（应用化学专业论文）大黄素纯化及其用于金丝桃素合成的研究.pdf

摘要 论文题目：大黄素纯化及其用于金丝桃素合成的研究 学科专业：应用化学 作者姓名：许丽梅签名：立亟监 指导老师：杜永峰副教授签名： 摘要 大黄素属1 ，8 二羟基葸醌衍生物，是大黄、虎杖、何首乌等多种中药的有效成分之 一。大黄素药理作用广泛，具有免疫调节、抗菌、抗炎、抗肿瘤等方面的作用。金丝桃素 是贯叶连翘中最具有生物活性的物质之一，具有显著的抗抑郁、抗病毒活性，贯叶连翘中 所含金丝桃素只有万分之几，加之提取分离方法不完善，只能得到极少量的金丝桃素，因 此采用化学合成的方法制备金丝桃素有极其重要的意义。本文以大黄素粗粉为材料，从节 约原材料、降低生产成本及提高产能等方面着手，研究大黄素的纯化工艺及以大黄素为起 始原料的金丝桃素的合成工艺。主要研究内容如下： ( 1 ) 确定了大黄素的最佳纯化工艺条件。分别采用正交设计法和均匀设计法对大黄 素的纯化条件进行了探讨，正交设计法优化的提取条件为：1 2 倍原料重的丙酮，回流浸 提3 次，6 0 m i n 次，浸提温度6 0 ，此时大黄素的含量和提取率分别为6 2 1 8 和4 7 6 2 ， 均匀设计法优化的提取条件为：1 4 倍原料重的丙酮，回流浸提3 次，6 0 m i n 次，浸提温 度5 5 ，此时大黄素的含量和提取率分别为6 5 0 4 和5 0 5 2 。结果表明均匀设计所得结 果优于正交设计，并将其定为最佳纯化工艺。 ( 2 ) 由于与大黄素结构相近的葸醌类化合物很多，低浓度大黄素远远满足不了市场 要求，因此本文对高纯度大黄素的制备进行了研究，分别考察了乙醇浸提法，重结晶法和 碳酸钠萃取法精制大黄素的工艺。乙醇浸提法和重结晶法对于高纯度大黄素的精制有明显 作用。碳酸钠萃取法是本文提出的新方法，用该方法进一步纯化大黄素，测定产品中大黄 素含量达8 5 6 5 ，萃取率达到6 2 1 3 。进一步重结晶后大黄素含量达到9 2 2 8 。建立了 条快速、简便、高效的纯化及精制工艺路线。 ( 3 ) 考察了以大黄素为原料合成金丝桃素的两种工艺。大黄素直接在碱性溶液中 经光照、加热缩合为金丝桃素，合成的金丝桃素的产率为5 1 3 6 ，纯化后含量达到7 0 1 6 。 将大黄素还原为大黄素蒽酮，再将其在吡啶及硫酸亚铁的溶液中直接缩合成金丝桃素。 金丝桃素的产率为2 6 5 1 ，纯化后含量为3 4 1 6 。通过红外光谱和分光光度法的综合分 析，确定了产物的结构与含量。以产品中金丝桃素的产率和含量为指标，可看出第一种方 法更好，为金丝桃素的化学合成奠定了坚实基础。 关键词：大黄素；纯化；金丝桃素；合成 西安理工大学硕士学位论文 t i t l e ：t h es t u d yo np u r l f i c a t l o no fe m o d i na n dl t s a p p u c a t i o nt os y n t h e s i sh y p e r i c i n m a j o r = a p p l i e dc h e m i s t r y n a m e ：l i m e ix us i gn a t u r e ：生型茎竺 s u p e r v i s o r ；a s s o c i a t ep r o f y o n g f e n gd u s i g n a t u r e ： a b s t r a c t e m o d i ni sak i n do f1 , 8 - d i h y d r o x y - a n t h r a q u i n o n ed e r i v a t i v e i te x i s t si nm a n yk i n d so f h e r b am e d i c i n ej u s tl i k er h u b a r b ，p o l y g o n u mc u s p i s t u ma n dr a d i xp o l y g o i l im u l t i f l o r i e m o d i nh a sm a n yp h a r m a c o l o g i c a lf u n c t i o n ss u c ha s i m m u n o r e g u l a t i o n , a n t i b a c t e r i a l ， d i m i n i s h i n gi n f l a m m a t i o na n dk i l l i n gt u l t i o u r s h y p e r i c i ni so n eo ft h em o s ti m p o r t a n ta c t i v e c o m p o n e n t si nh y p e r i c u mp e r f o r a t u ml h y p e r i c i nh a ss i g n i f i c a n te f f e c ts u c ha sa n t i d e p r e s s i o n , a n t i c a n c e ra n ds oo n h y p e r i c i ne x i s t sr a