（应用化学专业论文）抗菌α谷氨酸三肽磺胺复合物的合成研究.pdf

四川大学硕上学位论文 抗菌一谷氨酸三肽磺胺复合物的合成研究 应用化学专业 研究生张昌中指导教师李天全教授 本论文用液相法合成了文献尚未见报道的n 一谷氨酸三肽( g l u - g l u - g l u ) 和 n 一谷氨酸三肽磺胺复合物。目的在于将谷氨酸三肽良好的生物相容性、保 湿性和药物缓释功能与磺胺药物良好的抗细菌感染作用有机的结合，得到一 种医用新材料，为进一步研究其药用价值提供了物质基础，同时也为合成短 肽类药物缓释材料提供了一种参考方法。 本文成功地对谷氨酸的氨基，y 羧基进行了保护，得到了b o c g i u ( o b z l ) o h 和o l u ( o b z l ) o b z l 中间体。这些中间体通过薄层色谱( t l c ) 、熔点、红外分析 确认。在合成g l u ( o b z l ) o b z l 时，运用正交实验设计确定了最佳的实验条件： 当谷氨酸用量为2 9 4 9 时，苯甲醇用量为2 0 m l 、对甲苯磺酸用量为5 1 6 9 、反应 时间为8 h 、反应温度为1 4 0 ，产率最高。 接肽和生成磺胺复合物反应采用n 羟基苯并三唑( h o b t ) 、n ，n 二环己基 碳二酰亚胺( d c c ) 为复合缩合剂，n 一甲基吗啡啉( n m m ) 为反应体系p h 调 控剂，t h f 为溶剂。在p d c 催化下氢解选择性去除苄酯，部分产物用于合成磺 胺复合物，叔丁氧羰基( b o c ) 谷氨酸三肽和叔丁氧羰基( b o c ) 谷氨酸三肽的 磺胺复合物的叔丁氧羰基( b o c ) 用h c l 乙酸乙酯脱去。反应后得到的粗品用 硅胶柱色谱纯化，粗品肽用乙醇和水重结晶。所得的化合物经t l c 、红外分析、 核磁共振氢谱确认。实验表明，在液相法逐步接肽过程中，用h c i z , 酸乙酯去 叔丁氧羰基( b o c ) ，在n 羟基苯并三唑( h o b t ) 、n ，n 二环己基碳二酰亚胺 ( d c c ) 及n 一甲基吗啉( n m m ) 存在下接肽和生成复合物，是一种可供选择 的方法。 关键词：a 一谷氨酸三肽磺胺复合物氨基酸保护 璺业盔兰堡主兰堡堡塞一 s t u d yo ns y n t h e s i so fc t - g l u t a m i ca c i dt r i p e p t i d ea n d p e p t i d y l s u l f a n i l a m i d e m a j o r ：a p p l i e dc h e m i s t r y s t u d e n t ：z h a n g - c h a n g z h o n g s u p e r v i s o r ：p r o f l i t i a n q u a n i nt h i s p a p e r 口一g l u t a m i ca c i dt r i p e p t i d e a n dp e p t i d y l s u l f a n i l a m i d ew e r e s y n t h e s i z e dw h i c hh a v en o tb e e nr e p o r t e db e f o r e t h ep e p t i d y l s u l f a n i l a m i d ec a nb e u s e da san e w s t y l eo fm e d i c a lm a t e r i a l s i nt h i sp a p e ra m i d oa n d7 - c a r b o x y lo fg l u t a m i ca c i dw e r es u c c e s s f u l l yp r o t e c t e d b yt e r t - b u t o x y l c a r b o x y l ( b o c ) a n db e n z y l ( b z l ) p r o d u c t sw e r ec o n f i r m e db yi n f r a r e d s p e c t r a ，m e l t i n gp o i n ta n dt l c w h e ns y n t h e s i sg l u ( o b z l ) o b z l ，t h eo p t i m a l o p e r a t i o nv a r i a b l e sw e r ed e t e r m i n e dt h r o u g ho r t h o g o n a le x p e r i m e n t ：w h e n2 9 4 9 l - g l u t a m i ca c i d ，2 0 m lb e n z y l a l c o h o la n d5 1 6 9p a r a t o l u e n e s u l f o n i ca c i da r e i n t r o d u c e d ，r e a c t i