（植物学专业论文）四种单盐胁迫对盐生植物碱地肤茎叶中溶质积累的影响.pdf

中文摘要 本实验以天然抗碱盐生植物碱地肤( k o c h i as i e v e r s i a n a ) 为材料。根据东北盐碱化 土壤的盐分组成，设置四种单盐胁迫，即n a c i 、n o c s o 、n b h c 0 。和na 2 | c 0 3 胁迫并根据碱地 肤对四种单盐的耐受程度分别设定胁迫处理的浓度范围。n a c l 为l 0 0 0 n 1 m 、n a 2 s 0 4 为0 8 0 0 m m 、n a h c 0 3 为0 “0 0 m m 、n a 2 c 0 3 为0 - , 1 7 5m m 。通过测定碱地肤幼苗茎叶 中n a + 、k + 等无机离子及脯氨酸( p r o ) 等有机渗透调节物质的积累情况，分析比较四种单 盐胁迫对碱地肤体内溶质积累影响的差异，进而探讨不同阴离子对碱地肤的胁迫作用以 及碱地肤对其生理响应的特点。实验获得的主要结果与结论如下： ( 1 ) 碱地肤对不同单盐胁迫的耐受程度明显不同。碱地肤对n a 2 c 0 3 、n a h c 0 3 、 n a c l 和n a 2 s 0 4 等四种单盐胁迫可耐受的最大强度依次为1 7 5m m 、6 0 0m m 、8 0 0m m 和1 0 0 0m m 。可见四种单盐对植物的胁迫强度明显不同。在相同的摩尔浓度下，其胁迫 强度依次为n a 2 c 0 3 n a h c 0 3 n a c i n a 2 s 0 4 。碱性盐的胁迫强度大于中性盐；c 0 3 2 的 胁迫作用大于h c 0 3 。；c l 的胁迫作用大于s o ? 。 ( 2 ) 碱地肤在溶质积累方面对不同单盐胁迫所作出的生理响应既有相似之处又各 具特点。四种单盐胁迫下，n a + 、s 0 4 2 。、脯氨酸、甜菜碱( 1 耐a i n e ) 、有机酸( o a ) 等各项 胁变指标均随胁迫盐浓度的增大而呈上升的趋势；k + 、c a 2 + 、m 矿+ 等离子含量则呈现先 下降后上升的趋势。在相同的n a ? 浓度下，n a c i 胁迫组的n a + 、c i - 和脯氨酸等三项胁 变指标的增加幅度明显大于n a 2 s 0 4 胁迫组，而对于甜菜碱和有机酸的积累，则是在胁 强较大时( 通常是n a + 浓度超过4 0 0 r a m ) 前者的积累量明显低于后者；k + 的下降幅度也 是前者大于后者，而c a 2 + 、m 9 2 + 等二价阳离子的增加幅度则是前者稍大于后者；由于 s 0 4 2 - 作为处理盐的阴离子，n a 2 s 0 4 胁迫下其含量稍高于n a c l 胁迫下的含量。n a h c 0 3 胁迫下，n a + 和有机酸、脯氨酸、甜菜碱的含量都呈上升趋势，k + 下降幅度与n a c i 胁迫 组相似，而c a 2 + 和m 矿等二价阳离子的增加幅度则高于n a c l 组。n a 2 c 0 3 胁迫下，n a + 、 有机酸、脯氨酸、甜菜碱、s o ? 、k + 、c a 2 + 、m 矿等八项指标均呈直线上升趋势，而 且升高幅度明显高于其它胁迫组。可见，不同的单盐胁迫对碱地肤的作用以及碱地肤对 其所作出的生理响应均有所不同。 ( 3 ) 四种单盐胁迫下，碱地肤茎叶中的渗透调节机制相似。都是以液泡中大量积 累无机离子及有机酸，细胞质中大量积累有机渗调剂甜菜碱为主。 ( 4 ) 四种单盐胁迫下，碱地肤茎叶中的离子平衡特点特别是阴离子的来源明显不 同。n a c l 胁迫下可能以c l 作为主要的阴离子，而在n a 2 c 0 3 、n a h c 0 3 、n a 2 s 0 4 胁迫 下有机酸对阴离予的贡献更为重要。 关键词：碱地肤；单盐胁迫；无机离子；有机渗透调节剂 a b s t r a c t k o c h i as i e v e r s i a n a , an a t u r a l l ya l k a l i - r e s i s t a n t h a l o p h y t e ，w a s c h o s e na st h e e x p e r i m e n t a lp l a n ts p e c i e sf o rt h i sr e s e a r c h a c c o r d i n g t ot h es a l t c o m p o n e n t so f s a l t - a l k a l i n i z e ds o i l i nt h en o r i h e a s to fc h i n a , f o u rk i n d so fs a l ts t r e s s o s ，n a c l ，n a e s 0 4 , n a h c 0 3a n dn a 2 c 0 3 ，w e r es e tu p a c c o r d i n gt ot h et o l e r a b i l i t yo f ks i e v e r s i a n at 0t h ef o u r k i n d so fs a l ts t r e s s e s ，w