（特种经济动物饲养专业论文）基因在家蚕脂肪体细胞核抽提物中的体外剪接.pdf

基因在家蚕脂肪体 细胞核抽提物中的体外剪接 特种经济动物饲养专业硕士研究生朱虹 指导教师夏庆友 摘要 在高等真核生物中，前体m r n a 的剪接及其调节是一个复杂的，由多禺子参与的过程。它 对基因的正常功能的技挥起着重耍的作用。p 此- m r n a 剪接，即把内含子去除并把外显子序列 连接成为成熟的m r n a ，是基因表达与调控的重要环节之一。选择性剪接是一个存在于多细胞 生物中的普遍现象，人类基因中约有3 0 的基禺有选择性剪接发生。多细胞生物的功能行 为和有机体本身的复杂性是通过蛋白多样性的增加或有效地协调各组分之间的网络关系完成 进化历程。 家蚕是重要的经济昆虫，更是经典遗传学研究的模式生物之一。许多研究证明雄蚕比雌 蚕抗性好，体质强，叶丝转化率高。单养雄蚕可在不增加成本的前提f 提高1 5 的产丝量， 而且雄蚕丝纤度细、偏差小丝质好，利于缫制高档生丝。因此，研究家蚕的性别决定机制， 最终实现单养雄蚕可以有教地提高蚕业生产效率和经济效益。同时鳞翅目昆虫是主要的农林 害虫r 而家蚕是鳞翅目昆虫的典型代表，解明家蚕的性别决定机制，以家蚕的性别决定机制 为模式，有助于开展农林害虫防治的研究。 在家蚕的性别调控机制中，基因的选择性剪接发挥了重要作用。因b m d s x 基因在雌蚕和雄 蚕中的拼接方式不同而产生性别分化。实验证明，像果蝇的出x 基因在雌雄中有不同的加工方 式一样，b m d s x 在雌蚕中是默认的拼接方式，而在雄蚕中是阻碍性拼接，有一个上游曜碍物阻 碍了第三和第四外显子的拼接，使雄蚕中缺少了第三和第四外显子。为了研, 峦- , a n r d a x 上游阻碍 物 b m d s x 拼接的影响，我们建立体外剪接实验体系来进行验证。 为此，我们先利用r a b 4 b 基因建立一个体外剪接的体系，然后研究r r a mb m d f x 基因在家 蚕雄性脂肪体细胞核抽提物中的体外剪接。r a b 4 b 基因是一个与细胞凋亡有关的基因。大小为 1 4 3 9 b p ，外显子为1 0 9 4 b p ，内含子为3 4 5 b p 。由于b m & x 基因内含子较大，很难在体外发生拼 西南大学硕十学位论文 接反应，因此需要构建一个小的b m d s x 基因，我们称之为m i n ib m d 豇基因。即将丈部分内含 子序列去掉，只剩f 含有拼接必需成分的较小内含子。构建好的m i n i b m d s x 基周大j , 3 j 2 2 6 4 b p ， 台有4 个外显子3 个内含于。将克隆至f l p g e m - t e a s y 载体上的m i n i b m d s x 基因经p c r f f 增纯化 后，体外转录得到的p r e m r n a ，在细胞援抽提物中进行体外剪接。构建的m m ib m d s x 基因在 雄蚕核抽提物中发生剪接时，第三外显于羽i 第四外显子连同内含子一同被鳟接掉，第二和第 五外显子连在一起，大小为3 6 2 b p 。 在家蚕的性别调控机制中，b m d s x 扮演一个比较重要的角色。砌如砸过在雌雄中的选择 性拼接屉终决定个体的雌雄分化，本研究建立了一个r m n i b m d s x 基因的体外剪接体系，这将有 助于通过体外拼接实验来研贫( , b m d s x 的拼接机制，并进一步找到丑诎上游的调控因子，进而 研究家蚕性别决定的分子机制。 关键词性别决定细胞核抽提基因克隆体外剪接 i i g e n e s p l i c i n gi nv i t r ou s i n g an u c l e a re x t r a c t f r o m b o m b y x m o r if a tb o d y r a i s i n go fs p e c i a le c o n o m i ca n i n t a lm a s t e r z h u h o n g a d v i s i o r p r o l = x i a q m g - y o u a b s t r a c t s p f i c i n gm a dr e g u l a t i o no f p r c - r n r n a a r cc o m p l i c a t e dp r o c e s s e s ，w h i c hi n v o l v em a n yg e n l bi n a d v a n c e de u l a r y o t e s i tp l a y sm i m p o r t a n tr o l emc o r r e c t l yf u n e l i o n i n go fg e n e s s o l i c m go f p r e - m r n a ，n a m e l yr e m o v i n g i n t l u n sa n d a s s e m b l i n g 。