（应用化学专业论文）质粒DNA制备方法的研究.pdf

鞍山科技大学硕士学位论又摘要摘要 本文研究的核心内容是围绕大规模制备药用质粒d n a这一主题展开的。它主要是以 含 有p c d n a 3 的e c o l i d h 5 a 菌株为 对象， 系统的 对发 酵， 常规的 细胞裂 解方法以 及大规模制备质粒d n a的非色谱纯化的方法一 一- c t a b法进行研究。 从摇瓶小试到i o l发酵罐中试， 研究了搅拌转速、 接种量、 培养时间等发酵参数及葡萄糖、 抗生素、 无机盐等成分对菌体浓度和质粒产量的影响， 优选出 最佳的培养基和培养条件。结果表明:最优基础培养基为2 x y t培养基;最优发酵条件为2 0 0 r / m i n , 5 % 接种量、 最佳培养时间为对数生长后期， 约8 h ; 培养基中k h 2 p o 4的 初始含量为4 m g / m l ; 氨节青 霉素的 加入量为5 0 m g / l 。 优化的 葡萄糖浓度在对数生长期、 稳定 期和衰亡期 分别为2 m g / m l 和l m g / m l . 其次， 针对含有p c d n a 3 的e c o l i d h 5 a 菌 株 研究常 规质粒d n a粗提方 法，确定碱裂解方法为最适宜的方法。在大量制备质粒 d n a ( 5 0 0 m l )的过程中，质粒产量为2 . 1 8 m g ， 收率为7 5 .6 5 % , 稳定 性与重 复 性均 较好。 最后研究了基因治疗用载体质粒 d n a 的一种非色谱的大规模纯化方法.一一 c t a b沉淀法， 并对这种方法进行了工艺优化。 首先采用高纯过滤介质c e i p u r e去除大量杂质， 并利用c t a b浓度梯度溶液对不同 形式d n a沉淀能力的 差异， 确定c t a b完全沉淀超螺旋质粒d n a的 浓度为0 .2 % w / v ,溶解沉淀的最优盐浓度为0 .7 5 m o l / l ， 从而达到 选择性的 从蛋白 质、 r n a及其它形式d n a中提取超螺旋质粒d n a的目 的。此方法所得到的超螺旋质粒d n a的收率在7 8 .9 %以上，纯度为9 9 %以上。关键词: 质 粒d n a ， 发 酵， 比 生 长 速 率， 大 规 模 纯 化， 澳 化 十 六 烷 三甲 基 按( c t a b )鞍山科技大学硕士论文ab s t r a c tabs tract b y u s i n g t h e p l as m i d p c d n a 3 c o n t a i n i n g s t r a i n e c o l i d h 5 a as a m a t e r i a l , t h i s t h e s i s s t u d ie s t h e p r o c e s s e s o f f e r m e n t a t i o n , c e l l l y s i s a n d a n e w n o n c h r o m a t o g r a p h i c p u r i fi c a t io n m e t h o d f o r t h e l a r g e - s c a le o f p h a r m a c e t ic a l- g r a d e p las m i d . f i r s t , t h e e ff e c t o f c h o s e n f e r m e n t a t i o n f a c t o r s i s i n v e s t i g a t e d , a n d t h e r e s u l t i s a s f o l l o w s : in o c u lu m 5 % , r o t a t o - s p e e d 2 0 0 r / m i n , f e r m e n t a t i o n t i m e 8 h . b as e d o n t h e r e s u lt s , t h e s e l e c t i o n o f i n o r g a n i c s a lt , s o u r c e o f c a r b o n , a n t i b i o t i c , c u l t u re m e d i u m e t a l . a re i n v e s t i g a t e d . t h e o p t i m u m m e d i u m is i n o r g a n i c s a l t 4 m g / m l , a n t i b i o t i c 5 0 m g / l , g l u c o s e 2 m g / m l ( l o g p h a s e ) a n d 1 m g 4 n l ( s t a t io n a r y a n d d e a t h p h a s e ) . s e c o n d , a l k a l i l y s a t e i s b e s t m e t h o d t o e c o l i d h 5 a . b y a lk a l i ly s a t e m e t h o d( 5 0 0 m l ) , 2 . 