ed e s i g n e dd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o nr a n g e sf o re a c hs t r e s sg r o u p ，w h i c h w e r e0 1 0 0 0 m mf o rn a c i ，0 - - 8 0 0 m mf o rn a 2 s 0 4 ，0 6 0 0 m mf o rn a h c 0 3 ，a n d0 - - 1 7 5m m f o rn a 2 c 0 3 b yd e t e r m i n i n gt h ea c c u m u l a t i o n so fi n o r g a n i ci o n ss u c ha sk ? a n dn a + a n d o r g a n i cs o l u t es u c ha sp r o l i n e ，t h ed i f f e r e n c e so ft h ee f f e c t so ft h ef o u rs a l ts t r e s s o so nt h e s o l u t ea c c u m u l a t i o ni n 足s i e v e r s i a n as h o o t sw e r ea n a l y z e da n dc o m p a r e d , t h e nt h et r a i t so f v a r i o u sa n i o n s ( c l ，s 0 4 2 。，h c 0 3 。，a n dc 0 3 2 - ) s t r e s s i n go nk s i e v e r s i a n aa n dt h ep h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e so f 丘s i e v e r s i a n at ot h e s es t r e s s e sw e r ef u r t h e re x p l o r e d t h em a i nr e s u l t sa n d c o n c l u s i o n sf r o mt h ee x p e r i m e n tw e r es h o w e da sf o l l o w s ： 1 t h et o l e m b i l i t i e so f 足s i e v e r s i a n at ov a r i o u ss a l ts t r e s s e sa l ed i s s i m i l a r n l eh i g h e s t t r e a t m e n tc o n c e n t r a t i o n so ft h a t 足s i e v e r s i a n ac a nt o l e r a t et on a 2 c 0 3 ，n a h c 0 3 ，n a c la n d n a 2 s 0 4 ，a r e1 7 5m m ，6 0 0 r a m ，1 0 0 0 m m ，a n d8 0 0 r a mr e s p e c t i v e l y i ti so b v i o u st h a tt h e s t r e s si n t e n s i t i e so f t h ef o u rs a l t st op l a n ta r ev e r yd i f f e r e n t u n d e rt h es a m en d c o n c e n t r a t i o n ， t h eo r d e ro fs t r e s si n t e n s i t yf r o ms t r e n g t ht ow e a k n e s si sn a 2 c 0 3 n a h c 0 3 n a c l n a 2 s 0 4 1 1 s t r e s si n t e n s i t yo fa l k a l i n es a l ti ss 血o n g e rt h a nt h a to fn e u t r a ls a l t ；c 0 3 2 - i ss t r o n g e rt h a n h c 0 3 。；c i i ss t r o n g e rt h a ns 0 4 a - 2 t h ep h y s i o l o g i c a lr e s p o n s e so fs o l u t ea c c u m u l a t i o n si nj | = s i e v e r s i a n as h o o t st 0f o u r s a l ts t r e s s e sh a v es h o w nt h e i rs i m i l m f i e sn o to n l y , b u ta l s os h o w nt h e i rr e s p e c t i v et r a i t s u n d e rf o u rs a l ts t r e s s e s ，t h ec o n t e n t so f n a + ，s 0 4 2 jk 十，p r o l i n e ，b e t a l n e ，a n do r g a n i ca c i da l l i n c r e a s e dw i t hi n c r e a s i n gt h ec o n c e n t r a t i o no fs t r e s ss a l t s b u tt h ec o n t e n t so f 哎c 矿。