x o f l s i n t o m a t u r e m r n a ，i s o n eo f i m p o r t a n t t a c h e si ng e n i ce x p r e s s i o na n dr e g u l a t i o n ，s e l e c t i v es p l i c i n gi sac o n i n o na f f m ri nn m l t i c e l l u l a r o r g a n i s a m 。i t e x i s t s i na b o u t t h e y p e r c e n t o f h u m a n s g e n e s t h e f u n c t i o n , b c l m v i n u r s a n d t h e i r o w ! c o m p l e x i t yo f m u m c e l l u l a ro 枇a s m ae v o l v e de a r o n 曲i n c r e a s i n ga l b u m e nd i v e r s i t y o re f i e c t i v e l y h a r m o n i z i n g t h en e t w o r kr e l a t i o n s h i po f e l e m e n t s t h es i l k w o r mw a sa n 叩i t a n te c o n o m i ci n s e c t ，f a l r l i l g t n l o r e ，i tw a so n eo f t h em o d e lc l e a t l l r i nc l a s s i c a lg e n t i l e s m a n ys t u d i e ss h o w e dn l a l es i l k w o r mh a dh i g h 口r e s i s t a n c e ，t r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c ya n db e t t e rc o n s t i t u t i o nt h a nf e m a l e o n l yr a i s i n gm a l es i l k w o r mw o u l di n c r e a s et h e s i l k - p r o d u c l i o nb y1 5 w i t h o u tn oa u g m e n to fc o s tm e a n w h i l e s i l kp r o d u c e db y i a l es i l k w o r m w a sf i tt op r o d u c el l i 曲础r a ws i l kd u et oi t st h i ni n t e n s i t y , l i t t l e w i n d a g ea n dg o o dq u a l i t y t h e r e f o r e , s t u d y i n g t h es e x - d e t e n i n n a l i o nm e c h a n i s mo fs i l k w o r mw o u l df i n a l l yi m p l e m e n tt h e r a i s t n go f m a l es i l k w o r ma n de f f e c t i v e l yi n c r e a s ep r o d u c i n ge f f i c i e n c yo f s e r i c u l t u r ea n de c o n o m i c b e n e f i t s i m u l t a n e o u s l y , l e p i d o p t e r aw s sam a j o rk i n do fp e s t s s i l k w o r mw a sat y p i c a l r e p r e s e n t a t i v ei nl e p i d o p t e m c l a r i f y i n gt h es e x d e k f m 缸l m e c h a n i s mw o u l dc o n t r i b u t et ot h e $ 1 r l d i e so nc o n t r o lo f i n b c c t s h lt h em a e h a n i s mo fs e x - d e t e r m i n a t i o ni ns i l k w o r m t h es e l e e l i v es p l i c i n gp l a yai m p o r t a n t r o l e - b m d s xw o u l dp r o d u c es e xd i f f e m n f i a t i n nd u et oi t sd i f f e r e n ts p l i c i n gm o d s e x p e r i m e n t s d m n o n s l r