r e l yi nh y p e r i c u mp e f f o r a t u ml t h em e t h o do f e x t r a c t i o na n di s o l a t i o ni ss oi n c o m p l e t e ，a st ol i t t l eh y p e r i c i nh a sb e e no b t a i n e d t os o l v et h o s e p r o b l e m s ，h y p e r i c i nw a ss y n t h e s i z e df r o m e m o d i ni nt h ee x p e r i m e n t i t i ss i g n i f i c a n tt op r o d u c e h y p e r i c i nu s i n gt h em e t h o do fc h e m o s y n t h e s i s u n d e rt h ec o n s i n d e r a t i o no fs a v i n gr u d e m a t e r i a l s ，d e c r e a s i n gp r o d u c t i o nc o s ta n di m p r o v i n gp r o d u c t i o na b i l i t y , i nt h i sp a p e r , c r u d e e m o d i np o w d e rw a su s e da st h ee x p e r i m e n t a lm a t e r i a l t h ep u r i f i c a t i o no fe m o d i na n dt h e s y n t h e s i so fh y p e r i c i ns t a r t i n gf r o me m o d i nh a db e e ns t u d i e d t h em a i nr e s e a r c hi sa sf o l l o w s ( 1 ) t h eo p t i m u mp u r i f i c a t i o nc o n d i t i o nw a sc o n f i r m e d t h eo p t i m u mp u r i f i c a t i o np r o c e s s w a ss t u d i e db yu s i n gt h eo r t h o g o n a ld e s i g na n dt h eu n i f o r md e s i g no ff o u rf a c t o r s ，r e s p e c t i v e l y t h e o p t i m u mp u r i f i c a t i o nc o n d i t i o n so b t a i n e df r o m t h eo r t h o g o n a ld e s i g nw e r ea d d i n g12t i m e s a m o u n to fa c e t o n e ，r e f l u x i n ga n de x t r a c t i n gf o rt h r e et i m e s ，a n d6 0m i n u t e sp e rt i m eu n d e r 6 0 c t h ec o n t e n to fe m o d i ni nt h ep r o d u c tw a s6 2 18 a n dt h ee x t r a c t i o nr a t i ow a s4 7 6 2 t h eo p t i m u me x t r a c t i n gc o n d i t i o n so b t a i n e df r o mt h eu n i f o r md e s i g nw e r ea d d i n g14t i m e s a m o u n to fa c e t o n e ，r e f l u x i n ga n de x t r a c t i n gf o rt h r e et i m e sa n d6 0m i n u t e sp e rt i m eu n d e r5 5 c t h ec o n t e n to fe m o d i ni nt h ep r o d u c tw a s6 5 0 4 ，a n dt h ee x t r a c t i o nr a t i ow a s5 0 5 2 ( 2 ) t h ee x i s t e n c eo fa n t h r a q u i n o n ec o m p o u n d st h a ta r es t r u c t u r a l l ys i m i l a rt oe m o d i ni n r a wp r o d u c tl i m i t st h eu s eo fe m o d i n t h el o wc o n t e