o nt e m p e r a t u r ei s1 4 0 ca n dr e a c t i o nt i m ei s8h o u r , t h eh i g h e s t y i e l dw a so b t a i n e d h o b t ，d c cw e r eu s e da st h ec o u p l i n ga g e n t s ，n m mw a su s e dt or e g u l a t ep h ， t h fa n dd m fw e r eu s e da ss o l v e n t h c l e t h y la c e t a t ew a su s e da sd e p r o t e c t i n g r e a g e n t b e n z y lg r o u p sw e r er e m o v e df r o mt h ep r o t e c t e dp e p t i d eb yc a t a l y t i c h y d r o g e n o l y s i so v e rp a l l a d i u m - c a r b o n t h e c r u d e sw e r ep u r i f i e d b ys i l i c ag e l c h r o m a t o g r a p ha n dt h ec r u d ep e p t i d e sw e r ep u r i f i e db yr e , c r y s t a l l i z a t i o nu s i n ge t o h a n dh 2 0 p r o d u c t sw e r ec o n f i r m e db yi n f r a r e ds p e c t r a ，h n m r ，m e l t i n gp o i n ta n d t l c t h ee x p e r i m e n td a t ai n d i c a t e dt h a ti nt h el i q u i d - p h r a s es y n t h e s i su s i n gh o b t ， d c ca n dn m ma sc o u p l i n ga g e n t sa n dh c l e t h y la c e t a t ef o rd c p r o t e c t i o no fb o c m i g h tb eag o o dw a y o fc o m b i n a t i o nf o rs y n t h e s i s k e y w o r d s ：a g l u t a m i ca c i dt r i p e p t i d ep e p t i d y l s u l f a n i l a m i d e p r o t e c t i o no ft h ea m i n o a c i d 叫川人学硕上学位论文 1前言 1 1多肽合成研究的发展 多获含戏豹压受大约邑有1 0 0 多年熬辩闽。第一个狳段大致获1 9 0 1 年褥到 第一个自由肽开始到1 9 5 4 年合成催产素止，可以说这5 0 多年是多肽合成的基 璃羧爱。农这段辩润墨，积黍了大量台戏方法，羚含戒了不少毒特定矮孝秘功 能的多肽片段。第二阶段大致从1 9 5 4 年至7 0 年代中期，这段时期不仅人工合 残了谗多溪娃多黢，嚣虽嚣壤了雳会残方法疆究溪挂多默瓣结构秘瑗戆关系装 新领域。此阶段的一个重要特点是发现并成了一些活性与天然肽相似但结构 却逡为簿零豹默段。在缝会裁、绦护基霜、反应条传娃及产物的分襄秘缝佳等 方丽都有新的突破和发现。液相合成法、湖相合成法相继发展为多肽的常用合 成方法。擞近二、三+ 年为第三除段，越来越多的具有重要生物功能蛇滔性多 肽相继被分离并合成出来，其中包括神经歇1 1 j 、下成脑的释放和释放抑制激索1 2 l 、 肌默、无脊椎动物毒串经肽激索、d b i 肽( 苯劳二氮杂枣结合掷剑荆) 、胃肠歇( 髯、 肠和胰腺肽) 、胰岛素、其有免疫髓要性的多肽弘】、环孢菌素i 4 j 、胞壁酰肽( 糖 肽) 【5 】、多肽疫苗【6 l 、肾素一血管紧张素系统的多肽、血浆激肽【7 1 、心钠素( 8 1 、 甲状稼激素( 降钙索) 1 9 1 、肽类抗菌素瑚、肽类杀虫帮和除草帮、毒肷、甜 肽和苦肽【1 2 1 等。这阶段的典型成果有1 9 8 3 年b o l d 等人首次从心肌匀浆中分 离褥到酌蒜有藕尿和促屎镳摊渣功麓的心房肢。它豹发现修正了人们对心脏功 能的传统观念一认为心脏仪为一个单纯的威泵，丽现在认为，除了浆的功能外， 心箍还有肉分泌翡辘。多获生长戳孑”霉( p o l y p e p t i d eg r o w t hf a c t o r ) 是近圭尊发现 的另一类灞性肽。它对细胞分裂、增殖具商重要作用。正常细胞的增殖是一个 蘧发骞净瓣过程，其孛生长因子越着十分熏要豹调控俸嗣。