（动物学专业论文）纤毛虫瘦尾虫细胞的直接荧光标记及扫描电镜观察.pdf

2 01 1m a s t e rd i s s e r t a t i o n 掣l ! ! ；| i 攀心粤f 粤i 型岈i s c h 0 0 1c o d e ：10 2 6 9 s t u d e n tn o ：5 1 0 8 1 3 0 0 0 3 6 e a s tc h i n an o m a l u n i v e r s i t y d i r e c tn u o r e s c e n t1 a b e l i n ga n do b s e r v a t i o nw i t h s c a n 血n ge l e c t r o n i cm i c r o s c o p yo f z 印砒ss p ( h y p o t r i c h i a ，c i l i o p k o a ) d e p a 叶m e n t ： m a j o r ： s c h 0 0 io fl i f es c i e n c e t u t o r ： m a y ，2 0 1o n 华东师范大学学位论文原创性声明 郑重声明：本人呈交的学位论文一种瘦尾虫细胞皮层及微管类细胞骨架的研究， 是在华东师范大学攻读毽孟博士( 请勾选) 学位期间，在导师的指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或 撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说 明并表示谢意。 作者签名： 日期：山“年f 月日 华东师范大学学位论文著作权使用声明 一种瘦尾虫细胞皮层及微管类细胞骨架的研究系本人在华东师范大学攻读学位 期间在导师指导下完成的砚壬博士( 请勾选) 学位论文，本论文的研究成果归华东师范 、 大学所有。本人同意华东师范大学根据相关规定保留和使用此学位论文，并向主管部门 和相关机构如国家图书馆、中信所和“知网”送交学位论文的印刷版和电子版；允许学 位论文进入华东师范大学图书馆及数据库被查阅、借阅；同意学校将学位论文加入全国 博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和摘要汇编出版，采 用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于( 请勾选) ( ) 1 经华东师范大学相关部门审查核定的“内部 或“涉密 学位论文宰， 于年月日解密，解密后适用上述授权。 ( ) 2 导师签 i l l 本人签名 山1 1 年臼a 日 余齐耀硕士学位论文答辩委员会成员名单 姓名职称单位备注 李利珍教授上海师范大学主席 中国农科院上海 黄兵研究员委员 兽医研究所 倪兵副教授华东师范大学委员 i v 摘要 纤毛虫瘦尾虫细胞的直接荧光标记及扫描电镜观察 专业：动物学 研究方向：细胞与分子生物学 导师：顾福康教授 摘要 在原生动物纤毛虫中，腹毛目无疑是其中最为进化、最复杂的类群。其细胞分化形 成含有多种结构成分的皮层，对其皮层尤其是对其微管胞器、微管类细胞骨架的研究成 为当前细胞生物学领域的热点之一。微管胞器及其附属微管具有相对的种属特异性和种 属稳定性，因此对其进行深入的研究有利于更好的揭示原生动物纤毛虫种属之间的进化 关系，并对于研究真核细胞的调控模式、细胞多样性也有重要的意义。 瘦尾虫的系统发生地位一直以来都存在着巨大的争议，多种现代分子生物学实验技 术的引入使其分类地位更加趋于复杂。本文以一种腹毛目纤毛虫瘦尾虫( - 7 印u ss p ：) 为实验材料，应用直接荧光标记术、扫描电镜术对其微管胞器及微管类细胞骨架进行了 深入的探讨，揭示了其微管骨架的组成、定位、定向，所得结果还对阐明纤毛虫形态的 特殊性及结构的多样性提供了基础资料，也为瘦尾虫的分类及其系统学的研究提供了具 有参考价值的依据。所得结果报告如下： 1 瘦尾虫细胞皮层表面结构的扫描电镜观察 应用扫描电镜术显示，瘦尾虫身体呈流线性，长约1 6 0 一1 8 0 i lm ，宽约3 0 pm ，背腹扁 平，具有典型细长的尾部。其皮层纤毛器由口围带、波动膜、额腹横棘毛、左右缘棘毛、 背触毛等纤毛器组成。口围带呈问号形，位于虫体左侧近前端，约占虫体长度的1 5 。 波动膜2 片，包括1 片口内膜、1 片口侧膜，两片波动膜起始于口围带基部，平行排列 于口围带左侧。波动膜右侧存在2 根口棘毛。额棘毛3 根，分化明显，呈线状排列于虫 体的前端。