n te m o d i nc o u l dn o tm e e tt h en e e d so ft h e m a r k e t t h e r e f o r e ，t h ep a p e rc o n d u c t e dt h er e s e a r c ht og e th i g h p u r i t ye m o d i n t h r e em e t h o d s ： e x t r a c t i o nw i t he t h a n o l ，r e c r y s t a l i z a t i o n ，a n de x t r a c t i o nw i t h5 n a 2 c 0 3w e r e u s e df o r p u r i f y i n ge m o d i n ，r e s p e c t i v e l y t h em e t h o do fe x t r a c t i n g 谢t l le t h a n o la n dr e c r y s t a l i z a t i o n i i a b s 仃a c t r e q u i r e dt h a tt h ec o n t e n to fe m o d i nm u s tr e a c h5 0 t h em e t h o do fe x t r a c t i o nw i t h5 n a 2 c 0 3 w a sf i r s t l yp u tf o r w a r di nt h i sp a p e r t h ec o n t e n to fe m o d i na f t e re x t r a c t i o nw a s8 5 6 5 ，a n d t h ee x t r a c t i o nr a t i ow a s6 2 13 a f t e rt h er e c r y s t a l i z a t i o n ，t h ec o n t e n to fe m o d i ni nt h ep r o d u c t r e a c h e d9 2 2 8 t h es i m p l e ，f a s t ，e f f i c i e n tp u r i f i c a t i o na n de x t r a c t i o no fe m o d i nw a s c o n s t r u c t e d ( 3 ) t w om e t h o d so fs y n t h e s i sh y p e r i c i nw i t he m o d i nw a ss t u d i e di nt h i sp a p e r ( ! ) e m o d i n w a sh e a t e da n dc a t a l y s t sw e r eh y d r o q u i n o n ea n dp o t a s s i u mh y d r o x i d ew i mi l l u m i n a t i o n , t h e u l t i m a t ep r o d u c tw a sh y p e r i c i n t h ey i e l do fh y p e r i c i nw a s51 3 6 a n dt h ec o n t e n to fh y p e r i c i n a f t e rp u r i f i c a t i o nw a s7 0 16 ( d t h ee m o d mw a sd e o x i d i z e dt oa n t h r o n e t h e nt h el a t t e rw a s u s e dt os y n t h e s i sh y p e r i c i nd i r e c t l y , w h e r et h ec a t a l y s t sw e r ep y r i d i n ea n df e s 0 4 ，n l ey i e l do f h y p e r i c i nw a s2 6 51 a n dt h ec o n t e n t o fh y p e r i c i na f t e rp u r i f i c a t i o nw a s3 4 16 t h e c o n f i g u r a t i o na n dc o n t e n to fp r o d u c tw e r ec o n f m n e da n dd e t e c t e db yi n f r a r e ds p e c t r u ma n d s p e c t r o p h o t o m e t r y r e s u l ts h o w e dt h a tt h ef as tp r o c e s si sb e t t e rt h a nt h es e c o n dm e t h o d i tw a s c o n c l u d e dt h a tt h es c h e m eo fs y n t h e s i sh y p e r i c i nw i t he m o d i nc a no f f e rg u i d a n c ef o r c h e m o s y n t h e s i so fh y p e r i c i n k 盯w o r d s ：e m o d i n , p u r i f i c a t i o n ，h y p e r i c i n , s y n t h e s i s i i i 独创性声明 秉承祖国优良道德传统和学校的严谨学风郑重申明：本人所呈交的学位论文是我个 人在导师指导下进行的研究工作及取得的成果。