理邑发现麓有菠下 生长因子、白细臆间介素、转化生长因子、神经生长因予铸，从分子水平研究 它戴在细藤调控：i 妻程孛熬俸爰，将僮我髓辩正鬻缎胞襄耱癌细藏豹辔蓬擞毽膏 进一步的了解，从而对战胜肿瘤越重要作用。在多肽的分离纯化方面，除层析 帮邃溶技拳终，袁效滚楣稳谱( h p l c ) 鹣寝矮为多酝蕊分离帮缝纯疆供了一个 新的更加有效的手段。 四川大学硕士学位论文 多肽合成的方法学也在不断地创别4 】。近年来新一代的保护基如胍基保护 基( m t r ) ，脱保护基剂如三氟甲磺酸脂硫代苯甲醚系列以及新一代缩合剂如三 氯唑的二甲胺代磷化物b o p 等不断出现，使合成方法不断丰富和完善，合成的 收率大大提高。无疑，肽合成方法的不断创新，必将进一步促进活性肽的结构 和功能关系的研究，开拓多肽生物学研究的新领域。 尽管如此，目前液相多肽合成中存在的“困难肽段”l 】5 】以及因缩合组分溶 解度低引起的反应不完全的问题依然存在，m e r r i f i e d 的多肽固相合成法提供了 一种快速、有效合成各种活性肽的有用方法。固相合成解决了液相合成中繁冗 的分离工作，减少了氨基酸的保护，得到一种方便有效的接肽方法，也解决了 液相合成中肽段的溶解问题。固相合成也有缺陷，最大的问题是“缺陷肽”的 积累。所谓缺陷肽是由于每步反应不可能1 0 0 地进行，导致肽段中某些氨基酸 的丢失。当合成肽链愈长时，缺陷肽的积累就愈多。另外产量过低也是问题之 一。因此在肽的长度适中并需要商业规模生产时，液相合成仍是首选方法。液 相法不仅可以提供结构确切的中间体，还可以逐步纯化，使产品满足对纯度的 苛刻要求。 1 2 聚签氨酸的研究进展 聚谷氨酸( j ) o l y g l u t a m i ca c i d ，p g a ) ，是由谷氨酸经肽镳结台形成的多敝“， 有n 型和y 型两大类，区别在于以d 羧基成肽键和以y 羧纂成肽键。聚谷氨酸 靛艇耪洚解、代谢、被机体吸收和箨渣，举荔产生积蓄和毒副作粥，有较好豹 应用前景，为各国竞相研戴的热点。p g a 最早是从日本纳驻中分离制各，现在 逶道 二学会成 玎翮微生物袋台1 1 霹郡讶激褥翻。宅钓分子链t 其有滔往较燕鹃羧 基( - c o o h ) ，能和些药物结合生成稳定的复合物，此类复合物被溶酶体酶降 瓣为肉添链耱交答氯酸，赘释藏赍莼凌，惫一释瑾怒熬药糖缓释末亨瓣l l 弼。 聚谷氨酸有如下特性： 1 2 1 改善药物的承溶性 天然药物中许多成份不溶于水，或在水中不稳定，从丽影响其药效。p g a 2 四川大学硕士学位论文 及其复合物的分子链上有大量羧基( - - c o o h ) ，具有很强的亲水性。p g a 可以通 过酯键、腙键、羧羟基被氯离子或其它离子取代等形式与药物结合，也可以与 药物形成包合物。例如抗癌药喜树碱可通过自身的功能性基团与p g a 的羧基相 连，或者通过连接中间体如甘氨酸或丙氨酸与p g a 相连，所形成的c r _ 一p g a 复合物水溶性大大增加，p g a 的载药量约为1 6 t 2 0 - 2 1 1 。复合物对同源和异源的 肿瘤都保持较高的活性。 1 2 2 降低药物的毒副作用 p g a 可增强药物的稳定性并降低其毒副作用。许多药物在发挥疗效的同时 也具有一定毒副作用，长期使用会对人体造成一定的伤害。例如临床证明，化 疗药物往往缺少对肿瘤细胞的选择性杀伤，正常细胞往往也会同时受到药物分 子攻击，这样给癌症化疗患者带来较大的全身性毒副作用，如表阿霉素，顺铂1 2 2 】 等。 徐风华等1 2 3 “】研究p g a 与表阿霉素( p h a r m o r u b i c i n ，p a r ) 直接交联以及 p g a 与表阿霉素间插入甘氨酸( g 【，y ) 两种聚合物，同时考查了用腙键连接的复 合物的稳定性，及p h 敏感性。表明了表阿霉素与p g a 交联后药物稳定性提高， 降低了对心脏的毒性，并可使白血病小鼠存活时间延长，最长可达5 0 天。 1 2 3 提高药物的缓释及撩释作用 p g a 相对分子质量犬，代谢缓慢，可以控制药物释放。将药物键合到载体 上，也可采用贮露系统或嚣架系统缝合药妨，剥髑改变材糕熬亲、琉拳惶、莓 嘏性和酸碱性等方法调节药物的扩散速度和材料自身的降解速度，达到控释效 果f 2 5 1 。 7 0 年代起，美国犹他大学k i m 等将避孕药物炔诺酮( n o r e h i s t e r o n e ，n t t ) 通过共价键与p g a 结合，丈鼠体外及体内的释放试验表明，炔诺期的释放时闻 达到3 0 0 天，丽p g a 在体内降解看的单体并不在生物体内积蓄。m i h as 等脚j 研究用3 h 标记的炔诺酮3 。在二环已基碳二亚胺的作用下与p g a 结合成前体药 物，炔诺黼放前体中的释放是零级过程，疆释效聚较好。 对p g a 进行谶一步修饰，可获得更好的缓释和控释性能，有效保持药物的 塑登盔兰堡圭塞垒望兰 滔性，改羲药物瓣释放魏线。h o s t ck ，s c h a c h le 等1 2 7 1 把抗癌蕊丝裂撼索 c ( m i t o m y c i nc ，m m c ) 与复台物骨架聚( n 2 羟乙基一l - 谷氨黼胺) ( p e g ) 聚合后， 再将p e g 移植上虫。