中腹棘毛两列，右侧棘毛列明显大于左侧棘毛列，棘毛间呈典型的“z i g z a g ” 形排列，起始于波动膜外侧中部，延伸到体后部。左、右缘棘毛各一列，各自位于腹部 摘要 左、右边缘；其中左缘棘毛起列始于口围带左侧中部，右缘棘毛列起始于中腹棘毛列第 二个棘毛外侧，两列棘毛在虫体前端平行排列，在体后部随着窄缩的尾部逐渐会合。横 棘毛列不明显，约由四根横棘毛略呈对号形排列组成。尾棘毛( c a u d a lc i r r i ，c c ) 不 易辨别、不明显。背触毛多于5 列。 本文针对这种形态较为细长、容易变形的纤毛虫的扫描电镜样品制备，提出了相应 的改进措施，这对其他类似的纤毛虫扫描电镜样品制备有重要的参考意义。 2 瘦尾虫皮层纤毛器微管的直接荧光标记 应用f l u t a x 直接荧光标记，在瘦尾虫腹部纤毛器基部均存在着定向各异、发达程 度不一的前纵纤维束、后纵纤维束、横微管束等微管类细胞骨架结构。口围带波动膜基 部含小膜托架、附属微管和波动膜骨架；额腹横棘毛基部存在前纵微管束、后纵微管束、 横微管束；左右缘棘毛基部存在前纵纤维束、后纵纤维束、横微管束。瘦尾虫纤毛器微 管是以微管蛋白为主要组分建构的，同时这些纤毛器微管的发达程度可能是与系统发育 地位是有一定联系的。因此，作为纤毛下器的重要组成部分，瘦尾虫皮层纤毛器微管对 于进一步了解其起源、进化、分类地位以及对揭示纤毛虫系统发生的多样性、纤毛虫的 多起源以及真核细胞调控机制等均有重要意义。 关键词：纤毛虫，瘦尾虫，皮层，细胞骨架，直接荧光标记，扫描电镜术 a b s t r a c t d i r e c tn u o r e s c e n tl a b e l i n ga n do b s e r v a t i o nw i t h s c 甜m i n ge l e c t r o n i cm i c r o s c o p yo f 矾叼碹p 砒ss p ( h y p o t r i c h i a ，c i l i o p h r o a ) m a j o r ： z o o l o g y s p e c i a l i t y ： c e l l u l a ra n dm 0 1 e c u l a rb i o l o g y t u t o r ：p r o f f u k a n gg u a b s t r a c t h y p o t r i c h o u sc i l i a t e sa r e1 l i l d o u b t e d l yt h em o s tc o m p l i c a t e da n dc c r t a j n l y 吐l em o s te v 0 1 v e d 伊o u p 锄o n gs om a n yc i l ia t i 甜p r o t o z o a t h ec e l l sc o n t a i nav a r i e t yo fs t r i l c t i l r a jc o m p o n e i l t s f 0 珊i n g 也ec o r t e x ，a i l ds t u d i e s0 nt l l e c o r t e xe s p e c i a l l ym em i c r o 讪u l a ro r g 锄e l l e sa n d m i 啪劬u l a rc 如s k e l e t o ni ni th a sb e c o m eo n eo fm eh o t t e s ts p o ti n c e l lb i o l o 醪w i 吐1n l e r e l a t i v es p e c i e s s p e c i f i cs 位她l i t y ，m i c r o t l l b u l a ro r g a n e l l e sa l l di t s 嬲s o c i a t e dm i c r 0 劬u l e sh a s c o n t r i b u 硼t oab e t t e rl l n d e r s t a l l d i n go nt h ep r o t o z o 趾c i l i a t e e v 0 1 u t i o n a 巧r e l a t i o n s l l i p b 鲍v e e i ls p e c i e sa i l dm a d et h er e s e a r c ho nt l l er e g u l a t i o nm o d e lo fe u k 明归t i cc e l la n dc e l l d i v e