尽我所知，除特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人的研究成果。与我一同工作的同志对本文所论述的工作和成 果的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并已致谢。 本论文及其相关资料若有不实之处，由本人承担一切相关责任 论文作者签名：聋亟盟忡弓月1 日论文作者签名：煎望鱼盟忡弓月印日 学位论文使用授权声明 本人鹭亘盘致在导师的指导下创作完成毕业论文。本人已通过论文的答辩，并 已经在西安理工大学申请博士硕士学位。本人作为学位论文著作权拥有者，同意授权 西安理工大学拥有学位论文的部分使用权，即：1 ) 已获学位的研究生按学校规定提交 印刷版和电子版学位论文，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生上交的 学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编人有关数据库进行检索；2 ) 为教学和 科研目的，学校可以将公开的学位论文或解密后的学位论文作为资料在图书馆、资料室 等场所或在校园网上供校内师生阅读、浏览。 本人学位论文全部或部分内容的公布( 包括刊登) 授权西安理工大学研究生部办 理。 ( 保密的学位论文在解密后，适用本授权说明) 论文作者签名：砗堕牡一导师签名：巡扣。 年；月1 日 1 绪论 1 绪论 1 1 本课题研究的背景 天然产物化学以天然有机化合物的提取、分离、结构分析、生物活性、化学合成及应 用为主要研究内容，是一门涉及化学、物理学、生物学、药学等领域的交叉学科。随着现 代物理分析手段的引入和发展，科学家现在己经能对自然界中出现的几乎所有复杂有机物 的结构做出合理解释。 大黄属寥科掌叶组植物的干燥根与茎的结合体，是常用中药之一，我国最早记载于神 农本草经，东汉著名医家张仲景所著的伤寒论，金匮要略两书也多次应用了大黄， 占全书方剂用药的1 4 左右，具有泻热通肠、凉血解毒、逐淤通经等功效。现代药理研究 发现，大黄中的葱醌类衍生物，如大黄素、大黄酸等具有多方面的生物活性，如抗炎、抑 菌、抗氧化、清除自由基、抑制血小板聚集、改善微循环等，对内分泌系统，心血管系统 及核酸代谢的作用尤为显著【l 】。其应用已成为国际医药界研究的热点之一，目前大黄正成 为我国重要的出口药材之一。 贯叶连翘是藤黄科金丝桃属多年生草本植物，又称贯叶金丝桃、千层塔、小过路黄、 小对月草等。原产于欧亚大陆，药用历史已有千余年。贯叶连翘味苦、辛，性平，全草入 药，它具有清热解毒，收敛止血，利湿等功效。现代药理学研究证实其具有收缩血管、升 高血压、利胆、抗菌等作用，常用于抗菌消炎，治疗黄疽、尿路感染等，贯叶连翘是美国 草药药典中已收入的有限几种草药之一，它作为食品添加剂己被广泛的使用，其提取物在 美国市场份额的排名由1 9 9 6 年的2 0 位之外到1 9 9 7 年的第5 、1 9 9 8 年的第2 ；德国用它作抗抑 郁症药已有1 0 0 多年的历史，其浸膏制剂己占领德国抗抑郁症药物市场的将近5 0 。 金丝桃素( h y p e d e i n ) 是贯叶连翘中最具有生物活性的物质，研究表明，其具有抗抑 郁、抗菌消炎、抗肿瘤、抗病毒等药理活性。此外金丝桃素还是一种有效的光敏剂，在光 动力学治疗中表现出强的诱导肿瘤细胞凋亡的活性。在德国，金丝桃素己与蛋白结合，用 于治疗艾滋病及甲乙型肝炎【2 】。由于金丝桃素具有的多种药理作用，使其成为当前国际研 究开发继人参、银杏叶、红豆杉之后的热点之一，具有重大的新药开发价值。 国内有关金丝桃素的提取工艺研究进行的较晚，直到上世纪年代末才有报道【3 】。目前， 现行的生产工艺还不完善，而且存在产品易吸湿、发粘、含量较低等缺点。我国虽盛产贯 叶连翘，但资料显示金丝桃素在贯叶连翘全草中的含量仅有万分之几，因此希望通过化学 方法对其进行合成和精制，从而达到国际市场对金丝桃素含量须不小于0 3 t 4 1 的要求。 1 1 1 大黄素简介 全世界大黄属植物约6 0 种，我国大黄属( r h e u ml ) 植物就有近4 0 种。中国药典收载 正品大黄有三种：掌叶大黄( r h e u mp a l m a t u m l ) 、唐古特大黄( r h e u mt a n g u t i e u m m a x i me x b a l l ) 和药用大黄( r h e u mo f f i e i n a l eb r a i l l ) p 】。