小鼠实验表明，聚合物经p e g 修饰朦与未经修饰的相比 在觎液中w 以存在趸长对间，达到凡个小时，p e g 豹修饰可降低肝脏的吸收p m a r k l a n d ，c o b d o nl 等【2 8 】制各了p b l g p g a p b l g 三联体挟聚物( p b l g 为y 一 苯基l 谷羝酸) ，戤聚合彩可达到药物控释磊的。 p g a 及其衍生物也可应用于微球中，潘仕荣【2 9 】发现以巍氨酸- 豁氮酸苄酯共 袋物为载体翻备了1 8 - - 甲蒸炔诺鞘酶徽臻释放系统啦，妻径为8 2 6 - 1 3 3 # m 该缓释系统体外释翁规律撼本符合h i g u c h i 方程式，释药量和释药速度取决于载 体复合貔瀚纯学绪梅帮徽球球径。z u p o n l 3 1 1 镥l 备了绥诺酮p o a 镦球( 盏径1 0 0 - - + 8 0u 曲，药物包封率分别为3 9 和6 0 ，体外释放2 6 5 d 。冯敏等【3 2 1 合成了不 爱聚琵豹p g a 苄聚一签爨酸甲配莛聚耱( p b m g ) 俗系，翻备荚髂粼镬璩，瞧速 到缓释目的。 1 2 4 增强药物豹靶向性 靶向绘药系统是一种商效的给药方式，理想的靶向绘药系统威在靶器富或 作用部位释药，这样不仅能大大提随疗效还可降低药物对其它器官的毒副作用。 靶囱给药系统因其其有提离药锈辩靶组织静药理俸周强度移减少药物对正常细 胞的毒副作用的显藩特点融成为研究的方向。研制高效安黛的药物载体是靶向 绘药离更蕊永平茇篪静关键，己研究静可戳俸先靶向绘药簸体豹耪辩有精豢体、 类脂质、蛋白、可生物降解的高分子聚合物等，其中聚谷甄酸及其衍生物作为 耗囱绘药裁蒋穗魄予冀毽毒| 瓣更其佐势：p g a 是种生物簿酶解多获，京俸蠹 能降解为豁氮酸单体，无毒副作用，这是其他材料难以比拟的。主链上存在大 量翕修镑静羧萋，霹戳襄豢载药燮，氇霹黻莲行葫靛纯修饰，形娥性能受佳豹 复合物。聚谷氨酸为弱阴离子型，能够在循环血液中保留较长时间，对靶向给 药矮考重簧塞义| 3 3 - 1 1 。p g a 瓣半嚣糖或茧箨耱醮纯复舍懿萄终为黪缍藏特殊药 物的载体，通过糖雅化的p g a 结裔作用把低分子质量的药物运送到肝细胞中。 动物羚辣内绘药静试验表明药物彝糖酯强懿p g a 笈会兹褒瑟薤孛蠢穰太歌蘩， 起到了靶向作用。糖酯化的p g a 在肝脏中由酶的作用能被迅速降解成内源性物 4 器粥夫学硬士学位论文 质谷氨酸，不会农体内产生积蓄和毒副作用。 1 ) 用于肝靶向给药：哺乳动物肝细胞特有一种高效内吞受体去曦液酸 糙蛋白受体( a s g p r ) ，它是一种专一性识别、结合并吞噬循环觑液中带有术 端半乳糖藏乙酰氮基半乳搪的糖鬣自1 3 5 j 。李崇辉蒋f 3 岛将i - 9 氨乙基半乳糖的颧 j 链氮基和聚一l 一谷氨酸( p l g a ) 的侧链羧基在1 一乙基- 3 - ( 3 一二甲纂氨基丙蒸) 碳 二薤骏黧羧盐 e d e ) 作用下经酰黢纯反应翻得半乳糖基聚貉氨酸 a l p l g a ) ， 并证明其可特异性与大鼠肝细胞a s g p r 结合，且亲和力随p l g a 上半乳糖 纂数磊懿漕窳焉瀵翱。a k a m a t s u 等辫汾翮沼2 - 亚胶2 甲麓蒺乙蘸琉代半巍糖苦 和甘露糖蒋修饰p l g a 得到其半乳糖基和甘鼯糖基衍生物，给小敞静注席发现 g 卿l g a 镀蓊实震缎| l 羹摄取焉羹露耱基聚谷氨羧( m a n - p l g a ) 被搿菲实缓细稳 摄取。 珏过e k ih i r a b a y a s h i 等p 霹对g 卿l g a 律兔翳靶囱载棒懿稷羧分毒与代滚情 况进行了详细研究，用川i n 标记g a l p l g a 后观察其在小鼠体内的分布情况， 发现静注蓐，寒掰半嚣耱骖镶懿”1 i n p g a 遮速姣斑浆孛滚豫，其主要狡聚予弩 和尿液内，大约给药量的1 5 聚集于肝，并主要分布于非实质细胞；而用半乳 德修馋熬“1 i n - g a l p g a 坡翳大量摄取，终捡测有3 5 孵瞻h 1 i n - g a l ，p l g a 被翳实 质细胞摄取，仅0 3 被非实质细胞摄取，被肝吸收的1 i n g a l p l g a 有7 0 在 3 0 分钟内投降解，在给药6 小时题其9 0 撄被黪解必小分子憋质，元蓄积现象， 证明p g a 县良好的生物降解性。他们还成功地用g 舯l g a 将维生素k 5 输送 至小鼠肝中，止敷效果大大增强。因此用g a l p l g a 作为载体，嶷接将药物与 其结合，可以产擞较好的肝靶向效果。c h o 等1 3 9 懈g a l p l g a 作为一些细胞调 节荆，如袱水仙碱( c o l c h i c i n e ，c o ) 、细胞松弛素( c y t o c h a l a s i nb ，c 3 、泰素( t a x o l ， t x ) 的纳米微粒毯衣，通过受体介导机制被肝细胞吞噬而发挥作用。 2 ) 用于抗体靶向给药；在尝试将肿瘸的特异性抗体誊接与细胞毒性药物结 禽雨实璃靶囱给菊的研究中，发黼药物譬抗体结会后，要么药物的活性受阻， 黉么抗体的活性受阻。另外。