳米科学 的诞生【锄纳米是一种计量单位，它特指粒径在1 - 1 0 0 衄的颗粒，纳米科学是 指研究在l 1 0 0 劬尺寸范围内物质具有的物理、化学性质和功能的科学这一 尺寸大小的粒子处在原子、分子为代表的微观世界和宏观物质世界交界的过渡 区域，因此，纳米颗粒产生了常规颗粒所不具有的新效应 1 、表面效应：指纳米粒子表面原子数与总体积原子数之比随粒径的变小而 急剧增大，从而引起性质上的突变表面原子数的增加，原子配位的不足，使 纳米材料具有很高的表面自由能，表面活性很强； 2 、体积效应：由于纳米粒子体积极小，包含数日极少的原子，相应的质量 也很小，因此，呈现出与常规物质不同的性质； 3 、量子尺寸效应：当粒子的尺寸小到某一值时，金属的费米能级附近的电 子能级由准连续变为离散，纳米半导体微粒存在不连续的最高被占据分子轨道 和最低未被占据的分子轨道能级，从而使得能隙变宽，这种现象称为量子尺寸 效应；二 4 、宏观量子隧道效应：纳米粒子具有贯穿势垒的能力，称为隧道效应。近 年来，人们发现一些宏观量，例如微颗粒的磁化强度、量子相干器件中的磁能 量以及电荷等亦具有隧道效应，它们可以穿越宏观体系的势垒正是具有以上 特性，使得纳米颗粒与生物材料有着特殊的相互作用，人们已经将金属纳米粒 子、碳纳米管以及磁性纳米粒子等应用到化学、生物分析及传感器设计中。 纳米技术引入生物传感器领域后，提高了生物传感器的检测性能，并促发 了新型的生物传感器。因为具有了亚微米的尺寸、换能器、探针或者纳米微系 统，生物传感器的化学和物理性质和其对生物大分子或者细胞的检测灵敏度大 幅度提高，检测的反应时间也得以缩短，并且可以实现高通量的实时检测分析。 1 2 5 干扰因素的考虑 在生物样品测试中，要考虑许多干扰因素。主要分电活性物质和非电活性 物质干扰。电活性物质指氧、抗坏血酸、尿酸、乙酰氨基酚等具有氧化还原能 6 第l 章绪论 力的物质，它们有可能参与电极反应。非电活性物质是指一些生物大分子，尽 管不参与反应，但易包裹沉积在电极表面而严重影响电极的响应。因此，在制 备酶传感器时要考虑捧除或减少干扰。方法一是选择合适的工作电位，使电活 性干扰物质在此不发生反应如利用普鲁士蓝修饰电极结合酶的固定制备的酶 传感器，对h 2 0 2 的检测的电位降低了，可减小干扰( 1 ) 也可选用适当的电子媒 介体来降低工作电位i 剐另一种方法是利用一层膜阻挡干扰物接近电极。如用 醋酸纤维素酯膜包裹酶电极，利用渗透膜的空问位阻效应隔离一些干扰性大分 子；利用阴离子聚合物n a t i o n 膜可防止其他带电离子对电极的沾污【跚。一种新 的方法是使用不溶性的金属氧化物作为消除干扰试剂，在电极上形成一层强氧 化物膜，干扰物接近时先遇到氧化物膜而被氧化物除去，在金属氧化物中p b 0 2 的效果最佳【铜 1 。2 。6 媒介体的选用及组装方法 酶电极的催化研究经历了三个发展阶段即以氧为中继体的电催化( 第一代 生物传感器) 。基于人造媒介体的电催化( 第二代生物传感器) 和直接电催化( 第 三代生物传感器) 第一代生物传感器受溶解氧的限制，为了客服此缺点，一些 电化学活性良好的媒介体被应用于生物传感器的构造，产生所谓的第二代生物 传感器即介体型生物传感器。常用的媒介体有：铁氰化物，有机染料，醌及其 衍生物，导电有机盐类和二茂铁及其衍生物。 第一代生物传感器是利用氧作为媒介体，以葡萄糖氧化酶为例，作用机理 如下： 葡萄糖+ 0 2 - - h 葡萄糖酸+ h 2 0 2 葡萄糖+ 葡萄糖氧化酶( o ) 一葡萄糖酸内酯+ 葡萄糖氧化酶( r ) 葡萄糖氧化酶( r ) + 0 2 一葡萄糖氧化酶( o ) + h 2 0 2 这种酶电极响应信号与氧的分压或溶氧有关，而且通常利用的是生成的h 2 0 2 在 电极上的电氧化的输出信号来指示底物浓度的，较正的工作电位会使其它活性 物质氧化而造成干扰信号。