1 8 m g p l as m i d p r o d u c t io n a n d 7 5 .6 5 % p u r i fi c a t i o n y i e l d a r e o b t a i n e d ,d u p l i c a t i o n a n d s ta b i li t y a r e b e s t . a n e w n o n c h r o m a t o g r a p h i c p u r i f i c a t i o n m e t h o d f o r t h e l a r g e - s c a l e o fp h a r m a c e t i c a l - g r a d e p l as m i d b y c t a b h a s b e e n d e v e lo p e d . me a n w h i l e t h ep u r if i c a t i o n p r o c e s s i s o p t i m iz e d . f i r s t l y , l a r g e a m o u n t o f im p u r i t i e s i n t h e c ru d ep l a s m i d m ix t u r e c a n b e r e d u c e d d r a m a t i c a l l y b y a h ig h p u r i t y f il t e r a i d - c e l p u r ed i a t o m it e . g r a d i e n t c o n c e n t r a t i o n s o f c t a b p r o d u c e d p r e c i p i t a t i o n o f p l a s m i dv a r ia n t s . t h e s e l e c t i v i t y m e c h a n i s m i s m o s t l i k e l y b a s e d u p o n c o n f o r m a t i o n a ld i ff e r e n c e s a m o n g t h e s e v e r a l f o r m s o f d n a . t h e o p t i m a l c o n c e n t r a t i o n o f c t a b t op r e c i p i t a t e p l as m i d d n a i s 0 .2 % w / v c t a b a n d t h e o p t i m a l s a l t c o n c e n t r a t i o n f o rp r e c i p i t a t e d i s s o l u t i o n i s 0 .7 5 m o u l . c t a b i s e ff e c t iv e f o r s e le c t i v e p r e c ip i t a t i o n o fp l as m i d d n a f r o m p r o t e i n s , r n a a n d t h e o t h e r r e l a x e d a n d d e n a t u r e d f o r m s o fp l as m i d d n a . t h e f i n a l y i e l d o f s u p e r c o i l e d p l as m i d d n a i s 7 8 .9 % , p u ri t y o f t h e f i n a lc o n c e n t r a t e d s o l u t i o n i s 9 9 %切t h i s m e t h o dk e yw o r d s : p l as m i d d n a , f e r m e n ta t i o n , s p e c i fi c g r o w th r a te , l a r g e - s c a le p u r if ic a t i o n , ct ab独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果， 除了文中特别加以标注和致谢之处外， 论文中不包含其他人己经发表或 撰 写 过 的 研 究 成 果 ， 也 不 包 含 为 获 得 一 孟4 t k 生 一 或 其 他 教 育 机 构 的 学 位 或 证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学 位 论 文 作 者 签 名 : 4 拿 0,签 字 日 期 :2 0 0 “ 年二 月 日学位论文版权使用授权书 本 学 位 论 文 作 者 完 全了 解- 孟建人 生有 关 保留 、 使 用 学 位 论 文 的 规 定。特授 权 .