我国开发利用大黄的历史悠久，但从目前利 用情况来看，大黄的应用比较单一，因此，需要进一步开发大黄的新用途，提高大黄原料 西安理工大学硕士学位论文 的利用率，同时加强资源保护工作，以充分利用我国丰富的大黄资源。近年来，随着对大 黄药理作用的深入研究，表明大黄中的大黄素等化合物具有抗炎、抑茵、抗肿瘤等多种药 理作用，是一类非常有效的活性成分，己成为目前中药大黄研究的热点。大黄素是中药大 黄的主要有效成分，其药理作用与大黄有许多相似之处。随着对其药理作用的深入研究， 大黄素良好的临床应用前景将逐渐显露。因此，不断优化大黄素的提取及纯化工艺，提高 大黄素的生产收率，对于节约原材料、降低生产成本和提高产能具有积极的作用。 1 。1 2 大黄素的理化性质 大黄素是从天然药物中用物理方法提取的一种中药原料，化学结构式名称为1 ，3 ，8 三羟基一6 甲基蒽醌。分子式为c 1 5 h l 0 0 5 ，熔点2 5 6 - - 2 5 7 ，里橙色针状晶体，几乎不 溶于水，能溶于乙醇，稍溶于乙醚、氯仿、苯，溶于苛性碱水溶液、碳酸钠溶液或氨溶液 中并显樱红色【_ 刀。大黄素是由八个醋酸单位生物合成而来的，其结构式如图1 1 。 h 一心 。 图1 - 1 大黄素的结构式 f i g1 - 1m o l e c u l a rs t r u c t u r eo f e m o d i n 1 1 3 大黄素的药理作用与应用 a 抑制细胞增殖的作用 大黄素具有广谱抗肿瘤细胞增殖的作用，而不同肿瘤细胞对大黄素的敏感性不同。大 黄素对小鼠黑色素瘤细胞、艾氏腹水癌细胞、淋巴细胞白血病细胞和肺癌细胞等有一定抑 制作用。此外，大黄素还抑制角质形成细胞c o l 0 1 6 、平滑肌细胞、角朊细胞、v = r a s 转化的 人支气管上皮细胞、肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞的增殖1 8 - 1 0 】。 b 抗炎作用 在炎症反应中，巨噬细胞分泌的细胞因子以网络化作用方式发挥着整体效应。当机体 受到感染时，腹腔巨噬细胞受到大量脂多糖( l p s ) 刺激，产生大量肿瘤坏死因子a ( t n f - a ) 、 i l 1 、i l 6 等炎症因子，它们相互诱生，相互协同。这些细胞因子的过量存在进一步激活 多形核白细胞( p m n ) 和内皮细胞等效应细胞，并释放自由基、蛋白酶等，加速花生四烯酸 代谢，释放血栓素、前列腺素、白三烯和一氧化氮( n o ) 等炎症介质，形成瀑布效应，导 致过度炎症反应。王文俊等【l l 】观察了大黄素对单核巨噬细胞产牛t n f - - ( x 、i l 1 、i l 6 、i l 8 的调节作用，结果发现，大黄素能激活单核巨噬细胞分泌上述4 种炎症细胞因子，同时还 能抑制由内毒素诱导的上述炎症因子的分泌，而激活单核巨噬细胞所分泌细胞因子的量均 显著低于由内毒素诱导所产生的量。焦建杰等【1 2 】的研究表明，大黄素在5 x 1 0 。- - 一5 x 1 0 石 m o l l 浓度范围内可抑制大鼠腹腔巨噬细胞中自三烯b 4 的生物合成。另外，大黄素还能抑 制炎症反应中n o 的大量合成与释放【1 3 】。 2 1 绪论 c 抗纤维化作用 大黄素可抑制血管紧张素i i ( a n gi i ) 诱导的肾成纤维细胞分泌纤维连接蛋白( f n ) 和纤 溶酶原激活物抑制剂活性增高，增加f n 降解，从而阻止肾间质纤维化。展玉涛等【1 4 j 采用 四氯化碳对大鼠进行皮下注射建立肝纤维化模型，发现大黄素能使肝纤维化大鼠血清中透 明质酸及层粘连蛋白含量降低，减少肝组织中羟脯氨酸含量。 d 调节平滑肌收缩的作用 吕金胜等的研究结果显示1 1 5 1 ，大黄素对大鼠和家兔离体回肠的收缩具双向调节作用， 当其浓度低于2 9 6 1 x m o l l 时，可使收缩幅度随剂量增加而增大，而高于2 9 6r m a o l l 时，则 可使收缩幅度逐渐减小直至收缩停止；但大黄素对家兔离体回肠的收缩频率无明显影响。 另外，大黄素对0 c l 受体激动剂苯肾上腺素及h 受体激动剂组胺诱导的家兔主动脉血管收缩 反应也有双向调节作用，即低浓度促进，高浓度抑制。 e 改善循环系统的作用 大黄素对血管有舒张的作用，能抑n 5 羟色胺对血管的收缩作用，协同乙酰胆碱的舒 张作用，其舒张作用与自由基或氢过氧化及c g m p 增加有关。大黄素还可抑制血小板聚集， 改善微循环，降低血液粘度【1 6 1 。例如：大黄素可改善重症胰腺炎模型大鼠初期的胰腺缺 血，其机制可能是抑制重症胰腺炎时二十碳烯酸类异常代谢、改善胰腺微循环所致【1 7 】。 大黄素尚有抗氧化及清除氧自由基、肝保护、肾保护、对胰腺炎的治疗等作用【1 8 - 2 a 。 f 大黄素的应用 口服大黄素在肠内易于吸收，2 3 小时后血中即达到最高浓度，以后慢慢下降，尿及 胆汁在服药后4 8 小时即达到高峰，由尿排出可持续2 天，在体内的分布以肝肾为最多。 也有人把它制成过注射剂，用于肌肉和静脉注射 2 3 1 。 大黄素被吸收后，由肾排出大黄酚，它能使酸性尿变成棕黄色，使碱性尿变成紫红色。 在临床上，用大黄素纯品治疗过白血病、胃癌等，而最常用的则用于抑菌。它对很多细菌 如各种葡萄球菌、溶血性链球菌、白喉杆菌、霍乱杆菌、大肠杆菌、绿浓杆菌、皮肤真菌、 枯草杆菌、草分枝杆菌、淋球菌、炭疽杆菌等均有抑制作用。