r s 埘g o o ds e n s e a sw e l l a saf 弧c i n 弛gc i l i a t e ，t h ep h y l o g e n i cs t a t u so ft l l eu r o l 印t u sc i l i a t eh a l s a l w a y sb e e na h u g ec o n 们v e r s y 雒dm ei n 臼d d u c t i o no fav 撕e t yo fm o d e n l b i 0 1 0 9 ye x p 嘶m e n t a l t e c h n o l o g ym a k e s 也ec o n 仃0 v e r s ym o r e c 0 忸p l i c a t e d i l l 也i s s t u d y ， t h em i c r o t l l b u l a r o r g a i l e l l e s 觚dm i c r o t i l b u l a rc y t o s k e l e t o ni 1 1 也ec 0 r t e xw e r ed i s c u s s e db yu s i n gd i r e c t f l u o r e s c tl a b e l i n ga n ds c a i l n i l l ge l e c 廿0 n i cm i c r o s c o p y a n dt h er e s u l tc 锄p r o v i d em e i n f o m a t i o no ft l l ec o n s t m c t i o nc h a r 拟e r i s t i c so fm i c r o t u b u l a r o r g 锄e l l e s a n do t l l e r c h a r a c t 舐s t i c ss u c ha si t so r g ；m i z a t i o n ，i t sl o c a t i o ni t s 嘶e l l 伽o n t h er e s u l ta l s oi l l u s 昀t c d t h es p e c i 6 cc h a r a c t 舐s t i co fn l em 唧h o l o g ) ，0 ft l l ec i l i a t e s 勰dp r 0 讥d e dm a n yb a s i c i n f o n n a t i o na ：b o u tt 1 1 ed i v e r s i t yo ft b es 仇l c t u r eo ft l l ec i l i a t e s t h er e s u l tc 卸p r o 访d e 舯t e a b s t r a c t u s e 剐v a l u ea ：b o u t 也ec l a s s 淮c a t i o n 勰ds y s t 锄撕cs t l l d yo fu r o l 印t l l sc i l i a t e s 1 1 1 ef e s u l t s 盯e a sf o l l o w s ： 10 l b s e 撕o no f 也ec o r t e x 跚r f a c ei n 也e “加卸觚c i l i a t ew i t hs c 卸n i n ge l e c t r o n i c m l c r o s c o p y t h ec o r t e xg i l r f 犯ei n t l l e “阳厶甲n 岱 c i l i a t ew a u s a 1 1 a 1 ) ，z e dw i ms c a 加血g e l e c 仃0 i l i c m i 啪s c o p y t h e “，d 卸f 娜c i l i a t ei s1 6 0 1 8 0 岫i 1 11 e n g 吐l 趾d3 0 岬i n 谢d 也，砌c hh a sa b o d yw i 也哳e 锄l i n es h a p ea n dad i 妣改l o n g t a i l i t sv e 廊a 1s i d ei sf l a ta n di t sd o r s a ls i d ei s d i s t i n c t l yv a u l t e d t h ec o r t e xc i l i a t l 玳o f 也e “加厶印如岱c i l i a t ec o n s i s t so fa d o r a