a n d m 矿s h o w e d at e n d e n c yt h a td e c r e a s e df i r s ta n dt h e ni n c r e a s e dr a p i d l yw i t hi n c r e a s i n go ft h e c o n c e n t r a t i o no fs t r e s ss a l t s u n d e rt h es a n en dc o n c e n t r a t i o n , t h ei n c r e a s i n ge x t e n t so fc i ，n 矿，a n dp r o l i n ea n dt h e d e c r e a s i n ge x t e n to fk + i nt h es e e d l i n g ss t r e s s e db yn a c lw e r eg r e a t e rt h a nt h a tb yn a 2 s 0 4 h o w e v e r , u n d e rs t r o n g e rs t r e s s ( g e n e r a l l yo v e l 4 0 0m mo f n a + c o n c e n t r a t i o n ) ，t h ec o n t e n t so f b e t a l n ea n do r g a n i ca c i da c c u m u l a t e dc a u s e db yn a c ls t r e s sw e r el o w e rt h a nt h a tb yn a 2 s 0 4 s t r e s s mi n c r e a s i n ge x t e n t so fd i v a l e n tc a t i o n s ，c a ya n dm 矿，u n d e rn a c ls t r e s sw e r e s l i g h t l yh i g h e rt h a nt h a tu n d e rn a 2 s 0 4s t r e s s n l es 0 4 a st h ea n i o no fn a 2 s 0 4s t r e s s i t s c o n t e n tw a sh i g h e ri nn a 2 s 0 4s t r e s sg r o u pt h a nt h a ti nn a c is t r e s sg r o u p u n d e rn a h c 0 3s t r e s s ，t h ec o n t e n to f n a + ，o r g a n i ca c i d , p r o l i n e ，a n db e t a i n ea l li n c r e a s e d w i t hi n c r e a s i n gt h ec o n c e n t r a t i o no fn a h c 0 3 ；t h ed e c r e a s i n ge x t e n to fk ? w a ss i m i l a rw i t h t h a t u n d e r n a c ls t r e s s ；w h e r e a s t h e i n c r e a s i n ge x t e n t s o f d i v a l e n tc a t i o n s , c a 2 + a n d m 9 2 + w e r e g r e a t e rt h a nt h a tu n d e rn a c is t r e s s u n d e rn a 2 c 0 3s t r e s s ，t h ee i g h ts t r a i ni n d e x e s ，n r ，o r g a n i ca c i d , p r o l i n e , b e t a i n e ，8 0 4 2 , 霹，c a 2 + , a n dm 矿a l li n c r e a s es h a r p l y , a n dt h e i ri n c r e a s i n ge x t e n t i so b v i o u s l yg r e a t e rt h a n o t h e rs t r e s sg r o