a t e db 溅, a st h es , m f n e d a xi nd r o s o p h i l a ，w h i c hh a dd i f f e r e n tp r o c e s s i n gf a s h i o ni n m a l ea n df e m a l e ，w a sat o l e r a n ts p l i c i n gm o d ei nf e m a l es i l k w o r m b u ti nm a l e , i tw a sb a r r i e r s p l i c i n g ：n a m e l y eb a r r i e rb l o c k a d e dt h es p l i c i n gb e t w e e nt h et h i r da n df o r t he x o n s t h u st h et w o e g o n sd i dn o te x i s ti nm a l e i no r d rt oi n v e s t i g a t et h ee f f e c to fu p s t r e a mb a r r i e ro nt h es p i c m go f i l l 两南大学硕士学位论文 b m d s x , w ec o m 廿u c t e ds p i 记i n gs y s t e mi nv t r o f i r s t ，w ec o n s t r u c t e ds p l i c i n gs y s t e mm v i t r ob yr a b 4 b t h e n ，w ee a r n e do u ts t u d i e so f b m d s x o ns p l i c i n g i nv t r o i n n u e l e o l u so f f a tb o d y i n f e m a l es f l k w o n n r a b 4 b w a qaa p o p t o t i cg e n e w i t h a s i z eo f a b o u t1 4 0 0 b p t h e r e i n t o 。e x o nw a s1 2 0 0 b pa n di n t r o nw i l t s2 0 0 t l p ，b e c a u s ei n t r o oi nb m d s x w a sr e l a t i v e l yl a r g e ，i tw a sd i f f i c u l tf o rb m d s xt os p l i c ei nv i t r o i tw a si nn e e dt oc o t l g t r u s tam i n i b m d s xg e n ei or c m o v ct h em a j o t yo fm 自r o n 3a n do n l y c a v es m a l l e ri n t r o n se s s e n t i a lt o s p l i c i n g t h em i n ib m d s xw 2 2 6 4 6 p c o n t o i n j n g4e x p o sa n d3i n t r o n s t h eg e n ec l o n e di n t ov c c t o r p g e m - te a s y ，a sp u r i f i e da f t e rp c ra m p l i f i c a t i o nt h e nt r a n s c n p e di nv i t r o t h ep r e m r n a s p l i c e di nv i t r oi no u c l e o t h a b s t r a c t _ w h e nt h em i n i b m d 3 xa l r e a d yc o n s l r u g t e dw a ss p l i c e di nm a l e n u c l e o t ba b s t r a c t , t h et h i r d ，f o t m he x o l ba n dt h ei n t r o n sw e i ec u tt o g e t h e r , w h i l et h es e c o n da n dt h e 6 f i l ie x o n s l i n k e d t o g e t h e r , w i t h as i z e o f 3 6 2 b p 曰m 出7p l a y e da ni m p o r t a n tr o l ei nt h es e x - c o n t r o lm e c h a n i s mo fs i l k w o r mc o n s o l i n ga s p l i c i n gs y s t e mo fm i n ib m d “c o n m b u t e dt dt h es t u d i e s o l ls e x - d i f f c r e n d m i o n t h i o n 曲s e l e c t i v e s p l i c i n gi nf e m a l ea n dm a l e ，b m d s xu | f i m a t o l yd e t e r m i n e di n d i v i d u a ls e xd i f f e r e n t i a t i o n t h e s l u d ye s t a b l i s h e das p l i c i n gs y s t e mo fm i n ib m d s xi nv i t r o 。