将酶固定在铁氰酸盐修饰电极上制备酶传感器l ”， 利用它对h 2 0 2 的电还原催化在较低的电位下进行，可消除干扰而达到检测目的。 第二代生物传感器就是利用人为加入电子媒介体来解决传递电子的问题。 这种电子媒介体是具有电催化作用的氧化还原体，起到了酶与电极之间传递电 子的作用。其电子转移机理如下： 第1 章绪论 介体( r e d ) 一介体( o x ) + e 葡萄糖氧化酶( o x ) + 葡萄糖一葡萄糖氧化酶( r e d ) + 葡萄糖酸内酯 葡萄糖氧化酶( r e d ) 研体( o x ) 一葡萄糖氧化酶( 0 岫研体( r e d ) 最初是将电子媒介体加入到底物溶液中，降低了工作电位，减少干扰。但 它不能循环使用，且不适于特殊环境下( 活体检测) 操作目前多是将其修饰 于电极上。优良的电子媒介体应具备如下性质：a 、可与酶的氧化还原辅基快速 反应，提高响应电流密度；b 、能吸附或滞留在电极表面；c 、呈现可逆的电极 反应动力学；d 、具有较低的氧化还原电位，并与p h 无关；c 、氧化还原形式能 稳定存在；f 、对氧惰性或非反应活性；g 、具有生物兼容性，无毒性的。最早使 用的电子媒介体为高铁氰盐及醌类但他们溶解性大，不宜固定目前用于生 物传感器研究的电子媒介体可分为小分子媒介体和高分子媒介体小分子媒介 体包括：亚铁氰化钾【蜘、二茂铁及其衍生物【删；染料类如亚甲基绿1 6 l 】、亚甲基 蓝嘲、麦尔多拉蓝旧j 、靛酚类州等：醌及其衍生物嗍：四硫富瓦希( t r f ) 及 其衍生物嗣和导电有机盐t 叨等。高分子媒介体主要包括变价过渡金属离子鳌合 物型高分子媒介体如锇的吡啶配合物聚合物旧】等。小分子媒介体经常是将小分 子媒介体插入或键合到高分子载体的链上，由于它的高分子链间的互相缠绕或 交联可防止流失。但也有可能造成慢的电子转移速率，使响应时间延长不同 的电子媒介体对不同的酶反应电催化的工作电位不同。响应的电流密度也不同 电子媒介体在电极上的固定也很关键，电子媒介体的流失会对传感器的灵 敏度影响很大。固定方法有多种。一类是将电子媒介体吸附、电聚合于电极上嗍， 然后再固定酶上去。一类是将电子媒介体、酶同基质或聚合物一起固定于电极 上【他7 “、不同的酶、媒介体、电极，固定的方法不同，效果也不同。文献【明利 用环糊精聚合物的包合作用将电子媒介体包合于环糊精单体的空腔中同时酶固 定于环糊精聚合物上，从而保证酶膜中较大的电子媒介体浓度。 第三代生物传感器为所谓的无介体传感器。利用酶与电极的直接电子转移， 而无需加入其他试剂，减少操作步骤，这种传感器可称为真正意义上的“无试 剂”传感器，是理想的生物传感器。人们也一直在致力于这方面的研究。这种 传感器与氧或其它电子受体无关，无需媒介体。由于酶分子的电活性中心在分 子的内部，且在电极表面吸附后易发生变形，使的酶与电极间难以直接进行电 子转移。目前研究较多的是辣根过氧化酶与电极的直接电子转移行为【7 土7 4 1 。另 外可采用通常的媒介体物质修饰酶分子上的氨基酸残基，使酶本身具有传递电 第l 章绪论 子的能力，将这种媒介体修饰的酶固定于电极上，直接进行电子转移。v l a u r i n a v i c i u s l 7 5 1 基于吡咯并喹啉醌依赖型葡萄糖酶固定于部分水解的聚对苯二 酚葡糖苷制得无试剂生物传感器，酶的氨基与部分水解的含苯醌基团的聚合物 上的醛基结合，使这个修饰的酶本身具有电子媒介体的作用。但它的响应仍较 慢，需迸一步优化。 