lz o n eo f m e m b r 觚e l l e s ( a z m ) ，u n d u l a t i n gm e m b 啪e s ( u m ) ，舶n t v e n 订a l - 缸锄s v e r s ec 埘( f v t c ) ，1 e r a n dr i g h tm 嘲画n a lc i i t i ( l a n d i 己m c ) ，d o 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i n g t h em i c r o 劬u l a ro r g a i l e l l e s 勰dm i c r o t l l b u l a rc y t o s k e l e t o ni n “，d 五印f 淞s p w e r er e v e a l e d b yd i r e c tn u o r e s c 即tla ：b e l i n go ff i ，1 兀a x t h er e 叭l t ss h o w e dt h a tt l l eo r g a i l e l l e sc o n s i s to f i i a b s t r a c t a d o r a lz o n e0 fm 锄b r ：m e l l e s ( a z m ) ，u n d u l a 血gm 锄b r 锄e s ( u m ) ，舶n t v e n 缸面一心a i l s v e r s e c h t i ( f v t c ) ，l e ra l l dr i 曲tm 鹕i i l a lc 埘( l - 锄d l u 订c ) ，d o r s a lk i n 舐e s ( p k ) b c n e a _ t l lt l l e 咖也e r ee x i s t sm i c r o 劬u l a rc y t 0 s k e l e t o no fd i 髓嗍td e v e l o p e d 孤dd i 仟e r 饥to n e i l 谢o n t h em i c r o b u b u l a rc ”o s k e l e t o no fa z mc o m p r i s e sm e m b r a n e l l eb r a c k e t sa n di t s 舔s o c i a t e d m i c r o t l m u l e s ；也eb a s ea u s s o c i a t e dm i c r o t l l b u l e sc o n s i s to fa n t 甜o rl o n 百t u d i n a lm i c r o t l 小u l e s ( a l m ) ，p o s t 舐0 rl o n g i t u d i n a lm i c 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第三章瘦尾虫皮层纤毛器微管的直接荧光标记3 4 1 材料和方法3 5 1 1 材料3 5 1 2 实验试剂及配制方法3 5 1 3 主要仪器设备3 6 1 4 直接荧光标记样品制备3 7 2 实验结果3 7 2 1 细胞及皮层纤毛器3 7 2 2 核器3 8 3 讨论z 1 0 3 1 直接荧光标记术的改进4 0 3 2 瘦尾虫皮层纤毛器微管的建构特征4 0 3 3 对细胞核标记结果的分析4 1 参考文献：一4 3 图版及说明一4 5 附 录4 5 致谢5l 华东师范大学硕士学位论文 第一章研究综述：纤毛虫皮层细胞骨架的研究方法以及瘦尾虫的 研究进展 摘要：原生动物是自然界中一个很重要的类群，因其个体微小、培养简单、繁殖快速等 优点，长期受到生物学各个不同领域学者的关注。因其原始性，原生动物发展出皮层和 表膜以司运动，发展出鞭毛和纤毛以司运动和摄食。作为原生动物进化序列最高的类群， 纤毛虫特别是腹毛目纤毛虫中，存在着发达的微管骨架，在细胞内起着包括支持在内的 很多非常重要的功能，对其的研究对揭示真核细胞的结构与功能、起源与进化等都具有 非常重要的作用。本章拟从显微水平、亚显微水平、分子水平三个不同层次对研究纤毛 _ 虫细胞微管骨架的多种技术手段进行了相关的探讨。本章的第二个方面对存在着巨大争 议的瘦尾虫的分类地位等进行了详细的叙述。 关键词：原生动物纤毛虫、瘦尾虫、皮层、细胞骨架、研究方法 1 原生动物皮层形态及细胞骨架方法的研究 1 1 原生动物的表膜、皮层和细胞骨架 原生动物( p r o t o z o a ) 是一大类具有或无明确亲缘关系的单细胞“低等动物”的泛 称或集合名刮。