u p s i ti n d i c a t e st h a tt h e r ea r cd i f f e r e n c e sa m o n gt h ea c t i o n so fv a r i o u ss a l t s t r e s s e so n 足s i e v e r s i a n an o to n l y , a l s oa m o n gt h er e s p o n s e so f 足s i e v e r s i a n at ot h e s e s t r e s s e s 3 u n d e rt h ef o u rs a l ts t r e s s e s ，t h em e c h a n i s m so f o s m o t i c 喇璐曲e mi nt h es h o o t s0 f 五 s i e v e r s i a n aa r es i m i l a r t h e i rs h a r e de s s e n t i a lf e a t u r e sw c i et h a to r g a n i ca c i da n di n o r g a n i c i o n sa c c u m u l a t e dl a r g e l yi nt h ev a c u o l e s ，a n db c t a i n ca sa no r g a n i co s m o l y t ea c c u m u l a t e d l a r g e l yi nc y t o p l a s m 4 u n d e rt h ef o u rs a l ts t r e s s e s ，t h ec h a r a c t e r i s t i c so f i o nb a l a n c e ，e s p e c i a l l yt h es o u r t so f a n i o n s i nt h es h o o t so f 尼s i e v e r s i a n aa r ed i f f 蝴t ( 2 1 i sm a i na n i o nf o rn a c is t r e s s ，b u tt h e c o n t r i b u t i o no fo r g a n i ca c i dt oa n i o ni sm o r es i g n i f i c a n tf o rn a 2 s 0 4 ，n a h c 0 3 ，a n dn a 2 c 0 3 s t r e s s e s k e y w o r d s ：k o c h i as i e v e r s i a n a ；s a l ts t r e s s ；i n o r g a n i ci o n s ；o r g a n i co s m o l y t e i l l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学或其他教育杌构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：；送查生日期：銎盟! ! ：! 三 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：东 北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘，允许论 文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：；拯查参 指导教师签名： 日 期：旌丑q 6 ：i e l期： 电话翟三1 2 y 6 6 邮编： 绉 1 引言 土壤盐碱化已成为世界性的环境问题，自然因素及人为因素的长期影响使得全球范 围内的土壤沙化、盐碱化日益严重。全世界的陆地面积约有1 3 2 1 0 9 公顷，但具有开垦 价值的部分不超过7 1 0 公顷，其中已开垦为耕地的部分仅为1 5 1 0 公顷。在现有的 耕地中，大约有o 3 4 x 1 0 9 公顷( 2 3 ) 的盐土，另外还有0 5 6 x 1 0 9 公顷( 3 7 ) 的苏 打土“1 。盐土和苏打土广布于1 0 0 多个国家，大约覆盖了全世界可耕面积的l o 。基于 全球土壤盐碱化日益严重的事实，近年来关于植物抗盐碱方面的研究日趋深入。 1 1 植物抗盐机制的研究进展 总揽近年来有关植物抗盐机制的研究成果，可以将盐胁迫以及盐生植物的抗盐生理 机制概括为一句话，即：盐胁迫对植物的伤害作用主要是渗透胁迫和离子毒害，而植物 对盐胁迫的生理适应过程也以抵制离子毒害和渗透调节为主，具体情况如下： 1 1 1 植物对盐胁迫的反应形式多种多样，主要有： 1 1 1 1 盐胁迫对植物形态发育的影响 盐分对植物个体形态发育具有显著的影响，整体表现就是盐胁迫抑制了植物组织和 器官的生长，加速了发育进程，使营养生长期和开花期缩短，减少禾本科植物的分蘖和 籽粒数等。长时间处于盐胁迫下，植物叶片面积缩小叫，这可能是由于盐分影响了细胞 分裂和细胞延伸的速率或是减少了细胞延伸的时间。