w h i c hw i m u u m e n t a li nf i l es t u d i e so n s p l i c i n gs y s t o mo fb m d s xt h r o u g he a r r i n go u ts p l i c i n ge x l ) c r i m e n t s i nv i t r oa n dl o o k i n gf o r r e g u l a t o r yf a c t o r sl o c a t e di nt h eu p s t r e a mo f b m d c xa n dd a r i f y i n gt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mi ns “ d e t e r m i n a t i o no f s i l k w o n r i l k e yw o r d s ：md e t e r m i n a t i o n n a c l e a re x t r a c t g e n ec l o n es p i k i n gi nv i t r o 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 生物体性别决定类型 生物体的性别决定因物种的不同而不同，有的物种是x y 型，如果蝇其雄体的性染色 体为x y 。雌体为x x ：有的物种是z w 型，如家蚕阱，其雄体的性染色体为z z ，雌体为z w ； 有的物种是单倍二倍型，如蜜蜂其雌体由受精卵发育而成( 2 n ) 。雄体由未受精卵发育而成 ( n ) 1 3 1 它们的性别决定机理各不相同，有的有剂量补偿，如果蝇刚；有的没有剂量补偿， 如家蚕 z l 。生物体的性别决定方式多种多样，总的来说有以下几种类型。 1 1 i 性染色体决定性别 许多生物的体细胞内除含有成对的常染色体外，还有一对随性别不同而组成也不同的性 染色体，这对性染色体与性别决定直接相关。性染色体决定性别有以下两种形式。 1 1 i 1x y 型性别决定 x y 型性别决定类型在动物界很普遍，哺乳动物、双翅日昆虫、某些鱼类和某些两栖类的 性别决定属于该类型。x y 型性别决定类型中雌性为同配性别( ) 。，体细胞内含有两条x 染 色体，所产生的性细胞只有一种仅含一条x 染色体；雄性为异配性别体细胞内含一条x 染色体和一条y 染色体，产生两种性细胞，一种只古x 染色体，一种只含y 染色体。当舍x 的卵细胞与含x 的精子结合形成的受精卵) 【) ，将发育成雌性；含x 的卵细胞与舍y 的精于 结合形成的受精c p ( x y ) ，将发育成雄性。因而雌性和雄性的比例一般总是l ：l 。 x y 型性别决定有一种特殊形式即x o 型性别决定。它的雌性的性染色体为x x ，雄性的 性染色体只有一个x 而没有y ，不成对。其雄性个体产生含有x 和不含有x 两种雄配子， 故称为x o 型。蝗虫、蟋蟀等就属于这一类型。 1 1 i 2z w 型性别决定 鸟类、鳞翅目昆虫、某些鱼类、某些两栖类及某些爬行类属于z w 型性别决定此类型 跟x y 型相反，雌性个体为异配于性别，即z w ，的雄性为同配子性别，即7 1 ，在形成配子 时，雌性个体产生含有z 和w 睡种雌配子，而雄性只产生含有z 一种雄配子。受精卵发育成 的个体雌雄比同样约为1 ：1 z w 型性别决定也有种特殊形式即z o 型性别决定。此类型的雄性为同配性别( z z ) 体 细胞内有两条相同的z 染色体，仅产生一种只含z 染色体的精子。雌性为异配性别( z w ) 。体 细胞内仅含条z 染色体而没有w 染色体，产生两种卵子一种含有i 条z 染色体，一种不 含性染色体，二者各占半。受精卵有两种类型，z z 型为雄性，z o 型为雌性，雌雄比例约 为i ：1 1 4 l 。 两南大学硕十学伊论文 1 1 2 环境条件决定性别 在低等脊椎动物中个体的性别决定与性剐分化受其发育史的早期阶段某一时期的温度 光照、外源激素或营养状况等环境条件影响，这种类硝的性别决定称为环境条件决定性别。 龟类是典型的环境条件决定性别，大多数龟类无性染色体，其后代的性别绝大部分由孵 化时的环境温度所决定，而且多数龟类低温时孵出雄性( 2 0 - 2 7 ) 后代，高温( 3 0 - 3 5 c ) 时孵 出雌性后代。在两种温度问则既可孵出雄性后代，亦可孵出雌性后f 妒l 。 