远 r 达 可以 将 学 位 论文 的 全 部 或 部 分内 容 编 入 有 关 数 据 库 进行 检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明)学位论文作者签名签字日期:夕 0 o 年ti 谴 a , 2 月日导 师 签 名 : 有一 如签字日 期:a - 只 年/ 2月日鞍山科技大学硕士论文前 言前言 质粒d n a是一种独立于染色体外，能够进行自 主复制的细胞质遗传因子。它能够编码起治 疗作用的蛋白 ， 也能被用来表达细胞膜上的 特定抗原， 刺激和增强免疫系统的反应和记忆，并由 此可能产生新一代更安全的疫苗。 自1 9 9 5年以后被批准的用于基因治疗程序中的质粒d n a转运载体的数目 呈现出 指数级上升的 趋势， 这些 载体在正 进行的 基因治 疗试用中占了 大约2 5 % tl 。 但是，质粒 d n a载体在转染细胞时效率较低，而临床上用于基因治疗的质粒 d n a的注射剂量的要求较大，因此大规模制备药用质粒d n a的研究势在必行。 大规模制备质粒d n a总的来说是从小试规模开始的。从目 前的情况来看，已经建立了多种从细菌中提取质粒d n a的方法， 这些方法无一例外都包括以下三个步 骤: 细 菌培 养; 收 集 和 裂 解 细 菌; 纯 化 质 粒d n a (2 1 。 菌 株 ( 微生 物) 及 恰当 表达载体的 选择和结 构是非常重要的， 接下来就是发酵条件的选择和优化 上游过程) ，细胞生长， 最后是分离和纯化步骤 ( 下游过程) 。 质粒d n a的产量不仅取决于菌体本身的性能，而且与培养条件密切相关，各种环境因 素， 如 温度、 p h , 溶氧 和 搅拌转 速等都 将影响 发 酵的 结 果。 从另 一 方面来说， 菌体的高浓度与质粒的产率之间又存在相互制约的矛盾， 这就使重组菌的发酵 工艺 直接 影响 质粒d n a的 产量。 c a r s t e n 等 3 1 通 过 调 节 培 养基中 氨 基酸的 浓 度，使 含有7 .6 k 6 p u k 2 1 c m v 0 e c o l i d h 5 。 质 粒产量提高2 .5 倍。 但总的 来说 ， 关于此方面的报道还很少。 目 前，大规模制备药用质粒d n a主要采用色谱法， 包括离子交换色谱、反向色 谱、 体 积 排阻 色 谱 等 4 -7 1 。 虽 然 上 述 方 法可以 得 到 各 种 形 式的 质 粒d n a ， 但是由于 质粒 分子 质量 很 大， 大多 是 从5 到2 0 k b ( 3 .3 x 1 0 “ 到1 3 .2 x l o d a ) ， 而目 前 商品化的色谱介质的孔径较小 ( 1 0 0 n m ) ， 在色谱操作中会引起很大的扩散阻力， 大大降低了介质的动态吸附容量。并且用于基因治疗的质粒d n a的需求量又十分大，例如， 对于恶性黑 瘤病人， 一剂以 质粒d n a为 载体的基因药 物通常 是。 .3 u g , 整 个治 疗过 程会需 要毫克 数量 级的d n a 8 1 。 有 些治 疗一 剂 药 就需 要 达到 毫克 级 9 1 。 正 是由 于以 上的矛盾， 大规模制备药用质粒d n a的方 法还有待简化和改进。 鉴于上述情况， 本文系统的 研究重组菌的发酵过程， 从摇瓶小试到i o l 发酵罐中试， 研究培养基、 搅拌转速、溶氧、 接种量、 抗生素、 无机盐等条件对菌体浓度和 质 粒 产量的 影响， 并 且 针 对 含 有p c d n a 3 质 粒的e c o l i d h 5 。 的 菌 株 对几 种 常 规的提取方法在收率、纯度、稳定和重复性上进行比较，为实现药用质粒d n a的产业化奠定了良 好的基础。 c t a b沉降法是大规模制备基因治疗用载体质粒d n a的一种非色谱纯化的 方法， 它具有操作简单， 设备、 材料费 用少等特点。 利用此方法鞍山科技大学硕士论文前 盲不仅能够有效的从蛋白 质、 r n a 中选择性的提取质粒大分子，而且能够基于不同d n a构象的差异，去除染色体d n a 、开环d n a ,线状d n a ， 从而得到纯度较高的超螺旋的基因治疗用质粒产品。鞍山科技大学硕士论文第一章 文献综述第一章文献综述1 . 1 基因治疗与质粒载体1 . 1 . 1 基因治疗、d n a 疫苗与基因克隆载体 基因 治 疗( g e n e t h r a p 妙) 是医学上一 种新兴的 治 疗技 术， 它是 应用遗传学的 原理， 从基因的水平对疾病进行治疗， 即， 将治疗基因引入病变细胞中， 代替或阻断致 病基因， 从 而 实 现 对 疾 病的 治 疗 1 0 ) 。 具 体 地说， 就 是 将 外 源 基因 引 入 人细 胞以 用来修改它们的遗传特性而达到治疗目 的的治疗策略。 通常， 该基因是能够编码起治疗作用、 破坏作用或者 标记作用的 蛋白 质的 双链d n a ( d s d n a ) 。 该核酸也可能是与宿主细胞里的目 标序列结合， 通过阻止信使 r n a ( m r n a) 或者启动子来抑制特定基因表达的反义r n a或者单链d n a ( s s d n a ) 。 基因治疗又被称为“ 分子外科， 。这种治疗方法是从根本上解决许多药物尚无法根除的遗传疾病 ( 如血友病) 的最佳途径，同时对于癌症、 动脉粥样硬化、 骨质疏松、 关节炎、 阿耳茨海默氏 病等因为特 定 基因 活 动 异 常 而 引 起 的 疾 病 的 预 防 和 治 疗 也 很 有 前 景 p 1 d n a疫苗又称遗传疫苗或基因 疫苗 ( g e n e t i c v a c c i n a t i o n ) ， 是 近年来兴 起的 一种以 重组d n a形式进行免 疫的 新技术1 2 1 . d n a疫苗以 重 组d n a为 基础， 将外 源基因重组于适当的表达载体，此基因在特定的启动子调控下得以表达。