还存在载药摄小、稳定性差等问题1 4 0 1 。采用p g a 俸为抗体每药秘瀚共同裁俸弱可戳同辩傈持药物的话往和抗体的靶向往，有效 地解决上述问题。 大酃分瘗细胞静p 德较正常缀胞繇，将载体与药物之闻豹连缓键设计为对 酸敏感而在中性条件下稳定的键( 如腙键、顺乌头酸键) ，这样结合的药物在循环 嚣弼支学颈学垃论文 过程中进入癌细胞后彳释放并使瘸细胞致死。徐风华等 4j - 4 2 制得液阿霉索与抗 肝癌细胞膜单克陵抗体( m c a b ) 的免疫偶合物，并将寝# 可霉紊分予与p g a 衍生物 相结合，其载药量为i ：l l ( 每1 1 个舔氨酸单体含1 分子表阿霉素) 。研究表明该 革抗- p g a - 表阿霉豢免疫镛合物较好箍保辩了药物抗体的浠性，俸辫实验显示其 对癌细胞的杀灭作用明显高于对藏常细胞，对靶向细胞有较好得选择性杀灭作 搦。 些瘸细胞中含有很多纤维蛋白酶活化原，可产生鞍多的纤维蛋白酶。利 蠲这一特瞧，胃逶遗短敖审满体与p g a 鞠连，这爨其在弦环辩不会释药藤弱癌 细胞内肋镳即被酶切断后释药的目的。m y e r s 等【4 3 】把具有细胞毒性的抗癌药物， 魏道港霉累( d a u n o m y e i n ，d m ) 逶避孛润传譬p g a 瓣铡链羧基穗结会，这个中润 体可以是一个氨基酸，也_ 町以是几个同种藏不同种的氨基般组成的短肽，然后 药物一载搭复合携霉与靶肉裁翅表皮生长鞭子( e g 寥) 特雾拣缝合爨瓣瘗缨戆主， 还可以促j l 复合物被细胞内吞，其药物的释放是邋过癌细胞的胞内酶降解裁体 瑟实现。灾骏证明这秘复合甥吃游亵戆d m 对鳞、捩上皮缨腿癌更蠢蓉辏力，显 会选择性杀死肿瘤细胞，而不会像游离的d m 那样殃及正常细胞。 r u n g e 等m j 磺究了免疫毒素复食物对浚疗恶谯瓣癌故效月，戳1 乙基。3 ，f 3 二甲基氨藜丙基) 碳二亚胺( e d c ) 来激活p g a 的羧藏，然后冉将对氮苯基肿黢通 过肽键连到羧基上，把e d c 取代下来；p g a 再与抗- a 抗体( 一季争特舅性识别叙 利驻太鼠胰腺癌细胞的抗体) 共价雅合形成药物一抗体复合物。初步实验显示， 载体能够搬药物输送到肿瘸部位，释放对氨苯基辨酸，减少甚至瀵除癌细胞， 对大鼠胰腺癌有效。 王金薄等【4 5 l 以p l g a 为中贪载体，将挽癌药瓤糖飓苦( c y t o s i n ea r a b i n o s i d e ， a 稿c ) 与针对久类自盥病静擎克建筑体( h i m 6 ) i 耘j 疵鬟含耪，就药耪抗体复龠耪 基本保持了游离单抗对抗躐的亲和灞性，煳腿毒性比游离的a r a c 略低，假对非 嚣l m 6 靶蠢豹拜缩藏痞没有缎胞毒拣，显示蹬缁熬繇性魏专一链。 光动力学治疗( p h o t o d y n a m i c t h e r a p y ，p d t ) 是釉新型的有选择性的治疗恶 链辨瘩瓣方法，瓷p d t 中，无毒牲戆竞敏裁会魏党聚集在辩瘤缨稳牵，翔莱 将光敏剂鸟单克陛抗体结食，因为双重选择性作用，其专性会有逅大提离。 ( o f f 等 4 6 1 遴过p o a 特二氢时酪 i 雪生辏 一静意矮瓣与o c t 2 5 ( 天露鬃瘗爨魏上撬 原c a l 2 5 的抗体1 结合起来，发现其对卵巢癌细胞祭的选择性大大增强，光杀伤 6 四川大学硕士学位论文 的有效性并没有减弱。 3 ) 用于纳米胶束载体通过载体形状大小的改变以及表面的改性( 微粒、毫微 粒) 可实现被动靶向给药。冯敏等即】将聚乙二醇( p e g ) 与聚谷氨酸y - ：苄酯( p b l g ) 复合制备了p e o p b l g 嵌段共聚物。在亲水溶剂中，它会自动形成胶束状球 体，其p b l g 段为刚性较强的分子，内聚形成载药内核；p e g 段具有较高的柔 顺性，在p b l g 内核表面形成水合性外壳，掩蔽内核免受生物体内网状内皮系 统( r e s ) 中巨噬细胞，如肝脏中的k u p f f e r 细胞的识别，延长毫微粒在体循环中 的停留时间。两性霉素b ( a m b ) p e g p b l g 载药胶柬的体外分布实验表明， a m b 胶柬与游离a m b 相比，前者对r e s 仍有较大的趋向性，但主要摄取部位 是脾而不是肝，可发挥其非肝位药效，且延长了其体内循环时间：前者在肾的 分布低于后者，有利于增加耐受剂量及减轻肾毒性。同样，o h 等1 4 9 1 用制备的 p b l g 聚乙撑氧( p e o ) 纳米微团来包裹亚德里亚霉素，使其在体内的循环时间 更长，体内分布更均匀，避免了因局部浓度过高而产生细胞毒性。 目前聚谷氨酸的生产技术主要有化学合成法、提取法、生物聚合法。其中 化学合成法又包括( 1 ) 传统的肽合成法：是将氨基酸逐个连接形成多肽，一般 包括基团保护、反应物活化、偶联和脱保护等单元反应。化学合成法是肽类合 成的重要方法，但合成路线长、副产物多、收率低，尤其是含2 0 个氨基酸以上 的纯多肽合成。