鳄类在3 0 c 及以f 温度孵化则全为雌性，3 2 c 时雄性则占8 5 ，雌鳄仅占1 5 ，且孵化 时在第2 周刊第3 周的温度是胚胎的性别决定期1 6 1 许多线虫是靠营养条件的好坏来决定性别的，它们一般在性别来分化的幼龄期侵入寄主 体内低感染率时营养条件好，发育成的成体基本上都是雌性，而高感染率时营养条件差， 发育成的成体通常都是雄的n 。 1 1 3 染色体的单双倍数决定性别 膜翅目昆虫属于染色体的单双倍数决定个体的性别。如蜜蜂的雄蜂由来受精的卵发育而 成，只具有单倍的染色体数；雌蜂由l e 常的受精卵发育而来，为2 倍体。而雌蜂是发育成可 育的蜂皇还是不育的工= 蜂则由营养条件的差异决定。若整个幼虫期以蜂王浆为食，幼虫发育 成可育的蜂皇；若幼虫期仅食2 - 3 天蜂王浆，刚发育成不育的工蜂 s l 。 1 1 4 性染色体与常染色体的比例决定性别 在果蝇中，雌性染色体组成为x x 型，雄性为x y 型，但y 在性别决定中并不起作用， 个体的性别由x 染色体的数日与常染色体( 从) 套数之间的比例决定。当x x ：a a 为l ：i 时为雌 蝇，x x ：a a 为0 5 时为雄i 黾【9 l 。 1 1 5 多基因决定性别 该类型性别决定是指性染色体x 和y 包含主要的雌性和雄性决定基因，而在常染色体上 含有次要的性别决定基因。性别不仅由性染色体决定而且还受常染色体的影响。通常情况 下，常染色体基嗣保持平衡，使性别决定依照性染色体机制进行。但在某些个体，常染色体 可能重新组台，导致某一性别的常染色体因素过剩，使性染色体机制无效。有人认为雌雄 异体鱼类的性别决定包含多个基闳当决定雄性的基因总量超过决定雌性基冈的总量时台 子将是雄性，反之亦然。剑尾鱼，青锵、搏鱼和多种罗非鱼等均属f 这种类型的性别决定”哪。 1 1 6 性反转 在某些条件下，动物的雌雄个体相互转化的现象称为性反转。性反转现象在鱼类中比较 常见，如黄鳝的性腺，从胚胎到性成熟是卵巢，只能产生卵子。产卵后的卵巢慢慢转化为精 2 第一章文献综述 巢。只产生精子。所以，每条黄鲳一生中部要经过雌雄两个阶段j 。研究表明，外源激素可 起到性逆转作用如果在稚鱼性腺性别分化的关键时期注射甾类激素可得到单性或原发单 性种群。从动物的种类看，成年的鱼和蛙能在激素或其它因素影响下转变性别，未分化的鸡 胚可用激素使之转变性别。哺乳类成体均不能转变性别，但如在胚胎尚未性分化时注射性激 素可使胚眙发生雌雄同体现象【1 2 1 1 1 7 微生物引起的性别扭变 在昆虫和螨类中鉴定出一些细胞质传导的、能改变正常的性别决定机制的有机体( 细菌、 病毒和原生动物) 、能操纵寄主性别( 通常是增加雌性或偶尔增加雄性的比率) 且能促进它们 自身传播的胞质性别扭变物。大多数性别扭变物最初通过母体遗传而后是细胞质遗传。胞质 性刺扭变物的传播常常降低其寄主的适合度且能驱动种群的消退 细菌诱导的性别扭变的机制主要分为3 种：微生物诱导的产雌孤雌生殖；雄性在未 成熟期选择死亡( 雄性致死) ；雄性的雌性化。微生物诱导的产雌孤雌生殖已知仅存在寄生 蜂中，是由于沃尔巴氏体属细菌感染引起的。主要的性别扭变物有下面几种。 1 i 7 1 螺原体 果蝇d 硼u - s c 0 i 五及其近缘的新热带区种类的性别状况取决于螺原体( s p i r o p l a s m a s ) 螺原 体是母系遗传和转卵传播的且导致雄性胚胎死亡。通过注射血淋巴，螺原体可以在种问传导， 但来自不同种的螺原体是不同的，与每一种螺原体相关联的病毒也是互不相同的。当来自不 同种的螺原体被混合时，由于其中的一种病毒裂解其它种的螺原体而引起结块 1 3 1 1 i 7 2l 型细菌 链球菌的l 型细菌仙矗玳nb a c t e t i a ) j 丘过卵细胞质传递，能被显微注射进非杂种雌性果蝇 体内使之产生不育的雄性子代。 1 1 7 3 产雌孤雌生殖微生物 在膜翅耳赤眼蜂种类，某些情况下微生物可引起产雌孤雌生殖。当用抗生素，如利福平 或四环素处理带有微生物的赤眼蜂时，或将该赤眼蜂饲养在高温下，则产雌孤雌生殖能被治 愈且雄性和雌性后代均能产生。但缺乏微生物的赤眼蜂种类，其产雌孤雌生殖是不可逆的”i 。 1 1 7 4 沃尔巴克氏体属 沃尔巴克氏体属在昆虫中普遍存在，能改变昆虫的性别( 引起产雌孤雌生殖) 和导致胞质不 亲和性。由沃尔巴克氏体引起的胞质不亲和性在昆虫中呈现普遍性。大量的沃尔巴克氏体已 在具胞质不亲和性昆虫种群的卵巢和睾丸中被发现。在某些情况下它们能同时被雄性和雌 性传播，而在其它情况下它们只通过雌性传播。t i m o t h y l 提出，耩子成熟过程中沃尔 巴克氏体以某种方式干扰严密安排的精子染色体与卵子染色体联会程序。在果蝇卵中发现。 3 西南大学硕十学位论文 沃尔巴克氏体结合于特殊的卵蚩白质上，其中一种蛋白质正常存在于果蝇卵细胞的核里，但 在赌染沃尔巴克氏体的卵细胞中，它们浓集于整个细胞质的若干点上。同样的现象也发生于 睾丸，但在精子发生时期。随着精子的成熟，沃尔巴克氏体被排除精子，同时把结合的蛋白 质也带走了。这一精子蛋白质在受精早期不是必需的，但它对协调精子染色体与卵子染色体 的联会极为重要，因为精子蛋白质破沃尔巴克氏体分解了，所以感染雄虫与未感染雌虫交配 后的受精卵不能孵化i l “。 