盐胁迫还加速了个体发育的进程。 g r i e v e 等报道了盐胁迫使小麦的主茎发育缩短了1 8 天，提早了生殖结构的发生，而且 小麦的开花时间也缩短了，即盐胁迫加速了小麦的成熟嘲。 1 1 1 2 盐胁迫对植物生理生化的影响 在逆境条件下，植物形态的种种变化都可以反映在内部的生理生化过程中。 1 1 1 2 1 盐胁迫对植物光合作用的影响一般来讲，盐胁迫对植物的光合作用具有抑 制效应，而且随外界盐浓度的提高，被抑制的程度也加大，主要是由以下几个原因造成 的： ( 1 ) 盐胁迫使叶绿体中类囊体膜成分与超微结构发生变化类囊体膜含有大量的 糖脂和不饱和脂肪酸，与光化学反应密切相关。膜脂的不饱和度增加有利于类囊体膜光 合特性的维持。盐胁迫下，细胞中n a + j 阳c 1 一的积累使得类囊体膜糖脂的含量显著下降， 不饱和脂肪酸的含量也下降，从而破坏了膜的光合特性，不仅如此，还使垛叠状态的类 囊体膜的比例减小嘲，引起光合能力的下降。 ( 2 ) 盐胁迫对叶绿素含量以及光能吸收和转换的影响叶绿素是类囊体膜上色素 蛋白复合体的重要组成，盐胁迫下叶片中的叶绿素含量会降低嘞，从而必将影响色素蛋 白复合体的功能，降低叶绿体对光能的吸收；色素蛋白复合体的损伤不仅影响能量的吸 收，还会影响类囊体膜的垛叠，使叶绿体中基粒的数量和质量下降。 ( 3 ) 盐胁迫对光合酶的影响在盐胁迫下，光合作用有关酶的活性不同程度的受到 抑制，尤其是r u b i s c o 和p e p 羧化酶。r u b i s c o 含量的降低是其总活性下降的主要原因。 r u b i s c o 活性的下降导致r u b p 、磷酸甘油酸、磷酸三糖含量的降低，p i 的再生也被抑制， 进一步降低了植物对c o , 的吸收和利用。 1 1 1 2 2 内源激素的改变 a b a 一直被认为是一种逆境激素，它存在于几乎所有的高等植物中，在植物种子的 发育和植物对逆境的适应过程中起着重要的调控作用。在所有的植物激素中a b a 是受环 境条件影响最大的一种嗍。据试验观测，多种逆境条件下很多植物中的a b a 水平明显上 升，而且外源a b a 的处理使植物呈现的形态和生理反应上都类似于这些逆境条件的刺激， 所以，在营养生长期，a b a 可能是启动了植物体内一系列的生理生化反应过程以应对外 界逆境条件，如干旱、盐渍和低温等。 除了影响植物的光合、碳代谢以及植物激素的水平，盐胁迫还引起植物呼吸作用、 氮素和蛋白质代谢、硫代谢及生物固氮活动的改变。 1 1 2 植物对盐胁迫的适应机制主要有以下几个方面： 1 1 2 1 降低体内盐分的方式 稀盐( s a l t d i l u t i o n )有一些生长在盐碱地的植物，它们的植物体的茎叶部分在 盐渍环境中能形成大量的薄壁细胞，即肉质化，可以从外界环境中吸收并保存大量的水 分，在植物从外界吸收大量盐分时，盐分即利用贮存的水分将吸进的盐分稀释到不会产 生毒害的水平，从而避免盐离子的毒害作用。植物产生肉质化的原因，一般认为诱导因 子是n a c l ，植物生长在盐渍环境中，外界n a c i 进入植物体，即诱导植物体分裂产生大 量薄壁细胞，形成肉质化的组织。例如在盐碱地区生长的碱蓬属( s u a e d a ) 、猪毛菜属 ( 白j 船j 8 ) 、海蓬子属( s a l f c o r n i a ) 等植物。 泌盐( s a l t s e c r e t i o n )有一些植物的茎和叶上生长着一种能够分泌盐分的机构 一盐腺。盐腺有两类，一类叫盐腺( s a l t g l a n d ) ，另一类叫盐囊泡( s a l t b l a d d e r ) ，都是 由表皮细胞分化而成的，通过把盐分分泌到体外从而避免盐离子的毒害作用。 拒盐( s a l t e x c l u s i o n )所谓拒盐，就是不让外界盐分进入植物体，或进入植物体 后将它们集中到根部，不让盐分进入植物代谢最活跃的地上部分。有的植物根部吸收细 胞细胞质膜组成特殊，对离子有一定选择性，不吸收n a + 离子。近来研究发现它是由d d 基因控制的，这种基因称为喜k + 恶n a + 基因。另一类植物能将盐分集中到根部贮存起来， 因为植物根部比较耐盐，而且植物重要生理功能主要在地上部而不在根部。这类植物将 盐分集中到根部的机理己基本研究清楚，认为是由脉内再循环机能完成的。 1 i 2 2 植物降低细胞水势提高其吸水能力的方式渗透调节 1 1 2 2 i 以无机盐作渗透调节剂进行渗透调节 有的植物如藜科的碱蓬、海蓬子和猪毛菜属植物，它以无机盐离子n a 和c 1 作为渗 透调节剂来进行渗透调节，其主要机理是利用离子区域化作用将盐离子集中到液泡中， 降低液泡水势，提高细胞的吸水能力。其机理是利用液泡膜上腺苷三磷酸酶( a t p a s e ) 和 2 焦磷酸酶( p p a s e ) 产生的，改变液泡的跨膜电势，提供离子的运输动力，使正离子n a 和负离子c 1 一进入液泡，运输蛋白载体也能将n a + 和c 1 - 运入液泡，这样既降低了细胞质 中盐离子浓度，又降低了液泡渗透势，提高细胞的吸水能力，使其可以正常地在盐渍环 境中生长繁殖。 