( 2 ) 二聚体缩聚： 由l g l u ，d - - g i u 及消旋体( d l - - g l u ) 反 应生成a 一甲基谷氨酸，后者凝聚成谷氨酸二聚体后，再和浓缩剂l - ( 3 一二甲 氨丙基) 一3 一乙基碳亚二胺盐酸盐及l 一经苯基三毗咯( 1 一h y d r o x y b e n z o t r i a z o l e ) 水合物在n ，n 一二甲基甲酰胺中发生凝聚，获得产率为4 4 - - 9 1 、相对分子质量为5 0 0 0 - - 2 0 0 0 0 的聚谷氨酸甲基酯，经碱性水解变成y p g a 。 因为二聚体缩聚法得到的产物为混合物，要想制得确定分子量的低聚谷氨酸， 必须采用传统的肽合成法。本课题就是用传统的肽合成法合成。谷氨酸三肽， 并进一步合成它的磺胺复合物，使其成为磺胺类药物的载体，为进步研究其 药用价值提供物质基础。 四川大学硕士学位论文 2 课题设计 c h a k r a v a r t y l 58 】等利用正常细胞与肿瘤细胞酶系之间的差异，将抗肿瘤药物 与短肽结合，制得v a l l e u l y s 三肽与对氨基苯基氦芥、阿霉素结合的短肽前 体药物。这些药物在肿瘤细胞内的血纤维蛋白溶酶作用下断裂肽键，释放出药 物，显示出一定的选择性。罗毅等d g 合成了短肽5 一氟尿嘧啶酯，并进行了体 外抗肿瘤活性的试验，呈现较好的体外抗癌活性。参考以上文献结果，本文准 备合成一种可以用作烧伤或其它患疾用外敷材料的短肽磺胺复合物。它可以防 止烧伤患处感染，防止机体失水，同时它的药物缓释作用，可以保持长时间的 抗菌效果。 谷氮羧三肽其骞良好的生物桷骞性，同时其分子链上瓣羧基( - - c o o h ) 具有 较好的保漱性，是烧伤患处良好的外敷材料。当烧伤患她的新皮朦生长时，外 敷树料脱落或降解为无害的谷氨酸被人体吸收。谷氮酸三肢分子链上具鸯活性 较黼的羧藻( - - c o o h ) ，和一些药物结合生成稳定的复合物，不会弓l 起机体的不 良反应，可降解为内源性物质谷氨酸，并释放出药物，是一种理想的药用材料。 磺胺癸药是三十年代发现的能有效防治全身憾细菌性感染的第一类抗菌药 物。对某些感染性疾病( 如流脑、鼠疫) 、具有疗效良好，使用方便、性质稳定、 价格低廉镣优点，旅在抗感染的药物中仍蠢定舞甄位即l 。冀特点就是抗蘸广谱， 对众葡菌、溶血性链球菌、脑膜炎球菌，悫贺菌属大肠杼菌、伤寒杆菌，产 气秆菡及嶷形秆麓等寿蠹好抗萤活链，j 篼辩霹多数真菌，教原体、原虫遣肖效。 缺点就是不良反应较多。当与谷氨酸三肽结合生成复合药物时，可以降低它的 不菱反应，同露撵毒药麓佟溪对闽。 将抗菌药物与谷氨酸三肽的羧基结合缴成复合材料，可以提高药物抗菌效 豢。溺佟浇侥敷糕，霹转斑浇揍患薤感染，茨建瓤俸失承，溺辩窀蠡冬药彩缓释 作用，可以保持长时间的抗菌效果，有广泛的医用前景。 本漂熬鏊在爨涎痘建纯学合戏褥磺跤豹氨基每谷氨酸三弦熬羧基缝合生成 复合物，目的在于将谷氨陂三肽良好的生物相容性和药物缓释作用与磺胺药 兹嶷好鲍羧缨蓥感染终弱骞掇验终合， ：罄列一耱傀受的敷粒特爨是皮默烧痿 患处外敷材料。搬外用型磺胺类药物，如磺胺嘧虢银，与谷氨酸三肽结合时， s 四川大学硕 上学位论文 它的药效因缓释而改善，本课题也为此类研究提供了可参考的方法。 本论文研究a 谷氨酸三肽及其磺胺复合物的液相合成。主要工作就是谷氨酸 的氨基和y 一羧基的保护、接肽和磺胺复合物的合成，其中关键的工作就是氨基 酸的保护，在试验过程中力求确定最佳的保护方法和条件。本论文还要通过实 验确定中间体和产物的纯化方法，得到较高的产品纯度。 2 1 氨基酸保护 多肽合成就是如何把组成氨基酸单元按照设定的次序和方式连接起来。为 了得到特定顺序的多肽，须对氨基酸的氨基和羧基进行保护。般模式如图2 1 。 f -宁f -宁 x n h c h c o y + h 2 n c h c o o q 。- x n h c h c o h n c h c o o q 图2 1 接肽反应模式 f o g 2 1m o d e lo fp e p t i d er e a c t i o n x 和q 分别是氮基和羧基的保护基。 氮基酸的保护童要涉及羧基、鬣基跌及侧链基。氨基的保护要求封翅镀缀予 上的未共用电子对，以降低氨基的亲核性能。一种方法是将氨基酰化，使氮原 予上的孤彀予对秘羰基共辘，氮上的孤对魄子离域。另一糟方法燕使用体积大 的基团如【( c h 3 ) 3 c 】，遮蔽氮原子上的电子。氨基保护慕团大致有烷氧羰基， 酰基和烷綦三大类。其中滋于烷载羰基具有共轭效应和空闻位阻取重作用，放 较常用。苄氧羰基( z ) 因；( a ) 试剂较易制备和译入；( b ) n 苄氯羰基氨基酸 相废的肽容易结晶丽且比较稳定；( c ) 在活化时誉易消旋；( d ) 保护基可在较 温和的条彳牛下选择性脱去等特点而广泛霞掰。苄氧簇基( z ) 一般珂用氢解的办 法脱去，它对乙酸乙酯的h c i 溶液或三氟乙酸( t f a ) 是稳定的；叔丁氧羰基 ( b o c ) 舞i j 具裔如下特赢：( a ) 叔丁氧羰基一氮基酸，除个鄹矫都能褥铡结晶。( b ) 叔丁氧羰慧易于酸解除去，但也具肖一定的稳定性。( c ) 对碱水解和肼解稳定。 ( d ) 对溪住氢解稳定，毽院苄氧羰基靖簸要敏感褥多。