实验指出，肌肉注射是接种d n a疫苗的有效方法，除肌肉细胞外，表皮、 粘膜和静脉内注射都可以使外源基因进行表达， 产生免疫效果。 为了达到好的免疫效果， 可将表达重组体包理于脂质体内进行注射，这种方式比 用裸d n a直接注射效果好。 一般而言， 外源基因必须先同某种传递者结合后才能进入细菌和动物受体细胞 ( 靶细胞) ， 把这种能承载外源 d n a 片段 ( 基因)带入受体细胞的传递者称之为基因克隆 载体( v e c t o r ) 3 1 0 基因 克隆 载体是将治疗基因 带入 病变细胞的重要工具。质量好的基因治疗载体的获得是成功实施基因治疗的必备条件。 作为基因克隆载体至少必须具备 3个条件，即 ( 1 )具有能使外源 d n a片段组入的克隆位点;( 2 )能 够携带外源d n a进入受体细胞， 或游离在细胞质中 进行自 我复制;( 3 ) 必须具有选择标记，承载外源基因的载体进入受体细胞后，以 便筛选克隆子。 将治疗基因运送到靶细胞的细胞核上可以通过病毒载体或者非病毒载体。 经过遗传改造的病毒载体， 如逆转录病毒， 腺病毒， 单胞疹病毒和其它病毒系统在转运效率上可能比非病毒载体要高， 但是由于它们的毒性和免疫原性， 以 及致癌基因或者肿瘤抑制基因的可能 激活和抑制， 用病毒载体来传递基因的手段已 经引发了安全和规则性的 顾虑1 2 1 最近报道的 独立的 基因治 疗案 例中 有6 起死亡案 例便是 采用了鞍山科技大学硕士论文第一章 又献综述病毒载体，这强调了使用该类载体的安全和规则问题。另外，由于质粒d n a还具有特殊的性能， 它能够被用来表达细胞膜上的特定抗原， 刺激和增强免疫系统的反应和记 忆，并由 此可能产生新一代更安全的疫苗。 近几年来，基因治疗和 d n a疫苗发展十分迅速，己 进入使用化阶段。自 从1 9 9 5 年以 后被批准的 用于 基因 治 疗程序中的 质粒d n a 转运载体的 数目 呈现指 数级上升的 趋势， 这些质粒d n a转 运载体 在正 进行的 基因治 疗试用中占了 大约2 5 % 1 ,并且第一批基因治疗产品将很快被市场所接受，预计到2 0 1 0年该类产品在市场上将价值4 5 0 亿美元。 从目前来看，基因治疗和d n a疫苗主要用于研究开发心血管疾病、糖尿病、肝炎、 肿瘤、 免疫性疾病、 抗感染及抗衰老方面的 新型药物， 己 经逐步成为以d n a重组技术为基础的生物技术的主要成果之一， 并且应用基因工程技术改造或替代传统医药工业技术也是今后研究的重要发展方向。 我国自7 0 年代以来，开始应用d n a重组技术、细胞大规模培养技术研究肝炎疫苗， 并且应用以上技术改造医药产品的传统生产工艺。目 前已有一些基因工程产品投入市场。1 . 1 . 2 质粒载体一、质粒载体概述 质粒载体是以 细菌质粒的各种元件为基础组建而成的基因工程载体。 细菌质粒是一种独立于染色体外， 能够进行自 主复制的细胞质遗传因子。 质粒通常以 共价闭合环状 ( c o v al e n t ly c l o s e d c i r c u l a r ,简称c c c ) 的 超螺旋双链d n a分子 存在于细胞中 ， 但 是 从 细 胞中 分 离 的 质 粒 大 多 是 三 种 构 型， 即c c c 型 , 0 c 型 ( o p e n c ir c u la r f o r m )和l 型( lin e a r f o r m ) 。 质 粒 的 分 子 大 小 从l k b p 到2 o o k b p 不 定( 也 有 文 献上 报 道 质粒 分 子 大 小 从l k b p 到1 0 0 0 k b p lla l ) 。 质 粒 的 复 制 和 遗 传 独 立 于 细 菌 染 色 体 ， 但 其 复制和转录依赖于宿主所编码的蛋白 和酶。 质粒按照其复制方式分松弛型质粒和严紧型质粒。 前者的复制不需要质粒编码的功能蛋白， 其复 制完全依赖于宿主提供的半寿期较长的酶 ( 如d n a聚合酶 i 、 i i i 及依赖于d n a的r n a聚合酶) 来进行。当在抑制蛋白 质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素等抗生素存在时， 其拷贝数可达2 0 0 0 - 3 0 0 0个。 后者的复制则要求同时 表达一个由 质粒编码的蛋白 质，所以 该类质粒的拷贝数不能通过用诸如氯霉素等蛋白 合成抑制物来增加口二、用作基因治疗及d n a 疫苗的质 粒载体1 .用作基因治疗及d n a疫苗的 质粒载体遗传组件构成用作基因治疗及d n a疫苗的质粒载体一般由 三个主要的遗传组件构成:( 1 )鞍山科技大学硕士论文第一章 文献综述一个原核质粒载体， 该载体可在合适的宿主中 ( 通常是大肠杆菌) 增殖;( 2 ) 一个真核控制组件来操纵治疗蛋白 在靶细胞中的表达位置， 水平及持续时间; ( 3 ) 一段通常是编码具有治疗作用或者具有抗原性的蛋白的基因。 质粒在细菌中的复制还需要具有一段复制起始区。 