在2 0 世纪的前半叶，细胞遗传学的研究表明性染色体在动物种闯甚至非常相近的种 闻存在着变异，这意味着性染色体进化较快。此后的遗传学研究表明，即使在一些染色体明 显相同的种间，性别决定机制也不同如家蝇。这就进一步加宽了性别决定机制潜在的变异 性。甚至鉴定出了性别决定机制在种内的差异川。 尽管性别决定分子机制极其多样化但它们仍然具有某些共同特征。最近的研究表明， 在哺乳动物和果蝇中鉴定的性别决定基因相当古老。而且尽管果蝇和线虫的主要性别决定机 制存在很大的不同，但是它们调控性别决定的一些下游基因在功能上是相似的。对果蝇的分 析表明，性别决定由相同的级联途径调控至少存在6 千万年，在这一途径中，部分基因可能 存在了更长的时间。尽管位于调控途径顶端的基因在较近的年代才与性别决定有关，但至少 有一部分下游基因似乎在更久远的年代与性别决定相关 1 l - 1 9 1 。 1 2 家蚕性别决定研究进展 家蚕是重要的经济昆虫性别调控研究一直是家蚕遗传学和分子生物学研究的重点和热 点。雄蚕与雌蚕相比，体质强健，叶丝转化率高，且丝质优良。在体重相同的情况下，雄蚕 营造丝物质的能力比雌蚕强。在蚕业生产上，雄蚕各项经济性状显著优于雌蚕，专养雄蚕比 目前的雌雄各半混养可提高经济效益1 0 以上。因此，在丝茧育上专养雄蚕具有巨大的经济 意义。而在蚕种生产上。由于雄蚕体质强健，耐冷藏，变配时可以重复使用，所以在家蚕制 种业中人们希望增加雌蚕比例达到提高产帚的目的。因此。控制家蚕雌雄性别比例，是很久 以来引人注目的课题之一。 家蚕具有很长的的遗传研究历史，已鉴定了4 0 0 多个可见变异，包括性别依赖性突变体 和生殖异常。其中2 0 0 多个突变基因已被定位在连锁图谱上。另外，在家蚕中根容易获得多 倍体和人工雌雄嵌合体。因此，家蚕是适合于性别决定研究的好材料。家蚕的性别决定是无 脊椎动物中的一个上位体系模式因此，家蚕的性别决定机制研究将有助于理解无脊推动物 复杂的性别决定机制。同时，在基础生物学中研究家蚕的性别决定和性别表达能更有效地获 得生物学研究的有用材料。近来，已开展了家蚕性别决定的分子遗传学研究1 2 0 j 。 1 2 1 家蚕| 生别决定分子机制的研究 经典遗传学的研究表明，家蚕的性别调控是通过w 染色体上的f e r n 基因来控制性别模式 4 性染色体在形态大小、染色体及减数分裂配对中的行为等方面往往与常染色体有所不同， 这些特征常为人们鉴别和研究性染色体所利用。对于家蚕性染色体的研究，一直是家蚕遗传 学和细胞学的热点之一。人们通过对卵母细胞粗线期染色体染色粒分布、卵母细胞联会复台 体、染色体分带、y 转座系统等的研究，探讨了家蚕性染色体的结构特点及形态特征等问题。 家蚕性染色体的研究首先是田中1 9 1 3 年发现家蚕的遗传交换与果蝇相反，只笈生在雄性 而不见于雌性。s l a u t e v a n t 根据此种现象提出雄蚕为同配性别，雌蚕为异配性别。1 9 1 6 年田中 发现伴性油蚕，并从遗传实验上证明了家蚕性染色体雌为异配型，雄为同配型。1 9 2 8 年川口 发现家蚕卵母细胞染色体也为2 8 与雄性相同且较精母细胞染色体长。根据以上遗传学及细 胞学两方面的研究遂确认家蚕性染色体为z w 型的生物z 染色体较长，w 染色体较短。桥 本认为在w 染色体上有强雌性决定基因有w 染色体印为雌性。田岛用x 射线照射使z 染 色体产生不同部位的缺失与重复，表明z 染色体对雌雄性特征无影响，但z 染色体任何区段 的缺失均可造成雌性死亡，说明z 染色体对生活力有很大影响【2 2 1 田岛等成功地诱导出了各种突变染色体。其中主要是有关w 染色体的易位，最终得到了 几种限性遗传标记。例如限性黑色蚕p b 、限性赛白斑p 、限性虎斑彳、限性第2 白卵+ w 2 、 限性黄血y 。用x 射线照射w 染色体，会使其缺失雕性化决定基冈区域。到目前为止，由田 岛预测的雌性化基因， 唧还没有被成功地克隆出来。h i r o k a w a 发现间性体是由w 染色体控制 的，并推测间性体基因是雌性化基因f e r n 的等位基因虽然w 染色体的雌性决定作用己研究 的相当清楚，但在显微镜下还很难识别出w 染色体在其他鳞翅曰种属中，w 染色体己得到 了细胞学鉴定。但还没有找到家蚕的w 染色体与家蚕的其他染色体明显相区别的形态特征。 近年来，利j 分子生物学手段研究蚕性染色体的工作取得进展。a b e 等( 1 9 9 5 ) 用r a p d 的方法，以u b c - 2 1 8 为弓i 物在中1 3 7 号的雌得到一条特异片段f e m a k - 2 1 8 r a p d ，而在雄中 却不出现因此认为f e m a l e 2 1 8 r a p d 片段来自于中1 3 7 号的w 染色体。然后又以大造d n a 作模板，以l i b c 2 1 8 为引物，结果在大造的雌中不出现，因此说明该雌特异片段来自于雌性 决定基因的可能性很小。此后大林富美对f e m a l e - 2 1 8r a p d 片段进行了碱基序列分析，并根 据其序列设计了两种能使f e m a l e 2 1 8r a p d 特异地扩增的引物w - 1 和w - 2 。