1 1 2 2 2 以合成有机渗调剂进行渗透调节 有一些植物，如利用拒盐和泌盐手段适应盐渍环境的植物，它们细胞中盐离子浓度 比较低，不足以使细胞渗透势降低到在盐渍环境中可以吸取水分的水平，它们主要是利 用合成并积累可溶性无毒小分子的有机化合物作为渗透调节剂以补充无机离子的不足。 如可溶性碳水化合物、氨基酸、有机酸和多元醇等，常见的如葡萄糖、蔗糖，多种氨基 酸，如脯氨酸等，有机酸，如草酸、苹果酸等，多元醇如山梨糖醇、甘露糖醇等。另外， 在稀盐盐生植物中有机渗调剂还有平衡液泡水势，防止液泡从细胞质吸水的作用。在高 盐环境中，盐生植物为了减缓由盐胁迫造成的渗透不平衡，通常在细胞质中积累一些小 分子有机物，以此维持高的细胞质膨压，便于植物在高盐条件下对水分的吸收，以保证 细胞正常的生理功能。 1 1 2 3 产生适应酶 在盐渍环境条件下，植物体内的一些酶的活性被抑制，而另一些酶的活性被增大。 例如在蛋白质的代谢中，蛋白质合成酶被抑制，而蛋白质水解酶的活性则被促进，所以 在盐胁迫下，植物体内蛋白质分解加强。在蛋白质的分解过程中，除产生一些有用的氨 基酸外，还可以产生一些有毒性的物质，例如二胺化合物_ 尸胺和腐胺，以及一些有 毒性的氨基酸。有的植物则可以利用一定的手段去适应这种变化，这类植物在盐渍环境 中，可以产生一种适应酶即二胺氧化酶，将有毒的二胺化合物分解掉，从而避免它们的 毒害作用。 1 1 2 4 改变形态结构 盐生植物除叶片或茎部肉质化外，在适应盐渍环境过程中其形态构造上还有其他方 面的适应方式，例如叶片变小或消失( 海蓬子) ，叶片表皮角质化等。 1 1 3 植物抗盐基因工程研究进展 科学家们在对植物耐盐性进行了大量的生理生化研究后，在植物抗盐基因工程方面 也取得了长足进展，希望利用d n a 重组技术分离并转移植物耐盐基因使其能在转基因植 物中表达。最近几年，很多研究从有机亲和渗透调节剂角度出发对许多植物进行了遗传 改造，转入了许多外源基因，如提高烟草m 和拟南芥埘甘油醇的合成、烟草果聚糖的合 成嘲、烟草海藻糖的合成“”和烟草脯氨酸的合成“。与对照相比，这些转基因植株的亲 和渗透剂积累上升，抗旱抗盐能力得到提高，但是这些结果只是针对对照植株而言的， 远没有达到真正抗盐的需求。单纯考虑有机物质对细胞质的调节功能，忽略液泡在渗透 调节中的作用是行不通的。液泡作为植物细胞中一个巨大的调节体系，在植物对盐胁迫 的适应过程中起着很大的作用。a p s e 等o o 使拟南芥液泡膜上的n a + r 逆向转运体系通过 遗传改造过量表达，拟南芥可以适应2 0 0 m m o l 1n a c i 的胁迫。拟南芥是非盐生植物， 抗盐能力能达到这么高的水平，说明了液泡在植物适应盐胁迫上的重要性。推测在改善 3 细胞离子跨膜运输功能的基础上提高离子区域化功能，同时提高细胞质中有机渗透调节 剂的浓度，可能对增强植物的抗盐性会有一个显著的促进。涉及抗盐的基因很多，很难 用转基因方法将如此多的外源基因同时转入一种植物里进行表达调控，而且目前有很多 基因还没有被发现或明确。但是由于与抗盐有关的基因必然能被盐胁迫所诱导，这些基 因定是受盐胁迫产生的信号调节，盐胁迫所产生的信号可能作用于某些共同的调控因 子，再由调控因子来控制诱导基因的表达。最近发现一些转录调控因子能同受盐或干旱 胁迫诱导的调控基因启动子结合，这些调控因子将会是用于调控基因表达的热点“”，如 转录调控因子d r e b r a 与脱水敏感因子d r e 。 1 2 植物抗碱机制的研究进展 以往研究主要以中性盐n a c l 为研究对象“。“1 ，以渗透胁迫、n a + 离子代谢“”、抗盐性 相关基因的分子生物学“”“”及盐信号转导“”为主要内容，对碱胁迫涉及不多。土壤中 除了含有中性盐，还含有碱性盐，由于土壤碱化与盐化往往相伴发生，长期以来人们将 土壤可溶性盐分的增加总称为“土壤盐碱化”。土壤盐碱化一直是困扰农牧业生产的主 要问题，在我国东北的盐碱土中可溶性盐分的阳离子主要是n a + ，阴离子主要包括c 1 、 s 0 4 2 。、h c 0 3 一，c 0 3 2 一等啪1 ，这些离子均来自中性盐或碱性盐，它们明显改变了草原土壤的 物理、化学性质，不仅使其通气性、蓄水能力降低，有机质分解变慢，而且更明显的是 高p h 效应严重破坏了草原的生产力。在碱胁迫和盐碱混合胁迫方面，石德成等人开展了 部分研究工作，经过实验研究提出：中性盐胁迫和碱性盐胁迫是两种不同性质的胁迫， 它们应该相应地称为盐胁迫和碱胁迫o ”。石德成等人还曾以一些盐生牧草乜1 删和几种非 盐生植物”删为对象，研究了n a c l 和n 剖c o ，对它们的胁迫效应，结果表明：n a ：c 0 。对植物 的胁迫因素除了和n a c l 共有的离子毒害、渗透胁迫、离子不平衡之外，还有高p h 值和高 p h 值造成的矿质元素可利用性明显降低等胁迫因素1 。在n a , , c o s 对植物的胁迫因素中， 高p h 值是首要因素，离子毒害次之，渗透效应最小嘲。植物对高p h 环境的适应可能通过 两种方式进行：一是通过根系分泌 r 、有机酸及呼吸产生c 0 。