该序列决定了 质粒复制的频率 及平均每个细胞中所含有的质粒拷贝数。现在使用的用作基因治疗的质粒载体几乎所有的复制起始区都来自p b r 3 2 2 质 粒或 者p u c 质 粒家 族。 这 些 质 粒的 复 制 起 始区 相 对 很小 ( 大 约6 0 0 b p ) ,并且不需要质粒编码的蛋白 来完成复制。 尽管未被明确证实和接受， 现在普遍认为质粒载体大部分应该是以超螺旋形式存在的。该形式的质粒在转移， 表达基因上比开坏结构， 线状结构和变性质粒更有效。2 . 用作基因治疗及d n a疫苗的 质粒载体的 产品 质量要求 基于质粒d n a的生物药剂是高度化学限定的，因此能用化学，生化和物理试剂对其进行分析。 为 确保产品 符合规格， 因此分析所制备的 质粒的安全性、 效力及纯度是使整个生产流程得以 建立的关键问 题。并且这三个检测指标又是相互关联，主要是由以下两个因素所决定。 ( 1 ) 宿主核酸 ( g d n a和r n a ) ， 蛋白 质 和内 毒素 在对用于临床的 质粒d n a进行 质量分 析中， 宿主 核酸 ( g d n a和r n a ) ， 蛋白 质和内毒素是主要应该检测的杂质。 这些物质可能随质粒一同被纯化， 如果被注入患者体内则可能导致严重的副作用。 评价用作基因治疗和d n a疫苗的d n a产品的纯度，安全性及效力的主要标准和推荐试剂如表 1 - 1 所示。 ( 2 )抗生素 在质粒载体构建中的另外一个重要问 题就是选择诸如抗性基因等筛选标记。 筛选标记被用来阻止发酵过程中不含质粒的细菌的生长。 这点是因为许多基因工程质粒尽管具有很高的拷贝数， 但在宿主细胞中会自 发地遗失。 高拷贝数的质粒会降低含有质粒的细胞的生长速率。由 此， 不含质粒的细胞就算以很低的速率生长， 也还是能很快地长得超过含有质粒的细胞。 将相应的抗生素加入到培养基中， 这样只有能表达抗性基因的质粒细胞可以 生长。 该技术因为简单有效而被广泛使用， 但是也有一些安全上的顾虑。 第一， 一些机构如 f d a( 美国食品药品监督管理局) 顾虑在发酵过程中 添加的抗生素有可能对最后质粒制备产品产生污染。 对使用氨节青霉素等带有0 一内 酞胺环的抗生素尤其要注意， 因 为该 抗生 素 在某些人体内 只需 很少量就可引 起过敏反 应。 第二， 在临床使用中，质粒中编码的抗性基因将不可避免地转移给病源体。鉴于以上的考虑，f d a指出在给人用的质粒的生产中 应该避免使用带有0 一内酞胺环的抗生素。卡鞍山科技大学硕士论文第一章 文献综述那霉素由此受到工业上和f d a的欢迎，因为它在临床上使用得不是那么频繁，而且没 有给 病人 造成过敏反 应的 隐 患 1 5 从安全方面考虑， 非病毒性载体系统变得更加可取， 成为商业产品中 最具吸引力的基因转移系统。 但是，质粒d n a载体在转染细胞时效率比病毒载体低，再加上这种基因疗法需要重复导入外源核酸， 所以对质粒的需求量很大。 例如， 对于恶性黑瘤病人， 一 剂以 质粒d n a为 载体的 基因 药物通常是。 .3 l.tg ， 但是整个治疗过程会需要毫克 数量级的 质粒d n a $ 。 因 此， 基因治 疗和d n a疫苗要由 实验室发 展到临 床实验和市场就必须发展大规模生产质粒d n a技术。 表1 - 1 基因 治 疗 载 体 质 粒d n a产品 质 量 要 求 dt a b l e 1 - 1 t h e q u a l it y re q u i r m e n t f o r g e n e t h e r a p y p l a s m id d n a杂质 及检测对象蛋白质a na9 d n a内毒素质粒异构体( 线状、 松弛、 变由生物活性和一致性推荐检测试剂双辛可宁 酸试剂琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳s o u t h e m杂交阿米巴 样溶解细胞产物检测琼脂糖凝胶电泳批准规格检测不出检测不出检测不出 o .o l u g ! ( g g 质 物 0 . 1 内 毒 素剿j-l / ( i a g 1 5 k b ) 时 优于 其它方法。 在实验室中 通常采用离心的方法将细胞碎片、变性蛋白 和核酸沉淀物同质粒d n a分离。 然而， 对于质粒d n a的大规模生产来说离心并不适合， 应当采用产生剪切力低的操作来完成。这主要是因为对于工业操作来说首先应避免将染色体d n a剪切成片段， 否则染色体d n a将从沉淀中 释放并污染质粒。 其次， 质粒在分离过程中也要受到剪切， 如果质粒分子过大， 则可能发生分子链的破裂。 工业上的离心机通常采用连续流加方式操作以达到高的处理量。 进入离心机的流体所产生的离 心 加 速 度可 能 导 致 剪 切， 从 而 打 散已 经 沉 淀的 物 质 和g d n a 6 2 7 。 因 此， 过 滤 成 为比 较理想的 操作 6 2 ,6 3 1 。 在过滤时 应该 使用助滤剂来减小过滤压力， 以 避免沉淀物受到剪切以 及g d n ) 、 片 段从 沉淀中 打散 而重 新 溶解到 溶液中。1 . 4 质粒制备液的净化和浓缩 尽管大多 数 g d n a在碱裂解过 程中 变性、 沉淀， 但通常在大肠杆菌裂解液中质 粒d n a只占 总 核 酸的2 % ( 质 量 百 分 数(6 4 ,6 5 1 ， 仍 然 存 在 大 量 的r n a和 蛋白 质，这些都必须在随后的净化和浓缩步骤中被移除， 同时应该降低溶液的体积以便于以后进行色谱操作。