其中对葡萄球菌、淋球菌、 链球菌更为有效。同时，还具有利尿、利胆、解痉、降低血压抑制免疫功能等作用 2 4 - 2 7 1 。 大黄素的生理活性决定它不仅可用于医疗，也可用于保健和日用化工品中，已有人把 它用于护发和护肤品中，也有人把它编入天然色素中去1 2 列。 1 1 4 大黄素的提取与纯化工艺的进展 a 有机溶剂提取法 可采用氯仿、苯等有机溶剂直接进行提取，提取液在浓缩过程中有时会有结晶析出。 也可用甲醇或者乙醇进行抽提，提取液浓缩后再用不同的溶剂进行分配或用不同p h 的水 溶液进行萃取而达到初步分离的目的。此法依据大黄中各组分在溶剂中溶解度的不同，从 而选用适当的溶剂把各组分分别提取出来。所用溶剂多以乙醇为主，提取方法分为冷浸法 和热提法。胡军等【2 9 】用乙醇从秦岭大黄中提取出1 0 个化合物，应用显微熔点测定仪、紫 3 西安理工大学硕士学位论文 外光谱、红外光谱、核磁等技术鉴定出其中6 个化合物；利用g c m s d s 对其挥发性成分 进行了分析，鉴定出2 7 个化合物。何丽一等1 3 0 】改进了提取方式，比较了用甲醇以索氏提 取器热提取和以甲醇冷浸提取大黄样品，证明两法结果一致，故可用冷浸法代替热提法； 并且用乙醚一次提取代替了以有机溶剂多次提取至无色的操作。 b 碱提酸沉法 由于葸醌衍生物大多数含有酚羟基或羧基，在植物体内与钠、钾、钙、镁等金属离子 结合，以盐的形式存在，所以在提取时可用酸使之完全游离出来，然后再用碱使之沉淀， 进行提取。陈琼华等1 3 1 综合研究中药大黄、大黄葸醌衍生物的系统分离改进方法。可分 离得到大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚混合物的黄色沉淀物，再经过 结晶即得较纯的产品。结果表明：此方法步骤简单，可以达到系统分离的目的，可以应用 于实际的生产中。 c 超声提取法 超声萃取作用机理主要是超声力学产生的空化效应。空化效应存在于萃取液中的微气 泡。微气泡在声场作用下振动，声压达到一定值时，气泡迅速增长，然后突然闭合。在气 泡闭合时产生激波，造成很大压力，将植物组织中细胞破裂，以利于溶剂浸透到植物细胞 内部，使细胞中的有效成分溶于溶剂中。超声提取法所用时间短，对蒽醌类成分没有破坏 作用。郭孝武【3 2 】研究了超声频率和超声提取时间对大黄葸醌提取率的影响，并比较了超 声与常规方法对葸醌类提出率的大小。他指出在频率为2 0 k h z 的超声提取的提出率最高， 且同一频率的超声，随着时间的增加提出率有一最高值。 d 超临界萃取法 超临界流体萃取是近代分离领域出现的新技术，具有萃取效率和选择性高、省时、萃 取溶剂便于挥发、提取物较为“干净 、环境污染小、操作条件易于改变等特点。其是借 助于处于超临界条件下的流体所具有的高溶解性，使天然植物中的许多成分溶解在超临界 流体中，操作过程中采用降压的方法，将溶解到超临界流体中的溶质“脱溶”，从而达到分 离的目的。苟奎斌等【3 3 】把超临界萃取法用于首乌喘息灵胶囊中大黄素的定量测定中，用 正交实验法优选超临界萃取工艺，并用反相高效液相色谱法进行了测定，结果快速、准确、 效率较高。 e 高速逆流色谱提取法 袁黎明等【3 4 】利用高速逆流色谱对传统中药大黄中的葸醌类活性成分进行制备性分离 研究，两相溶剂分离系统采用氯仿：甲醇：水= 4 ：3 。8 ：2 ，并对制备物进行薄层色谱分析， 检验其中的大黄素，证实了其中的葸醌类成分，充分说明了该方法的有效性和实用性。 在色谱系统中固定相和移动相要同时选择。氯仿甲醇水具有上下两相大约相等且 平衡时间短的优点，是目前应用较多的溶剂分离系统之一。此溶剂体系中，氯仿和水分别 成为两相。甲醇在两者中皆有分布。当甲醇增加时，一方面减少水相的极性，同时也增加 了氯仿的极性，达到同时改变待分离成分在两相中分配的目的。结果表明：该方法能在短 4 1 绪论 时间( 3 h ) 里，1 次制备性地分离复杂的样品还是鲜见的。同时也将高速逆流色谱推广应用 到植物化学领域，为植物中活性成分的提取和开发奠定了基础。 f 微波提取法 微波提取法是g a n z l e r 等于1 9 8 6 年首先提出的l 3 5 l ，由于其特殊的加热机制可以在很 大程度上缩短提取时间，同时还可以减少溶剂的消耗，与传统热萃取相比，微波萃取具有 质量稳定，速度快，萃取效率高等特点，在植物中药提取领域表现出良好的应用前景【3 们， 虽然一般的提取方法也可以完成大黄素的提取，但耗时较长，且需消耗大量的有机溶剂， 作者采用正交试验法对虎杖进行微波辅助有机溶剂提取，考察了微波辅助提取的条件，优 选出了大黄素的最佳浸出方案。 除上述六种主要方法外，还有水煎煮提取法、树脂吸附脱附法 3 7 1 提取分离大黄素的 报道。对于大黄素这种用途广泛的天然有效成分，其开发具有广阔的实际应用发展前景； 这些方法也必将促进植物活性成分的开发和传统中草药的现代化研究。 g 大黄素的分析方法研究进展 大黄素的分析方法主要采用分光光度法、薄层层析( t l c ) 和高效液相层析( h p l c ) 。 t w e e n 8 0 ( n i - 1 4 ) 2 s 0 4 液固萃取体系是近1 0 年开发的新型萃取体系【3 8 。