等在根表面进行微环境的调 节；二是当胁迫超过根外调节能力时，则在体内积累具有缓冲作用的酸性代谢物。n a 2 c o a 对植物的胁迫作用，在有机酸、离子、可溶性糖含量以及植物生长、质膜透性、光合酶 活性等方面都不同于n a c l ，n a 2 c o 。对植物的伤害作用明显大于n a c l ，也更具有大的生态 破坏力o ”。盐碱混合胁迫下，低碱浓度时胁迫效应由盐浓度决定，即盐胁迫起主导作用； 高碱浓度时，碱浓度是主导因素，即碱胁迫起主导作用，但混合胁迫并不是盐、碱两种 胁迫的简单加合，而是具有相互增强的协同效应。还有人就碱土或碱性盐对作物的胁 迫作用的特殊性进行研究峥3 目，认为植物的抗碱性与其根部能否泄露a b a 有关嘲赵可 夫等人以真盐生植物碱蓬和农作物玉米为研究对象，以中性盐n a c l 为对照，从根系活力、 离子平衡、质子泵水解活性、离子区域化、渗透调节、活性氧代谢等方面，对n a ：c 0 。的 胁迫效应及机理进行了研究。结果表明n a 2 c 0 。胁迫下植株n a + 区域化能力的提高程度较小， 离子平衡遭到严重破坏，用于渗透调节的能量较多，活性氧清除能力降低。这些报道 不仅证明了碱胁迫的客观存在而且揭示了碱胁迫甚于盐胁迫的事实口1 “1 。 4 1 3 立题意义 前人主要以羊草、星星草等耐盐碱的牧草和向日葵、玉米等经济作物为研究材料， 在n a c l 和n a 2 c 鹏对植物生理胁迫效应方面做了较为细致的研究。但是自然界的盐碱土中 尤其是我国东北部的盐碱土，中性盐除了含有n a c l 外还有n a z s 0 4 ，碱性盐除了n a ：c o , 外还 有n a h c 0 3 ，关于四种单盐对植物胁迫效应的研究甚少，甚至没有。碱地肤( k o c h j 8 s i e v e r s i a n a ) 是一种抗碱的盐生植物啪1 ，一年生藜科，具有一定药用价值。在中国温带 地区、蒙古、西伯利亚和中亚的草原带、荒漠地带都有分布，在p h 值9 8 - 1 0 1 4 的自然 环境中仍能正常生长发育，常作为先锋植物侵入碱斑并定居形成单优势的盐生植物群落， 并在碱斑上保持相对的稳定性和完整性洲，可以作为改良东北碱化草原的优势草种之 一。关于碱地肤的生态生理适应性及其群落特征有过初步报道，而关于它的抗盐、抗碱 特性目前尚无进一步的报道。本文以碱地肤为研究对象，用四种单盐对其进行胁迫处理， 从而避免野外条件下多重因素相互干扰。通过测定各项胁变指标，从溶质积累的角度， 分析比较碱地肤在四种单盐胁迫下的生理响应特点，探讨四种单盐对碱地肤胁迫作用的 异同以及碱地肤对其不同的适应机制，为最终阐明天然盐碱混合胁迫的作用机制提供参 考。 2 材料与方法 2 1 单盐胁迫条件设计 根据东北盐碱化草原的盐分组成，共设n a c i 、n a 2 s 0 。、n a h c 0 3 、n a 2 c 0 3 四个单盐胁迫处 理组，依次标记为：a 、b 、c 、d 。根据碱地肤对四种单盐的耐受阙值，每组又分设不同 盐浓度梯度，具体如下： n a c l ：1 0 0 、2 0 0 、3 0 0 、4 0 0 、6 0 0 、8 0 0 、1 0 0 0 m o l l ，分别以a 卜a 7 标识，对应处理盐 的p h 值范围为6 o 卜6 7 8 。 n a c s 吼：5 0 、1 0 0 、1 5 0 、2 0 0 、3 0 0 、4 0 0 、6 0 0 、8 0 0 m o l l ，分别以b 卜b 8 标识，对应处 理盐的p h 值范围为6 0 8 6 8 9 。 n a h c o 。：1 0 0 、2 0 0 、3 0 0 、4 0 0 、5 0 0 、6 0 0 m m o l l ，分别以c 卜c 6 标识，对应处理盐的p h 值范围为8 0 2 8 2 9 。 n a 。c o 。：5 0 、1 0 0 、1 5 0 、1 7 5 砌0 1 l ，分别以d i - d 4 标识，对应p h 值范围为1 1 0 8 1 1 3 0 。 2 2 材料培养 碱地肤种子采于东北部天然草原，播种于直径1 7 c m 盛洗净细砂的塑料花盆内，用 砂培法培养碱地肤幼苗。4 月中旬于温室播种，保持相对湿度7 0 一8 0 ，采用自然光照， 出苗后每两天浇一次5 0 0 m lh o a g l a n d 营养液，分三次透灌，其余时间用蒸馏水补充蒸 发所散失的水分。约5 月初，移至室外培养，每盆定苗2 5 株。 2 3 胁迫处理 苗龄六周时选取长势均匀的碱地肤幼苗8 1 盆，随机分成2 7 组，每组3 盆为3 次重 复，其中1 组为对照，另1 组在处理开始时即取样测定处理前生物量，另外2 5 组为胁 迫处理组。每天处理一次，于下午5 - 7 时进行。以含有相应盐浓度的完全营养液为处理 液，每盆5 0 0 m 1 分3 次透灌，对照只灌h o a g l a n d 营养液。处理第一天各处理组均以l o o m m n a + 浓度为起始浓度，以后则以每天l o o m m 的n a + 浓度递增，达到设计浓度后维持不变。 当最高浓度组达到设计浓度之后继续处理七天，总计处理十五次。 2 4 胁变指标测定 最后一次处理后的次日凌晨三时取样。