在生化工业中使用高浓度n h 4 a c 聚沉蛋白质是很普遍的方法，而且应该不会造成特殊的问 题。 还有一些报道指出，使用n h 4 a 。 或者l ;c i 等破膜试剂还可能沉淀出r n a 。 质粒d n a在净化步骤之后一般通过聚乙 二醇 ( p e g ) 浓缩以进一步移除小的核酸， 并在色谱纯化之前减小体积。 p e g聚沉后也可以用缓冲液代替，为下一步纯化准备质粒浓缩液。 不过， 也有文献报道可以 省去净化和浓缩这一步而将细胞裂解液直接上柱进行色谱纯化( u 。 这是因 为 质粒的 最终纯 化制备是要通过色谱来完成的， 如果通过色谱技术能够将质粒从细胞裂解液中纯化出来并达到相应的标准， 那就没有必要进行盐析，p e g聚沉等操作。1 . 5 质粒 d n a 的纯化1 . 5 . 1 质粒d n a 的色谱纯化法 色谱分离法是大规模纯化质粒d n a的方法之一。 它是利用待分离核酸的分子大小和化学性质 ( 电荷和疏水性) ，与配体结合的能力和因分子超螺旋结构引起的拓扑约束， 通过核酸与固定相的相互作用， 选择性地从杂质中分离和纯化质粒分子 11 。 到目 前为止，空间 排阻 色谱和离子交换色谱是大规模纯化质粒d n a的 技术核心， 而且这两种色谱手段经常结合在一起使用， 通常是先进行离子交换色谱， 再进行空间排阻色谱 ( 凝胶过滤) 。当然，在质粒纯化的文献中也有对反相色谱，离子鞍山科技大学硕士论文第一章 文献综述对反相色谱及三链 d n a - 亲和色谱的描述， 但都仅限于实 验室规模。有趣的是:在阴离子交换色谱，空间排阻色谱和反相色谱中，对质粒d n a从其他核酸中的分离在很大程度上都依赖于分子的大小。由 于质粒d n a体积很大，不能透过大多数商业上提供的为分离蛋白 质而设计的基质， 因此它们与固定相的结合大多发生在微粒的 外部。 这构成了 吸附 剂吸附能 力上的 缺陷， 用q - s e p h a r o s e f f 阴 离子交换树脂作对比 发 现每毫升该 树脂可以 吸附1 2 0 m g 人血清蛋白 ， 但是只能吸附4 0 - 2 0 0 p g质粒6 6 。 而且， 该问 题将随 着质粒分 子的 增大而变得更加严重。 由 此， 大 规模制备药用质粒d n a的纯化方法还有待简化和改进。一、离子交换色谱 核酸的整个电 荷取决于组成核酸分子的 碱基数量 ( 每个碱基一个负电 荷) ， 因此具有多阴离子结构的核酸可用离子色谱进行分离， 预计其洗脱性质符合分子大小变化的顺序。 但在研究不同固定相的阴离子交换色谱对双链d n a片段的保留能力时， 却观察到相反的结果。 这是由于一些双链d n a片段含有较高含量的a t ， 在色谱柱中 产生滞留， 说明 在离 子交换树脂上核酸的 洗 脱性 质取决于核酸的 序列 6 7 , 6 8 1峰滞留一般与双链d n a序列的a t含量不成比例。因此，从另一方面来说，核酸分子与阴离子交换树脂颗粒上孔的弯曲部位的适当作用有利于核酸分子结合到阴离 子交换树脂上， 推测 用离 子 交换色 谱 取决于 核酸的 构象 6 7 ,6 8 1 选择性和峰分辨率也受到核酸与固定相作用的影响。这说明核酸必须很好地适合树脂孔的大小， 而且必须与孔内 的弯曲 相配合， 才能到达较好的 分辨率和选择险 6 7 ,6 9 1 在离子交换色谱中，较大的梯度变化区间通常会提高两种组份的分辨度。梯度的变化率对低分子量的双链d n a组份的分离无太大影响， 但是若要分离大分子量的 核 酸， 保持 较小的 梯 度变 化 是 非 常 重 要的 7 0 1 。 选 择 变 化小的n a c l 浓 度梯 度可使松弛的超螺旋和变性的质粒 d n a部分分离，但是变化大的n a c l 浓度梯度却不能 将 其 分 离 6 7, 6 81 流速对核酸的分辨率没有太大的 影响，流速过高的唯一缺点是稀释了已 被洗脱的 核酸6 9 1 。 但是在工业色谱中， 流速 控制 保留 时间， 较高的 流速易导 致质粒的 损失 7 0 1二、空间排阻色谱 质粒d n a的超螺旋结构可以减小其流体力学半径。 通过探索质粒d n a的流体力学性质和使用具有合适选择性的分子排阻色谱固定相，有可能将不同的 d n a分子从r n a和其它一些较小的 分子如内 毒素和蛋白 质中 分离出 来7 11 。己 经有两 种不同 的 空间 排阻 色 谱固 定 相 用于 这一目 的( s u p e r o s e 6 和s e p h a e r y l s i 0 0 0 ) 7 1 7 1 1 .鞍山科技大学硕士论文第一章 文献综述这两种固定相可使大分子量核酸包括染色体d n a和质粒 d n a被排阻或被洗脱到接近固定相排阻限制分子，同时低分子量的杂质如 r n a 、蛋白 质和内毒素被保留在色谱柱中。 在装 填 有s u p e r o s e 6 的 色 谱 柱中( 排阻 分 子限 制 是蛋白 质4 0 x 1 0 6 d a , d n a4 5 0 b p ) ， 大分子量的d n a分子包括 染色体d n a和质粒d n a被固 定相排阻， 可很好地与小分子量杂质分离。 