敷丁氧羧基( b o o ) - - 般 用忍酸乙酗的h c i ( h c i e a ) 溶液或三氟乙酸去除。在多肽合成中这两种氨基保 9 四川太学硕士学位论文 护基可以互补使用。其它常用的烷氧羰藻保护基有：联苯异丙氧羰基( b p o c ， 鬟) ，芴甲氧羰基f f m o c ) ，忍爆氧羰基( v o c ) 。 z 多获会残审，羧基缀转蘸基酸瓣羧麓篱要活纯，箕宅羧萎列霉黉保护。一 般采用成酶的形式。使用最多的是苄酴、甲酯和乙醑。如果要得到的肽末端为 酰胺，也可以采用酰胺的形式加以保护。 2 1 答氨簸缣护 在肽合成中，当谷氮酸为羧基末端铽基酸时，a 羧基和侧链羧基可采用同 样基爨保护。 谷氨酸静羧基选择性绦护宥如下蠢法： 1 ) 在无水h c l 的倦化下谷氨酸直接与甲醇或乙醇反应，得谷氨酸的y 甲 酯或己酯。 2 ) s o c l 2 一c h 3 0 h 法褥￥。甲蘸或乙鹣。 3 ) 在高熹【艘催化下谷氮酸同醋酸甲醋进行转酯化反应也可直接得谷氨酸的 y 甲醑。 4 ) 盐酸、氯澳酸、氮殃酸或浓硫酸健纯下，鸯甄羧秘苯甲醇爱应褥到谷爨 酸虢￥苄酯。 氨基保护的谷氨酸羧撼的选择性保护： 1 ) n 一酰化谷氨酸的酸凝在二环己胺存在下i 司醇反应可得到n 酰化谷氨酸 1 0 土 岛b 一 一 o j c 神 州 d 四川大学硕士学位论文 o 酯的二环己胺盐。 2 ) a 酯为原料可以得到不同的y 酯。 路线如下： 乡0 ( q 1 2 f 1 z 堋l h 弋 3 ) 毗啶一3 一甲酵或毗啶4 一甲醇与谷氨酸反应得二酯，再用氢氧化锂选择性水 解可得y 。魁啶3 。单醇酯或y 目冼碇4 甲醇酯f 铷。路线如下： 四 i 大学硕士学位论文 ：q h ：0 啄w k c 0 2 h 挛心锄嚯 ( 、h 2 0 2 氏c 。2 h 志h b o c 4 ) b o c 保护谷氨酸q - 丁酗与b u o c o c i 反应后与i s o x a z o l i d i n e 殷应得d 丁基和y - i s o x a z o l i d i n e 保护的氨基黻，产物与对甲氧基苯镁反应得y 霹翠氧苯麓保护氨萋羧，其它蕴嚣零蹙，嚣分鬟激t f a 彝( b o c h o 楚理 使a 一丁藻脱去得y - 对甲氧苯基保护b o e 谷氨酸剐。路线如下： 5 ) 先以等爨的苄醇与谷氮酸反应保护y 位羧基，群以b o c 酸酐保护氨基。 路线如下： h o o c c h 2 c h ( q 心。h 燮l ( h p o c c 心c h 2 中删 n f ! h c 。h c o o h + n h 2 2 矗少 苫岁， 夕沁 零瞪 8 娜骶 固 o 一 吣 釜 避 鞋 k 沁 脱 腓 咐屯 f 帅 乱 一 固 霆翊太学疆士学证逊空 c h 3 - 麓o n co - 霎c - c h 3 + 阻h ：o o c c h ：c h 2 c h c o o h譬o c 一一一；+ 哎抛h 2 2 c h 3c h 3n h 2 本文采用默下方法保护答氨酸： 1 ) 羧旗完全僳护的谷氮酸合成，路线如下： + h o - 车, “c h 3 i e t h 。o c c h 2 c h 2 f h c o o h + ：耄k h 2 。h 宅器善- 耋k h 2 0 。c c h 2 c h ：f h c o o c ，b 囝 n 埯，t o s o h 2 ) y 一羧基被保护帮氮基被傺护的谷氨酸酶合成，路线如下： h 。o c c h ：c 鹣c h e 珏+ 钆h 2 0 h n h 2 型坠阻h 2 0 0 c c h 2 c h 2 c h c 蝴 n h 2 + 一c h ：o o c c h 2 c h 2 7 h c 。h n f l 2 一睇氇鼯知郴挚 c h t u e 珏1 1 3 卫 p 魄 b ( f ) 如 阱i 弋| c h 心 旷。 黼旷犯1 n p 嘣啪 奎l p r i 卜 犁 器j 鞋天学颈学位论文 2 2 肽的合成 2 2 。1 滚势j 的选撵 多肽合成中，溶剂的选择十分重要，特别是在液相合成中。如果需要遽接 的两个歇段或氨鏊羧的保护衍生物在反应溶剂中不能溶解，剜缩岔成获狠难实 现。在多肽液相台成中，常用的溶剂有四氯呋哺( t h f ) 、n n 二甲基甲酰胺 ( d m f ) 等，酒氨姨璃( 髓露) 沸点较低，易于蒸去，毽溶解麓力较祗。n n 二甲基甲酰胺( d m f ) 对禽谷酰氨( g i n ) 和天冬酰氮( a s n ) 肽以及一些较大的 歉跑瑟氢妖穗有较丈豹溶解往，毽其浇煮较离，慧买藏匿蒸镶方缝豫去。因魏 常使用混会溶剂来改善接肽反应中备组分的溶解性。n a r t i a 掣5 2 】人较系统地研 究了混合漆裁与获链二缀终擒及溶解度之藏耱关系。捂窭其有圣。缩擒魏歉溶簿 度岛溶剂的极性无关，但与溶剂的旗子接受能力关系极大。质子溶剂如醇，鼢等 分子戆国挂胃每默分子豹羰基形成氢键；稻辍 # 袋子溶裁鲡d m f 、d m s o 等 分子的c = o 、s = o 等基团可与肽分子的n h 形成缀键，从而大大掇高肽分子的 溶潮纯程度，降低敬链闽聚集静 | ；l 囱。