因其个体微小、培养简单、繁殖快速等诸多优点，一直受到不同领域 的生物科学工作者的关注并将其作为遗传学、细胞生物学、生物化学、医学等领域的理 想的研究材料【2 l 。作为单细胞真核生物，原生动物细胞具有和大多数高等生物细胞相同 的细胞结构( 细胞膜、细胞质、细胞核等) 、细胞器( 如线粒体、核糖体等) ；但是因其 原始性，又与大绝大多数高等生物通过细胞分裂和细胞分化形成组织、器官、系统等不 同的生命层次实现机体生理功能的分工和整合不同，原生动物是单细胞生物，一个细胞 就是一个生物体，因此原生动物通过细胞内局部区域的分化、特化形成一些小的结构来 完成各项生理功能，如发展出表膜和皮层以司保护、发展鞭毛和纤毛以司运动和摄食。 可见，作为细胞来讲，原生动物细胞无疑是最复杂和最高等的细胞，它们在形态结构和 1 华东师范大学硕士学位论文 生理特性方面均表现出极大的多样性。 原生动物的细胞质总是通过一层或者几层膜结构与外界环境隔离开来，这一层或几 层结构就是表膜2 1 。由于类群多样，原生动物的表膜也具有高度多样性。裸变形虫类的 表膜比较简单，仅仅由一层封闭的单位膜构成；某些眼虫的表膜则发生了进一步折叠和 卷曲，形成2 3 层单位膜组成的膜结构，并在细胞的表面形成很多有规律的沟和脊；在 锥体虫、利什曼等寄生性原虫中，在表膜下存在着许多以不同方式连接在一起形成的纤 维层；许多原生动物都具有体表纹络、纤维系统，而纤毛虫在本门的进化序列中最为高 等，表膜也发生了进一步明显的分化，一般由典型的质膜、表膜泡等结构组成，并且表 膜与皮层结构紧密联系在一起，与纤毛、表膜下纤毛系统以及刺丝泡等组合成一个整体， 行使复杂的功能【2 1 。 皮层指原生动物特别是纤毛虫特化的细胞表层结构，大多数纤毛虫的皮层结构非常 复杂，从广义上讲上述的表膜和纤毛、表膜下纤维系统只是皮层的一部分。其中纤毛的 排列、分布形成的皮层模式是具有相对稳定性和种属特异性的，和细胞膜、表膜泡、微 丝和微管、皮层色素颗粒等胞器结构一样，可以为分类学研究提供重要的依据。皮层中 的微管成分形成的网络系统在支持、保护方面原生动物方面起着很重要的作用。 原生动物细胞内外的类骨骼成维持了原生动物细胞的特定形态。广义上的细胞骨架 包括细胞细胞膜骨架、细胞质骨架、细胞核骨架和细胞外基质【3 。这类骨骼成分地包括 细胞膜、液泡、成束或者成簇的微丝或微管【4 】。在放射虫和有孔虫中，这类类骨骼成分 构成铠甲和壳室，在细胞外起着定型和保护的作用，而在纤毛虫特别是腹毛类纤毛虫中， 存在在发达的微管骨架，在细胞内起着重要的作用，对其的研究对于揭示真核细胞的结构 与功能等具有重要的理论意义。 1 2 原生动物纤毛虫细胞骨架的研究方法 原生动物纤毛虫是一类结构十分复杂的单细胞生物，不同类群的纤毛虫其细胞外层 均含有纤毛及以纤毛为主要成分的微管骨架系统，它不仅使细胞行使运动、摄食等多种 生理功能，并使细胞呈现多种多样的形态学特征。在纤毛虫中，膜口类纤毛虫如草履虫 ( 砌阳m e c f “聊) 细胞表面布满由微管构成的纤毛，腹毛类纤毛虫如尾柱虫( 趵砌) 、 游仆虫( e 印f d 泐) 等细胞表面纤毛则按不同方式聚集形成口纤毛器、体纤毛器，并在 这些细胞器基部形成复杂的微管系统。目前，对纤毛虫细胞微管类骨架研究已经成为所 2 华东师范大学硕士学位论文 在领域研究的热点，也受到其他生命科学工作者的关注。 原生动物整个身体仅由一个细胞组成，大小介于1 0 1 0 0 l lm 之间，大部分只有借助 于显微镜才能观察到。少数纤毛虫存在着色素颗粒而使身体呈现颜色，如：伪红色双轴 虫( d f 甜d ，z p 肠芦p “咖删6 朋) 是微红色的；彳，z f 劬d 伽丘如口翮以娩i c j z m m a 以及啪卸铆魑括 c f 绷加是黄色的；另有一些种类纤毛虫如绿尾柱虫( 研琊耖肠订砒加) 、绿草履虫 ( 砌，口m p c i “聊施坶口以口) 由于共生的藻类是绿色的【5 1 。而大多数原生动物同许多高等动 物细胞一样，几乎是透明的，而很多染料由于能被细胞内的特定成分吸收或结合从而使 该成分或结构呈现出一定的颜色，因而要看清楚其结构必须借助于显微镜和根据研究目 的而采用相应特定的染色技术，这也是原生动物学最基本的研究手段之一。 。 近现代显微镜技术包括电镜不断地发生进步和更新，使得对原生动物的研究取得了 巨大的成就。随着d n a 的双螺旋结构的发现标志着现在分子生物学的到来，越来越多 的分子生物学技术被运用到原生动物领域的研究中。