以三个具有相同 w 染色体来源的近等位基因系为材料，用w - 1 和w - 2 为引物结果庄三个系统的雌中部能扩 出来，而雄性中没有。说明f e m a l e - 2 1 8r a p d 是来自于w 染色体，但并不是来自雌性决定基 因口习。 自a b e 等利用r a p d 技术找到个与w 染色体连锁的r a p d 标记以来，已先后发现了 f e m a l e 2 1 8 、w - k a b u k i 、w - k a m i k a z e 和w - s a m u r a i 等4 个与家蚕w 染色体有关的r a p d 分 子标记以及1 个与野蚕w 染色体有关的w - y a m a t o 标记【卅。对其中- 盘分标记的碱基序列进行 了分析，发现有大小相重替的两类转座子存在并以此两类转座子( k a b u k i ，y o k o z u n a ) 序列为 两南太学硕士学何论文 探针，利用荧光原位分子杂交技术对家蚕w 染色体进行了细胞学鉴定。 尽管有2 0 0 多个可见的突变已经定位到家蚕连锁图上，但是剑目前为止还没有一个形态性 状基因被定位到w 染色体上，而z 染色体上已定位了许多个形态形状基因，现有的家蚕z 染色 体连锁图已包含1 5 个形态性状它们包含大量重要的经济性状如晚熟( 影响化性、眠性) 、 数母性状如全茧鼍和茧层萤础i 。此外，z 染色体上具有控制在卵、幼虫及蚕蛾中表达的各种表 型性状基因如大卵、绿卵壳色等。1 9 9 8 年y a s u k o c h i 鉴定了1 8 个z 连锁的r a p d 标记l 硎。研究 发现家蚕z 染色体上的重复元件是常染色体的2 倍，这和哺乳动物和果蝇的x 染色体相似，这些 元件与x 染色体的失活和剂量补偿相关。由于家蚕中缺乏剂量补偿因此这一结果还需要进一 步的分析。 w 染色体的特征与z 染色体非常不同，染色体主要由许多长末端重复序列，非长末端反转 录转座子、反转录转座子、d n a 转座子以及它们的衍生物组成【2 7 1 。封目前为止，已鉴定的来 源于w 染色体的序列9 0 以上由反转录转座子组成。相比之下，z 染色体中。一个3 2 0 k b 的序列 中只有1 5 4 的重复元件1 2 ”。这一结果表明w 染色体的大部分序列是高度退化了的。 1 2 - 2 与果蝇性别决定基因同源的家蚕基因 在家蚕中已经发现了许多果蝇性别决定基因的同源体基因。n i i m i 等从家蚕胚胎克隆了果 蝇性别决定的主开关基因聃f 的嗣源体b m s x l ，获得了b m s x l 基因的两种m r n a 形式，长度分 别为1 5 2 8 b p 和1 3 3 9 b p ，分别命名为b m s x l - l 和b m s x l - s 。b m - s x i - l 由8 个外显子组成，在 基因组上的长度超过为2 0 k b ，编码3 3 6 个氨基酸的蛋白。b m - s x i - s 缺少第2 外显子，编码2 9 0 个氮基酸的蚩白，连锁群定位表明b m s x l 位于第1 6 连锁群 9 - 3 0 1 。在非果蝇的直翅目昆虫 ( c h r y s o m y a ，m e g a s e l i a ，m u s c a 和c e r a t i t i s ) 中也发现了s x l 的同源体基因。虽然，他们是非常 保守的，但他们是独立于性别而表达的弘埘。周此现有的研究表明，除果蝇外，蹦的同源体 基因似乎与性别无关。 果蝇的另一个性别挟定基因是i r a 。在果蝇的几个种属中存在着t r a 的同源体基因，其编 码区域的进化多样性己达到了相当高的程度。相比之下。t r a - 2 似乎是高度保守的。然而，t r a - 2 同源体基因是否调节各种生物的性别尚不清楚。在家蚕中未找到t r a 的同源体基因，但已在家 蚕e s t 数据库中找到了i r a 一2 同源体基因其氢基酸序列与果蝇i r a 一2 氨基酸序列高度保守。但 在家蚕d s x 前体m r n a 序列上并没有找到t r a - 2 的结合位点，园此不知道它是否与家蚕的性别有 关i 州。此外在家蚕的e s t 及基因组数据库中还找到了以下同源体基因；d a ，g r o 删c ，s i s b ， 批m ，f r u , 如n ，s x l ，m s l 3 r o o f , r o l e ，d o a , s n f , v i r 积2 ) d 一哪1 w a - l d s f , d s x ，i x , o v o ，o t u f 啪 d s x 的同源体基因也存在于其它后生动物中，并且大多数d s x 同源体基因梭认为在生物体中 调节性别分化o ”。 运用e s t 数据库，在家蚕中找到了d s x 基因的同源体基因b m d s x 。b m d 3 x 在家蚕的基因组中 为单拷贝位于2 5 连锁群。实验证明，像果蝇的d s x 基因在雌雄中有不同的加工方式一样，b m d s x 6 第一章文献综述 的初级转录物在雌和雄中通过选择性拼接产生性别特异性成熟m r n a ，编码雄特异性( b m 出x m ) 和雌特异性( b m d d s x f ) 蛋白，雄特异的c d n a 缺乏雌特异c d n a 中7 1 6 - 9 3 1 这一段序列。