小心取出每盆中所有植株，先用自来水冲洗 然后再用蒸馏水洗净全株，并用吸水纸吸去附着的水分，将根与地上部分从子叶痕处剪 开，分别称取地上、地下两部分干鲜重。取出部分鲜样，剩余材料置8 0 c 烘箱内杀青 6 1 5 r a i n ，再置真空干燥箱内干燥至恒重，然后称取干重值。测定各项胁变指标。 2 4 1 钾、钠含量的测定嘲 提取：称取干样1 0 0 m g ，置于5 0 m l 三角烧瓶中，加入2 0 m l 蒸馏水，沸水浴2 小时， 冷却后将提取液滤入容量瓶中，用蒸馏水冲洗三角烧瓶并定容至5 0 m l ，取出i m l 用于含 量测定。 含量测定：用火焰分光光度计测定r 、n a + 含量。分别用n a c l 和k c i 配制1 0m m o l l 的n a 、r 标准液1 0 0m l 。用蒸馏水调零。根据样品的r 、n a + 含量，以适当浓度的标准 液调1 0 0 ，记录样品溶液的测定值。 含量计算：用下式计算样品中r 、n a + 含量 l ( + 或n a + 含量( m m g 明) = ( 标准液浓度样液测定值1 0 0 ) x 5 0 1 0 0 0 样品重量 ( d w 为干重) 2 4 2 脯氨酸含量的测定“町 标准曲线制作：取2 m 1 一系列浓度( 0 、2 、4 、6 、8 、1 0 i g m 1 ) 的脯氨酸标准液， 分别加入2m 13 磺基水杨酸、2m 1 冰醋酸和4m l2 5 酸性茚三酮溶液( 以3 ：2 的 冰乙酸和6 m o l l 的磷酸为溶剂进行配制) ，置沸水浴中显色反应6 0m i n 。冷却后加4m 1 甲苯萃取红色物质。静置分层后取甲苯相在5 2 0 n m 处测定o d 值。以脯氨酸浓度为x ，以 o d 。为y ，绘出标准曲线或计算出脯氨酸浓度与o d 。之间的线性回归方程。 脯氨酸提取：取干样l o o m g ，剪碎，加2m l3 磺基水杨酸研磨，匀浆倒入试管 中，用4m 13 磺基水杨酸洗研钵两次，均倒入试管中，置试管于沸水浴中提取l o m j n 。 冷却后以3 0 0 0r r a i n 离心l o m i n 。取上清液待测。 含量测定：取提取液2m 1 加2m l 水，2m 1 冰乙酸，4m l2 5 酸性茚三酮， 沸水浴显色6 0m i n 冷却至室温。加入4 m l 甲苯，振荡萃取红色物质。静置后，吸取甲 苯层，于5 2 0 n m 波长处比色，记录o d 值。 含量计算：根据样品液测定结果从标准曲线上查出相当的脯氨酸浓度，然后用下列 公式进行计算： 脯氨酸含量( 1 ig g d w ) = c v 2 i r c 代表查得脯氨酸浓度( 1 lg m 1 ) ：v 代表提取液体积( m 1 ) ；w 代表取样量( g ) 2 4 3 甜菜碱含量的测定m 1 标准曲线制作：在1 0 4 0 0 pg m l 范围内分别制作甜菜碱和胆碱的标准曲线。首先 配制四价铵类化合物( o a t s ) 沉淀液。取1 5 7 9 碘和2 0 9k i 溶于l o o m li m o l lh c i 中， 过滤，于一4 下保存待用。 取每个浓度的甜菜碱标准溶液0 5 m l 加0 2 m lo a c s 沉淀液，0 1 2 下( 冰水浴) 保温 9 0m i n ，间歇振荡，加2m 1 预冷水后，迅速加入2 0m 1 经过l o 预冷的二氯乙烷，在 4 下剧烈振荡5m i n ，4 下静置至两相完全分离。恢复至室温，取下相测o d 。 胆碱的标准曲线制作同上，但沉淀液需改为胆碱沉淀液。配制胆碱沉淀液时，取1 5 7 g 碘和2 0gk i 溶于l o o m l0 4m o l lp h8 0 的k h 。p o 广n a o h 缓冲液中，过滤，于一4 下保存待用。 7 甜菜碱提取：以甲醇：氯仿：水= 1 2 ：5 ：3 的比例配制甜菜碱提取液。l o m l 提取液 分次加入0 1 9 干样材料中，研磨提取，匀浆在6 0 一7 0 1 2 水浴中保温1 0m i n ，冷却后1 0 0 0 x g 离心1 0m i n ，收集水相。氯仿相再加l o m l 提取液，振荡，离心，取水相。氯仿相再 加4 m5 0 甲醇水溶液，振荡提取，离心。合并水相，调p h 至5 7 ，在7 0 1 3 下蒸于，用 2 m l 水重新溶解。 样品测定：取样品提取液0 5 m l ，按标准曲线的制作方法测出四价铵化合物和胆碱 的含量，用前者减去后者即为甜菜碱含量。 2 4 4 有机酸总量的测定嘲 总有机酸提取：称取鲜样5 0 0 r a g ，加少许石英砂和l m l2 nf i n 0 3 、5 m 17 0 乙醇研磨 成匀浆。倒入离心管中，用l o m l7 0 9 6 乙醇冲洗研钵并倒入离心管。浸泡1 5 2 0 分钟，其 间不时搅拌。然后3 0 0 0 r m i n 离心l o m i n ，上清液倒入5 0 m l 的三角烧瓶中。残渣加 5 m l7 0 乙醇搅拌浸提5 m i n 后离心，再用9 5 乙醇洗提一次，合并上清液。为中和0 3 加一滴酚酞到上清液中，边搅拌边滴加2 n 的n a o h ，当溶液变成玫瑰色后继续加l m l2 n n a o h 。然后加