1 3 二茂铁及其衍生物的结构、电化学性质及应用 二茂铁是五十年代发现的一种结构性质特殊、具有重要理论价值和广阔应 用前景的茂金属化合物的典型代表。1 9 5 1 年末和1 9 5 2 年初，k e a l y 和p a u s o n 与 m i l l e r 两个研究组首次分别独立地报道t - - 茂铁的合成与分离【7 6 7 7 1 。1 9 5 2 年， w t l k i n s o n 及合作者通过红外光谱、磁化率以及偶极矩的测定，判定二茂铁具有 夹心型的结构【7 l 】；f i s c h e r 等人通过x 射线衍射的研究。认为二茂铁具有五角反 棱柱的结构【明。为此，f i s c h e r 和w i l k i n s o n 共享了1 9 7 3 年n o b d 化学奖。之所 以把此殊荣给予w i l k i n s o n 等，是因为二茂铁结构的确定，有着重要的历史意义。 由于二茂铁的稳定性，结构和成链状况的独特性，向传统成键作用描述方法提 出了挑战，大大激发了化学家的想象力，这一难题的解决，反过来又推动了金 属有机化学的迅速发展。2 0 0 1 年j o r g a n o m e t c h e m 为纪念二茂铁发现五十周年 曾出版了纪念专刊( s p e c i i ai s s u ef o r “5 0a n n i v e r s a r yo ft h ed i s r v e r yo ft h e c o m p o u n df e r r o c e n e ) 。 1 3 1 二茂铁的结构与性质 二茂铁是一种橙色棱柱状晶体，在1 0 0 以上易升华，m p 1 7 3 ，b p 2 4 9 ，可溶于乙醇、乙醚和烃类等有机溶剂中，不溶于水但随水汽蒸发，常用水 汽蒸馏法加以纯化。二茂铁在空气中稳定存在，4 0 0 以下不分解，它在碱性介 质中极稳定，但在酸性介质中易被氧化为蓝绿色的二茂铁离子( f e r r c i n i u m ) ， 后者溶于水，可还原为二茂铁，这是一个可逆过程： ( c 2 h 5 ) 2 f e + ( c 2 1 5 ) 2 f e 橙色蓝绿色 二茂铁不易发生还原反应，即使在苯催化加氢条件下也不被还原，却易发生亲 电取代反应，而且比苯容易的多，这是它芳香性的突出表现。二茂铁又名双环 茂二烯合铁，结构属于夹心型，2 价铁离子被夹在两个平面环之间互为交错构型， 9 第1 章绪论 f e 2 + 的d 电子( d 6 ) 与两个环戊二烯基负离子提供的电子( 2 x 6 ) 之和符合1 8 电子规则，是一种稳定的分子。在溶液中两个环可以自由旋转，在环上能形成 多种取代基的衍生物。合成的衍生物主要包括单、多核二茂铁配合物、二茂铁 基聚合物、二茂铁分子树络合物、手性二茂铁配合物、二茂铁簇状衍生物等 结构决定性质，性质决定用途。尤其将二茂铁引入到各种结构的分子中而得到 衍生物，由于其具有独特的电化学和光学特性以及其他性质，已引起研究者的 广泛兴趣，至今长盛不衰。下面仅从催化、电化学及光电功能材料、医药、添 加剂等方面作一概述 1 3 2 二茂铁及其衍生物的应用 1 催化方面 二茂铁衍生物在不对称催化、羟醛缩合、烯烃常压氢化、苯酮氢化硅烷化 反应中应用广泛【删特别是在不对称催化方面，手性二茂铁膦配体以其独特的 刚性骨架和良好的电子效应从众多的手性配体中脱颖而出，其优异的催化活性 和对应选择性引起了许多化学工作者的注意，不断合成新的手性二茂铁配体成 为上个世纪9 0 年代以来不对称催化研究的热点之- - ! 】 2 电化学及其光电功能材料 极化的二茂铁衍生物具有独特的电化学及光学特性，连接吸电子基共轭体 系的二茂铁衍生物表现出很大的二阶非线性光学响应【明利用二茂铁基团的可 逆氧化还原特