b m d s x 基因的o i 【跑古5 个外显子，外显子三和四在雄性中被拼接掉p ”虽然，西撕h 基因的实际表 达水平，在生殖腺和信息素腺中高于其他绲织，但砌矗瞵基因r f l r n a 在家蚕幼虫、蛹，成虫的 各种组织中，是进行性别特异性表达的。 果蝇d s x 基因的雄特异性剪接发生在剪接欠缺时，两个剪接激活因子t r a 和t r a 一2 对雌特异 性剪接是必需的。然而，b m d s x , 希l d s x 的性别特异性加工的调节机制非常不同：( 1 坶m d s x 基因的 雌特异性拼接受体位点并不弱；( 2 ) t r a t r a - 2 的结台序列在b m d s x 的基因纽序列中并不存 在；( 舢晰威群前体m r n a 默认的拼接方式为雌特异性的p “在眺中默认的拼接方式保留了 所有的丹显子。医此在雄性中，雌性拼接方式中的第三和第四外显子的攒接必需被抑制才能 产生雄特异性的n 1 r n a 最可能的机制是一十拼接抑制冈子结合到一段特异的序列上抑制了雌 特异性拼接位点的使用，使第二外显子的5 1 拼接供体位点连接到编码雄特异性多肽的外显子的 3 饼接位点上。 与果蝇d s x 基因相似，雌性或雄性家蚕的b m d s x 基因c d n a 编码相同的氨基端区域和性 别特异性的羧基端区域。其中。共有区域包含着d n a 结合功能域( d m 区域) ，b m d s x 的d m 区域与果蝇的妞的d m 区域有8 0 的相似性。如的其他功能区域。如o d 2 区域在家蚕和 果蝇间也是非常保守的。在果蝇中，o d 2 功能域推测参与d s x 蛋白与转录机制作用的性别特 异性，或者有助于当蛋白与多个调节位点结合时的协调性。o d 2 功能域被一个雌特异性内含 子分成非性别依赖性区域和性别依赖性区域b m d s x 基因中的情况与此相一致。对果蝇而言， o d 2 区域是越吖的寡聚化所必需的。当蛋白质结合到所调控的靶d n a 位点时o i ) 2 区域促进 d 姘与d n a 结合的协调性。因此，砌缸也可能通过寡聚化结合到靶d n a 上。 性别决定基圈的最终表型是形态、生理和行为特征的二态性，然而对于性别决定基因产 物的目标基因仍然不是很清楚。在果蝇中仅仅知道d s x 蛋白直接调节印却，y p 2 ，删基因 的转录，但是y p 基因并不是出x 唯一的靶标，因为d s x 突变不仅影响卵巢发生而且影响性行为 和依赖丁：性别的角质层碳水化台物的形成。 研究表明，家蚕砌d 置z 基因和果蝇d s x 基困一样调节性别分化。雄性中的b m d s x f 诱导卵黄 原蛋白和s p l 基因的表达，抑审| p b p 基周的表达i a g 。卵黄原蛋白、贮藏蛋i ! i s p l 、信息素结合蛋 白在雌雄中是性别特异性表达的卵黄蛋白原由雌性个体的脂肪体细胞在幼虫到蛹的蜕皮时 期合成并释放到血淋巴中。卵黄蛋白原的合成以雌特异性方式在转录水平进行调控。$ p 1 是血 浆蛋白的一种，在家蚕幼虫血淋巴中以雌特异方式进行积累。在脂肪体中，s p l 的表达调控在 转录水平以雌特异性方式进行。p b p 主要在雄性触角中表达，并定位于信息索敏感的感觉器中。 p b p 将南雌性释放的性引诱信息素传递给神经细胞上的膜结合受体。b m d s x 蛋白结台到卵黄蛋 白原启动子上结合的d n a 序列与果蝇中卵黄蛋白基因启动子的d s x 结合位点相似，b m d s x f 和 7 两南大学硕十学侍论文 b m d s x m 都能结合剑卵黄蛋白原启动子上。由于b m d s x f 和b m d s x m 具有共同的前2 1 5 个氨基 酸，但是具有不同的c 末端，可与2 1 5 个氨基酸的区域介导序列特异性结台，因为共同区域与 果蝇的d n a 结合功能域具有很高的尉源性，而雌性中的转录激活和雄性中的抑制似乎是由c 末 端的不同引起。因此，b m d s x f 和b m d s x m 在卵黄蛋白原基囡的表达中起着相反的作用。 近年来从家蚕基田组序列分析找到了一序列果蝇性别决定基因在家蚕中的同源墓冈，特 别是现有研究证明：与果蝇d s x 基因一样，b n , u 矗x 基因在家蚕性别决定级联中也是处于末端的 取开关基田。虽然，家蚕的性别由w 染色体强雌性决定因子控制但雌性化基目4 ，确的存在仅 仅处于推测阶段，还没有得到证实w 染色体通过对砌姗的性别特异性剪接和b m d s x 蛋白的 调控，实现最终的性别特异性基因表达，但对砌出r 基因的具体调控机理还有待f 进一步的研 究。 家蚕的性别决定机制的研究还处于初始阶段，对家蚕性别调控主干上的基因，尤其是 且妇以上的性别决定基因还有待进一步解明，以果蝇的性别调控途径为模式，必将推动家蚕 性别决定机制的研究，将家蚕和果蝇性别调控途径的比较如图11 所示。 x 2 1 斛鹂m c 机出- 一刎 l 婚“2 脚j 膏p d 轼l 升h il 神经夏绕体蛔膪性 性别分化最盼化 挣了i 黼 轱录量加倍 l 生殖蛔牖香埕 管 蛙别分化 塞叠 w 船色体 i ? 自 图i 1 家蚕性别决定机制与果蝇性别决定机制的比较r 仿s h i m a d a ) f i 9 1 1c o