3 9 1 ，它的形成是 成相聚合物的水溶液，与无机盐水溶液混至一定浓度，由于盐析作用，成相聚合物聚集成 松散的固态，浮出盐水溶液，形成液固两相。该体系成相容易、分相迅速、操作简便、盐 用量低、无毒性，可应用于生物物质和中草药的提取纯化，具有实际应用前景。 t l c 法测定大黄素的固定相一般为硅胶 4 0 1 ，展开剂可以是石油醚一二异丙基醚 ( 9 ：1 w v ) ) ，苯环己胺( 1 ：l 厂v ) ) ，或者石油醚一二乙基醚( 8 5 ：1 5 ( v m ) ) 。 h p l c 也是一种常用的检测大黄素的方法【4 i - 4 3 1 。文献用h p l c 测定虎杖中的大黄素用 c 1 8 柱，也有用c 8 柱，实验证明c 8 柱比c 1 8 柱的分离效果更好，而且保留时间相对较 短。 1 1 5 金丝桃素概述 贯叶连翘( h y p e r i c u mp e r f o r a t u ml ) 是藤黄科( g a r c i n i a ) 金丝桃属( h y p e r i c a c e a e ) 的代表 植物，广泛分布于南部非洲、欧洲、亚洲和我国山东、河北、陕西、江苏、四川、贵州等 省。1 8 9 1 年d i e t r i c h 分离到金丝桃素，1 9 1 1 年s c z e m y 命名为“h y p e r i c i n ，1 9 5 1 年确 定其化学式为4 , 4 ，5 ，5 ，7 ，7 l 六羟基2 2 l 一二甲基一中位_ 萘骈二蒽酮。以后b r o c k m a n 等 有发现并分离到一种新的红色素假金丝桃素，1 9 7 5 年确定其化学式。金丝桃素衍生物 包括假金丝桃素和一些前提物质。 金丝桃素是贯叶连翘中最具有生物活性的物质，具有抗病毒、抗抑郁、抗菌消炎、创 伤收敛等多种药理作用，能抑制d n a ，r n a 病毒，对肿瘤细胞也有一定的抑制作用。而 且还是一种有效的光敏剂，在光动力学治疗中表现出强的诱导肿瘤细胞凋亡的活性嗍。 目前，它己作为原料制成药品在临床上广泛使用，用于治疗抑郁症，艾滋病及甲乙型肝炎 等疾病。鉴于金丝桃素类的重要药用价值和广阔的市场前景，加速了人们对其野生资源的 5 西安理工大学硕士学位论文 过度采集。凭借单一的提取、分离工艺远远不能满足市场需求，达到实现金丝桃素中试及 产业化的目标有一定的困难，因此在不提高生产成本的前提下，我们考虑从化学合成的角 度，对实现金丝桃素中试及产业化的目标有一定的现实意义。 1 1 6 金丝桃素的理化性质 金丝桃素是一种蓝黑色针状结晶体，分子式是：c 3 0 h 1 6 0 8 。熔点为3 2 0 ，具有亲脂 性。金丝桃素为萘骈二蒽酮类化合物，即4 ，4 ，5 ，5 ，7 ，7 _ - 六羟基2 ，2 一二甲基一中位一萘骈 二葸酮。分子上下对称，一侧有疏水性甲基，而另3 侧都连接有亲水性的取代基。其结构 式如图1 2 所示： o h o o h 图1 2 金丝桃素的结构式 f i g1 - 1m o l e c u l a rs t r u c t u r eo f h y p e r i c i n 金丝桃素易溶于吡啶、甲醇、乙醇等有机溶剂和碱水，呈橙红色，并带红色荧光，加 热易分解，对光敏感，需避光保存。p h 大于1 1 5 时，溶液呈绿色并带有红色荧光，p h 小于1 1 5 时溶液呈红色。溶于碱性水溶液中与铅、镁、锇等重金属形成螯合物并沉淀， 不溶于常见的有机溶剂。该性质是鉴定金丝桃素的重要依据。 1 1 7 金丝桃素的药理作用及应用 a 抗抑郁 贯叶连翘提取物在欧洲尤其在德国长期被用作抗抑郁药物，一般认为其中的主要有效 成分是金丝桃素。2 0 0 0 年，美国研究者b r e n n e r 等人用金丝桃素浸膏制剂与斯托宁作对照 试验，以两种药物治疗3 0 位轻、中度抑郁症患者，进行双盲、随机研究嗣。临床用药一 周后，所用制剂中金丝桃素日剂量为2 7 m g ，结果表明金丝桃制剂疗效与斯托宁相当，甚 至优于斯托宁。目前关于其机制及有效成分的研究仍在探索中【4 刀。 b 抗病毒 金丝桃素抗病毒的机制与其光敏活性有关，作用方式可能通过：直接攻击病毒粒子， 可能是直接攻击有脂质被膜的病毒的膜成分；作用于病毒感染的细胞。这2 种方式均可因 光照加强其作用效果。近年发现金丝桃素对多种逆转录病毒包括艾滋病病毒( h i v ) t 4 射、疱 疹病毒【4 9 】、口炎病毒、副流感病毒、牛痘病毒【5 0 1 、肝炎病毒【5 1 1 等都有抗病毒作用。 最近研究表明，金丝桃素对高致病性禽流感病毒( a i v ) 具有良好的杀灭效果，最后杀 灭率可达1 0 0 。将专家研制的金丝桃素制剂在体外与禽流感h 5 n l 和h g n 2 亚型病毒直接 6 1 绪论 接触，金丝桃素在3 7 2m g m l 生药的质量浓度时，3 0 m i n 对病毒的杀灭率可达到l o o ：在 0 7 4 4m g m l 生药作用10 m i n ，病毒杀灭率可达9 9 9 9 以上p 引。 王曙阳报道1 5 3 】，将体外培养的b h k 2 1 细胞感染口蹄疫病毒( f m d a ) 后加入金丝桃素， 日光灯下光活化1 h ，观察细胞病变，发现金丝桃素有明显的抑制f m d a 致b h k 2 1 细胞病 变效应，能抑制f m d a 的增殖，抑制率可达6 1 8 2 。