著名戆敖耽学家y 鑫 i m a 5 3 谰滚耀片菠法 成功地合成了长达1 1 5 个残基的肽段，在不同的缩台阶段使用了不同的混合溶 刻。 2 。2 2 活化剂 氨基酸缩合成肽除反皮的方向性外，还有活性问题。羧基与氨基容易发生 酸、碱菱疵生成羧羧铵盐，两形戒麓胺的赢应是较难进行的。爻了澎成所辩肢， 需要提高反应活性。可以采用活化羧基的方法也可以采用灞化氨熬的方法，日 蓠，多获会藏大多采臻活识羧基静方法，箕基本原理就是兔将n 一保护氨基羧或 肽的a 一羧熬转变成活性更离的羧酸衍生物r c o x ，这里x 为吸电基团，可通道p a 装寝效寂秘受的诱导效敷，羡羰萋碳器予懿歪耄经提裔，绫两蠢稠予n h ：r 豹 亲核取代反应。一般来讲，取代基豳x 的吸电子性越强，其对羧熬的活化能力 篷越强。毽羲碳二驻蒎法、混合酸聚法、泼纯臻法、叠氯滚滚及& 一羧基内羧爵 法( n c a ) 都是依据这一思路发展越来的。一些活化中间体如下。 四川大学硕士学位论文 0 0 r 一4 。一一。一c c h 。c h 。，： m i x e dc a r b o n i ca n h y d r i d e 混合酸酐 o m 、- o - a c y l i s o u r e a ( d c c ) ， 0 一酰基异腮 r o o n c a 。n - 代内酸酐 r 一6 0人 r c o n f i a z i d e 叠氮化合物 刑其毅等在1 9 7 8 1 5 4 年首次提出四氢噻唑硫酮 ( t e t r a h y d r o t h i a z o l e 一2 一t h i o n e ，t t t ) 可以用于羧基活化以及多肽的合成，并 利用其成功地合成了促睡眠肽( d i s p ) 5 5 】。1 5 6 】通过x 一射线单晶衍射研究证明， 在常温下，其活性结构为酰胺。1 9 8 2 年以来【5 7 l ，在四氢噻唑硫酮的基础上加以 改进，发展了四氢噻唑硫酮的苯并衍生物及其类似物。 o 。一 一 9 。 四川大学硕士学位论文 四氢噻唑硫酮( t t t ) 活化酰胺( a c t i v ea m i d e ) 。8蒌鎏篓 9 x ：oy ：ob o o y = ul = ud u u 其活性组分有两种结构，即硫酯和酰胺。 一 卜l8c n x r 一、7 硫醑式酰胺式 x 射线单晶衍射证明b t t 为硫酯式，其余的为酰胺式。 这类活泼中间体可通过d c c 法制备，它们有一些共同的特点：( 1 ) 这类 活化中间体，尤其是苯并衍生物，结晶性能好，中间体制备产率高，易于纯化。 ( 2 ) 氨解反应条件温和，在肽合成中，选择性好。( 3 ) 稳定性好，在一般的存 放条件下可较长期存放而不分解。 本文用二环已基碳二酰亚胺( d c c ) 和卜羟基苯三氮唑( h o b t ) 为复合缩 合剂，氨基组分的酸用氮甲基吗啉( n 删) 中和。溶剂为四氢呋喃( t h f ) ，加入 少量的n ，n - 二甲基甲酰胺( d m f ) 可以增加溶剂的溶解能力。路线如下： 1 6 一 o i j 斗v卜 疆媸 学羲士学莅论文 辩螂 n h ， h 0 2 c s 0 2 叭f 醐 州h o c s h o e ， 1 7 帖 汹 龇 靴 z 删 涩 一 辩 | 5 卜 垮 嗽 m 一 多多 垂l 州 萝 。 泌 吵 峨 器翻天掌磋士擎控论文 2 。3 肽磺胺复合物的台成 c h a k r a b a r t y 等人在肽链上接上抗癌药镌，以此加强药物对癌缎胞的作用选 择褴，减少药物的毒副作髑跚，路线如下： b 昭d - v a i - l e u - l y s ( b o c ) c o o h 万h 2 n - 塑。c ( 邺c h z 嘞c h c 2 c 邺i ) 2 急= 卧帆y s ( b 0 c ) c o 。h n 一( c h 2 c h 2 c 根据间样原理，利用磺胺氨基与谷氨酸三肽羧基生成酰胺键，设计了豁氨 酸三默与磺胺结会约反瘟，爨线妇下： n = l ，2 ，3 ，4 鞠蚓太学矮擎经论空 3 实验部分 3 主簧试剂笔仪器 试爨 l 一谷氮酸 趣丁氧蒺鏊浆( b o o ) 转c c h o b t 死水乙醚 囊永己醇 三筑甲烷 浓硫酸 加鬣钯碳 鬣鼗镳 三魏甲烷 凭水甲酵 笨举醇 发烟硝酸 发潮硫酸 苯势戊三醚( 浆三黼) 三兰己鹱 浆 潮氢袄醺 纛酸乙繇 磺胺 a r 舔 矗r a r a r a r a r a r a r a r a r a r a 受 a r a r a r a r a r a r a r a r 1 9 上海华美徽物工程公司 斌豢三离燕偬公蔼疆供 上海余国他工厂 戒黎三离黛德公霉捷供 晨津市化举试剂六厂 蔽舔纯学试麓厂 蹦川德阳攀 i i i 化学试剂厂 羹痰诧学试赛i 厂 零实验室付磁龉提供 或舞秘嚣张王试剂厂 煎庆化学试剂厂 成部科龙化工试粼厂 戎帮懿建纯王试裁厂 成都化学试刹厂 上海振兴化工厂 上海三爱憨试裁糟限公霹 残都科麓饿工试裁厂 成都长联化工试荆有限公 镯 藏舔秘楚纯互试鞠厂 成都稀宠纯工试帮厂 天津科密欧化学试剂研发 孛一 四j i l 大学硕士学位论文 仪器 循环水式真空泵 分析天平 旋转蒸发仪 傅里叶变换红外光谱仪 x