但利用该固定相仍然很难将超螺旋d n a和染色体d n a分 离 开 来 7 1 ,7 3 1 。 利 用 较 大 孔 径的 固 定 相 如s e p h a c r y l s 1 0 0 0 ( 其 排 阻 极 限 为 蛋白 质1 0 0 x 1 0 6 d a ， 线 状d n a 2 0 k b ， 球形 颗 粒4 0 0 r u n ) ， 可 将质 粒d n a和 染 色体d n a分离开， 其洗脱组分中 超螺旋 质粒d n a的 纯度接近1 0 0 % ， 回 收 率约为7 0 % 6 4 7 11 0 利 用s e p h a c r y s 1 0 0 0 可 将 质 粒d n a和 染 色 体d n a 分离， 这 取决 于 质 粒d n a和染色体d n a的相对浓度。 有人建议: 相对浓度较低可以 提高质粒d n a和染色体 d n a 的分离度。利用一前一后空间排阻色谱柱 ( 相当于增加了 柱长) 、提高染色 体d n a和 质粒d n a的 分 离 度 7 4 1 。 该 方 法的 唯 一 缺点 是 较高 的 稀 释因 子 在有限的检测水平下导致有用物质的损失。 由于蛋白 质的存在， 分子排阻色谱法纯化质粒d n a产量低， 因此， 其应用受到限制。 低流速和较小的装载体积可以 提高分离效率。 如果使用含杂质较少的 浓缩样品，可以提高生产能力，空间排阻色谱应是质粒d n a下游加工的最后纯化步骤【 7 1 1三、反相、疏水作用和离子对色谱 在反相和疏水作用的色谱柱中， 影响核酸保留时间的主要因素是分子大小、 碱基 组 成和二 级结 构 7 5 1 。 在反 相 色 谱中， 核 酸 分 子 越 大、 保留 时 间 越长。 但是 核酸 分子的 大小取决于碱基组成， 例如: 在核酸分子中a t 丰富区域的 双螺旋发生部分变性， 会在分子内部形成单链的区域， 使该段单链区域的碱基发生暴露， 增加了核酸分子与配体的相互作用。实验中观察到同长度单链寡核昔酸比 双链d n a片段更紧密 地与反 相、 疏水作 用的固 定 相结 合， 这也 证实了 以 上 假设 7 5 ,7 6 1 在离子对反相色谱中，有与上述结果相反的报道:与相同长度的原d n a分子相比 ， d n a片 段 上a t丰富 区 域的 部 分 变 性 会导 致 保留 时间 缩 短 6 7 1 。 这 种矛 盾可以 用分子一 配体的 相互作用方式来解释: 在离子对色谱中，核酸分子通过两亲离子与固定的配体作用。 在a t丰富区域上，单链区域的形成意味着电荷密度从每个螺旋2 个电 荷减少到1 个电 荷， 因此结合到这些区域上的两亲离子减小， 导致离子对表现较低的疏水性。在任何情况下 ( 离子对、疏水作用或反相色谱) ， 双链 d n a中单链区域的形成都取决于变性条件。 因此， 通过选择和优化这些条件， 可以 根据核酸的大小和碱基序列加以分离。 在反相色谱中， 保留时间还受核酸二级结构的影响。 由于质粒韶螺旋结构引 z鞍山科技大学硕士论又第一章 文献综迷的扭转约束， 使核酸能 更好地与固定相结合， 因此， 核酸保留时间随着超螺旋数的增加而增加 5 1 。 反相和离子对色谱已 经 被用来从溶胞 产物中 纯化质粒d n a (7 7 。 在这两项技术中，小分子量r n a 、染色体d n a片段和线状质粒d n a可以与超螺旋质粒d n a完全分离， 其中线状质粒d n a的保留能力最强。 但大分子量r n a不能从质粒中完全除去，因此需反复纯化。 以上方法需要使用有机溶剂从反相柱上洗脱质粒 d n a ，大部分的有机溶剂有毒性、 诱变性、易挥发并易爆炸，因 此，必须有人身安全和设备安全保护措施6 3 1尽管大规模纯化质粒d n a很少使用反相和离子对色谱，但这些技术已 经广泛地应用 于 分 子生 物 学 领 域， 同 时 也 是 研究 质 粒d n a制品 的 推荐 技 术 7 8 ,7 9 1 。 由 于 疏 水 色谱所使用的物质一般较安全，因此在纯化超螺旋质粒d n a方面很有前途。四、亲和色谱 亲和色谱基于连接在固相支持物上的寡聚核普和引入目 标质粒的特定序列之间 形成的 三重螺旋结构发展 起来8 0 。 显然， 这些 支持 物对超螺 旋构型的 质粒的 亲和力比 对 松弛 异 构 体的 亲 和力高 。 回 收 率 高 达6 2 yo ， 同 时 将r n a和g d n a的 含量降低 到 检 测 不 出 的 水 平 8 1,82 1 另外， 也有文献报道使用如乳糖阻遏蛋白 等能与特殊d n a序列结合的 物质小规模纯化质粒8 0 1 。 不管是寡聚核昔和质粒结合还是 特殊的蛋白 和质粒结 合， 亲和配体和固定相偶联， 并同质粒的目 标序列相互作用。 因为这种结合是依据特定序列的，所以亲和色谱能够高效地将质粒d n a从蛋白 质， r n a和非特定d n a中分离出来。 然而， 这些方法也只限于小规模的质粒纯化。 这主要是因为构建大量的亲和树脂在技术上有困 难，同时成本会很大。1 . 5 . 2 质粒d n a 的其它纯化方法 在s a r n b r o o k 8 3 1 的 一 书中 关 于 质 粒 纯化曾 经 提 到 诸 如煮 沸 裂 解， 碱裂 解等 方 法。这些方法在都使用了酚和氯仿沉淀杂质蛋白，以及使用r n a酶来消化宿主r n a .