证实金丝桃素在体外有明显的抑制 f m d a 增殖的作用。 c 抗癌抗肿瘤 金丝桃素可引起肿瘤细胞的程序性死亡，是贯叶连翘中抗肿瘤的主要活性成分。a n k e r 等研究了从贯叶金丝桃浸膏精制的金丝桃素对慢性人神经胶质瘤细胞系和原发性人神经 胶质细胞系的作用【5 4 1 。当金丝桃素的浓度为5 o , g m l 时，能明显抑制培养基中瘤细胞生 长。通过测试金丝桃素对c 6 细胞的细胞毒作用及诱导细胞凋亡作用，表明金丝桃素在光 诱导下具有抗胶质瘤作用，其机制与诱导细胞凋亡有关。金丝桃素可能是蛋白激酶c ( p k c ) 的抑制剂，它可对多种肿瘤细胞产生细胞毒作用【5 5 1 。研究发现光活化的金丝桃素可使肿 瘤细胞d n a 合成障碍，能够明显抑, i j c 6 胶质瘤细胞的增殖，并出现剂量依赖性抑制，最 终触发凋亡机制，诱导细胞凋亡垆6 1 。 金丝桃素还具有消炎止痛，光敏活性，抑制h i v 及其它一些反转录病毒等作用。 1 1 8 金丝桃素的合成研究进展 金丝桃素的制备有植物提取法、生物合成法和化学合成法。金丝桃素在贯叶连翘全草 中的含量仅有万分之四左右，目前，国威j j b 从贯叶连翘中提取的金丝桃素在其提取物中的 含量也不超过1 ，即便是改善提取工艺，提取、分离出来的金丝桃素的含量也不是很高， 而且还会破坏大量的天然植被或占用大量耕地。生物合成方法能够促进植物贯叶连翘中金 丝桃素的合成，进而实现植物体外金丝桃素的生物合成，但该方法存在实验技术要求高， 难度大等特点。所以通过化学合成法制备金丝桃素成为更好的选择。因此，探索出更为简 便、经济的化学合成方法具有十分重要的意义。 a 生物合成方法 近期，王力等人利用酶基因法合成了金丝桃素【5 9 1 ，即以贯叶连翘愈伤组织总r n a e d n a 为模板，经r t - p c r 扩增得到了编码金丝桃素合成酶的全长c d n a ，即h y p 基因。 将该基因克隆到原核表达载体p e t 3 0 a 中，成功构建金丝桃素合成酶表达载p e t 3 0 a r h y p ， 并转化到大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 中。该方法使h y p 基因得到高效表达，能够促进植物贯 叶连翘中金丝桃素的合成，进而实现植物体外金丝桃素的生物合成，但该方法存在实验技 术要求高，难度大等特点。 b 以大黄素为起始原料的合成方法 近年来的关于金丝桃素的半合成方法多以大黄素为起始原料。大黄素的价格低廉，易 得，合成路径上更易实现。故比较不同的以大黄素为起始原料合成金丝桃素的方法，讨论 各方法的优劣。 7 西安理工大学硕士学位论文 ( 1 ) 氢醌缩合法 早在19 9 2 年h e i n zf a l k 矛l l g e r h a r ds c h o p p e l 等人就使用大黄素在氮气流的氢醌碱液中缩 合的方法【鲫，合成了金丝桃素，反应步骤如下方程式所示。 o hn 。 - - - - - - j - - h 氢醌 ( 2 ) 大黄素二葸酮氧化法 1 9 9 7 年，s t e g l i e h 和r o d e w a l d 介绍了1 0 0o c 下在稀释的大黄素水溶液中合成金丝桃素 【6 2 】，历时1 0 天，产率仅为1 。可见其生产周期过长，且产率很低，不宜推广。 2 0 0 5 年，b a n k s ，c a m e r o n 和r a v e r t y 报道了一种以大黄素为起始原料合成金丝桃素的方 法【6 1 1 。该方法的合成步骤包括大黄素葸醌到蒽酮的转化，在f e c l 3 存在下两个大黄素葸酮 互相缩合形成二葸酮，最后二葸酮在通氧气的氨水中氧化生成金丝桃素，反应步骤如下方 程式所示。 h h ( 3 ) 大黄素葸酮缩合法 1 9 9 9 年f a l k h 报道了一种简单直接的方法。即先将大黄素用二氯化锡还原为大黄素 葸酮，再将其在吡啶及硫酸亚铁的溶液中直接缩合【6 3 1 ，反应步骤如下方程式所示。 o ( 4 ) 另一种大黄素葸酮缩合法 8 金丝桃素 1 绪论 1 9 9 1 年，m a z u ry 等人的专利中介绍了另一种大黄素到金丝桃素的合成方法【删。合 成步骤如图所示，较前几种方法而言，该方法有所改进，尤其是收率很高，达到了6 3 。 但反应步骤较繁琐。具体步骤如下方程式所示： ( 1 ) 将l ，3 ，8 三羟基6 甲基葸醌( 大黄素) 溶解于分析纯冰乙酸中，然后加入含有 s r i c l 2 2 2 0 的3 6 - 4 0 浓盐酸，在不高于1 2 5 下反应1 4 小时，冷却，得到l ，3 ，8 三羟 基6 甲基蒽酮；1 , 3 ，8 三羟基乒甲基- 葸醌和s n c l 2 2 h 2 0 的摩尔比为1 ：4 6 ；乙酸与盐酸 的体积比为1 5 3 ：1 ： ( 2 ) 将1 ，3 ，8 三羟基6 甲基葸酮与吡啶哌啶，氮氧吡啶和f e s 0 4 - 7 h 2 0 在1 0 0 1 3 0 下避光反应0 5 3 小时，再将反应产物溶解于丙酮，用卤素灯照射1 2 2 4 小时，浓缩，用 正己烷溶解，过滤沉淀，得到金丝桃素；1 , 3 ，8 三羟基6 甲基葸酮