显然， 这一系列办法是不适用于用作基因治疗载体质粒d n a的规模生产的， 第一，这些方法都使用了有毒的试剂，如酚;第二， r n a酶的使用会提高产品的成本。此外， 蔗糖或者氯化艳ir 化乙 锭密度梯度超速离心虽然是质粒纯化的 标准分子生物学方法。 然而， 这些方法耗时， 而且很难扩大， 并且也使用了有毒和诱变试剂，因此这些方法对于用于临床的 质粒的生产是不合适的。 需要指出的是，质粒d n a的实验室制备和大规模纯化有很大的不同。从目 的上来讲， 实验室制备小量的质粒可能更多的从纯度上考虑， 但是要大规模生产质粒，除了纯度上的问题， 还有过程的可放大性， 重现性， 成本等诸多问题需要解决。 表1 - 3 为实验室制备和大规模纯化质粒d n a方法的比 较，鞍山科技大学硕士论文第一章 文献综述 表 1 一实验室制备和大规模纯化质粒d n a的方法比较t a b le l - 3 c o m p a r a t io n o f p l a s m i d p u r i fi c a t io n b e t w e e n l a b a n d l a rg e s c a le工艺步骤细胞裂解溶菌酶，r n a酶移除细胞碎片宿主 杂质的 移除 ( r n ag d n a , 蛋白 及内 毒 素 )浓缩质粒纯化离心r n a酶，蛋白 酶k ， 有机溶剂 苯酚和氯仿)乙醇沉淀超速离心， 离子交换及反相色谱 有毒，有机试剂)大规模生产不用酶，仅使用公认为安全的试剂过滤，离心或 膨胀床色谱盐析，p e g聚沉乙 醇或p e g沉淀离子交换色谱， 空间排阻色谱 ( 使用公认安全试剂)1 . 6 本文研究的主要内 容 综上所述， 质粒d n a的 大规模生产具有非常重要的意义。但目 前， 优化发酵条件以提高质粒产量还是一个经验过程，而质粒d n a的分离纯化方法还存在诸如商品化的色谱介质孔径较小， 色谱柱分离效率较低， 分离速度过慢等缺欠。 虽然以新型的灌注色谱介质为代表的双孔介质在生物大分子分离中性能 优异， 但其合成方法复杂， 成本高，限制了其大规模的 应用。 本文基于上述原因， 主要从以下几个方面进行研究。i . 对 含 有p c d n a 3 质 粒 的e c o l i d h 5 。 菌 株 的 发 酵 过 程 进 行 研 究 ， 对 培 养 基、 搅 拌转速、接种量、抗生素、无机盐等发酵条件进行优化，从而达到既适于菌体 生长，又能提高质粒产量的目 的。2 .研究p c d n a 3 质粒的 几种常 规 粗提方法， 确定 最 优粗提方案。3 .研究基因治疗用载体质粒 d n a的一种非色谱的大规模纯化方法一 一- c t a b沉 淀法， 并对这种方法进行工艺优化， 从而达到选择性的从蛋白 质、 r n a及其它 形式d n a中提取超螺旋质粒d n a的目 的。鞍山科技大学硕士论文第二章 重组大肠杆菌发酵工艺的 研究第二章重组大肠杆菌发酵工艺的研究 迄今为 止， 关于 优化发酵条件以 提高 质粒产量的 报道不多， 仅h o rn等i4 ) 少 数利 研工作者对其进行过研究。 至今，以 提高质粒产量为目 的 发酵条件的 优化在很大程度上还依据经验。 对于重组菌而言， 质粒的产量是衡量菌体发酵效果的一个重要指标， 它不仅取决于菌体本身的 性能， 而 且与 发酵条件密 切相关， 各 种环境因 素， 如 温度、 p h . 溶氧和搅拌转速等都将影响发酵的结 果。 另外，由 于菌体的高浓度与质粒的 产率之间存在相互制约的矛盾，因此在优化培养条件时，必须兼顾两者，才能产生大量稳定的 质 粒 d n a . 为 此， 本 章 系 统的 研究了 含 有p c d n a 3 质 粒的 重 组 大 肠 杆菌 的 发 酵 过 程， 从 摇瓶小试到i o l发酵罐中试，研究培养基、 搅拌转速、 接种量、抗生素、无机盐等条件对菌体浓度和质粒产量的 影响， 为实现药用质粒d n a的产业化奠定基础。2 . 1 菌种及质粒 实 验菌 种为 含有p c d n a 质粒的e c o l i d h 5 。 菌株， 由 中 科院 血液 研究 所惠 赠。该菌株用甘油在一 2 0 下保存。 p c d n a 3 为高 拷贝 质粒， 其片段大小为5 .4 k b . 实验制备的质粒均采用北京鼎国生物工程公司的质粒d n a小量提取试剂盒提取2 .2 实验材料与方法2 .2 .1 实验材料表2 - 1实验试剂试剂名称葡萄糖氢氧化钠二硝基水杨结晶酚亚硫酸钠酒石酸钾钠盐酸t a b l e 2 - 1 e x p e r im e n t a l纯度分析纯分析纯化学纯分析纯分析纯分析纯分析纯r e a g e出产单位天津化学试剂三厂天津市塘沽滨海化工厂北京西中化工厂天津化学试剂一厂天津化学试剂一厂天津市北方化玻购销中心天津化学试剂一厂鞍山科技大学硕士论又第二章 重组大肠杆菌发酵工艺的研究氨节青霉素琼脂粉蛋白膝酵母粉氧化钠磷酸二氢钾泡敌琼脂糖漠酚蓝二 二 甲苯青澳化乙 锭 ( e b )d na ma r k e r i v无水乙醇生化试剂生化试剂生化试剂生化试剂分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯生化试剂分析纯上海生物工程有限公司天津市东方卫生材料厂英国o x o id 公司英国o x o id 公司威海亚太制药厂沈阳市试剂三厂天津药业公司北京鼎国生物