一些重要的成就就是在原生动物中 首先发现的，如1 9 8 2 年c e c h 等以原生动物嗜热四膜虫( 乃抛砂m e m 砌g 册叩j i z f 肠) 为 材料，发现一种r r n a 前体l 19 i 矾a 在一定条件下能专一地催化寡聚核苷酸底物的切割 与连接，具有核糖核酸酶活性。目前研究原生动物细胞的方法有很多种，现在仅挑选其 中几种以显微水平、亚显微水平、分子水平三个层次对原生动物纤毛虫的细胞骨架的研 究方法加以简要介绍。 1 2 1 显微水平的研究方法 ( 1 ) 活体观察 活体观察是研究原生动物的一种重要手段。在一些原生动物的研究中，活体观察可 以获得一些诸如伸缩泡、皮层颗粒等其他方法无法获得的生物学特征，因此在原生动物 的研究中仍然有着不可替代的作用。同时，由于技术的进步，除了普通的明视野显微镜， 利用相差、干涉相差、偏振光以及暗视野等特殊显微镜技术，对原生动物进行活体观察， 有助于加深它们生活状态下细胞的表面和内部结构，以及运动、摄食消化、应激性等生 理功能的了解。绝大多数自由生活的原生动物，游动速度很快，给活体观察带来了很大 的困难。因此可应用一些无毒或者低毒的染料对原生动物进行活体染色，实验室常用的 染料有中性红和詹纳斯绿等。如用中性红活体染色，可以观察原生动物体内食物泡的形 成和消化的全过程，詹纳斯绿可以用来活体显示原生动物细胞内的线粒体【。 ( 2 ) 黑色素法 1 华东师范大学硕士学位论文 与其他的染色方法不同，黑色素染色法中，黑色素是作为一种负染色剂来显示鞭毛、 纤毛及其有关结构的。经过原生动物工作者的不断改进，以黑色素作染色剂的染色方法 发展出很多种，较为理想的如b o 盯o r 氏黑色素升汞一福尔马林复染法。这种方法操作十 分简单，但是显示的结构不是十分细致，适用于原生动物的初步分类鉴定。黑色素主要 用以显示细胞表面纤毛器( 纤毛部分而非毛基体) ，此方法特别适用于腹毛类纤毛虫【1 1 。 孚尔根反应特异性检测d n a ，因而可用于有选择性地显示原生动物的核器( 如纤毛虫独 特的双型核：司营养多样体的大核和司繁殖的二倍体小核) 。国内史新柏等针对纤毛虫 和鞭毛虫应用此方法进行了很大的改进，并取得了较好的效果6 1 。而这通常是在其他染 色效果达不到的情况下进行的，因此一般较少使用。 ( 3 ) 银浸法 银浸法又称湿银法或c h a 仕o n l w o 行法【7 】，经c o r l i s s ( 1 9 5 3 ) 【8 1 介绍并经过不断改进 后而被广泛应用于纤毛虫银线系的研究。银浸法主要用以揭示纤毛虫的表面纤毛图式以 及银线系。这种方法对大多数种类具有良好的染色效果。由于缺乏银线系，此法不能用 于棘尾虫( 劬如砂幽妇) 以及尖毛虫( 叻历c 砌) 等属的纤毛虫，也不能用于显示腹毛 类的棘毛，对纤毛虫口器等深部结构也没有很好的显示作用【9 10 1 ，因此在实际应用中受 到很大的局限。 ( 4 ) 干银法 此法收奥地利人e i n 发明，可以显示纤毛虫的纤毛图式以及虫体皮层的银线系和 网格。引种方法在应用过程中，针对虫体的处理和操作是在干的载玻片上进行的，因此 只有一些小型种或表膜表膜坚硬的纤毛虫比较适合使用这种方法，如盾纤类、膜口类纤 毛虫( 如革履虫等) 、肾形类、管口类、缘毛类及游仆虫等；对较脆弱的尖毛虫以及身 体非常柔软的尾柱虫类群则不太适用；对缺乏银线系的纤毛虫也不太适用。宋微波、王 梅使用这种方法并改良对纤毛虫银线系进行染色，对这种方法应用过程中提出了很多有 意义的建议【l l 】。 ( 5 ) 蛋白银法 蛋白银法是当今研究纤毛虫纤毛图式、形态发生最基本也是最重要的形态学技术手 段。蛋白银染色法原本是一种生物组织染色法，由1 9 3 7 年b o d i o n 首创；上个世纪6 0 年代d r a g e s c o 、t u 衢a u 【1 2 、1 3 】等将此方法同其他银染方法应用于纤毛虫的研究领域中， 并将纤毛虫的研究带入纤毛图式时代；国内倪达书应用此技术首先成功地显示纤毛虫的 4 华东师范大学硕士学位论文 结构；史新柏、宋微波、庞延斌等【降1 7 】分别对这种技术手段进行了成功的改进，获得 了有多新的成果并对相应的纤毛虫应用此方法提出了相应的注意事项。此法主要用以显 示虫体的皮层及内部结构，如纤毛下器、毛基体、核器及各种表膜下纤维系统等，而银 线系统则不被显示。此外，蛋白银染色法还在生态学也有较多的应用：1 9 8 7 年m o n 协鲷e s b 彻建立了一种可用于纤毛虫定量研究的蛋白银染色方法【18 1 ，他们发现这种方法可 以消除传统方法在调查水体纤毛虫时不能对纤毛虫准确定种和纤毛虫定性、定量分离的 缺点，1 9 9 4 年s k i b b e 【1 9 】对此方法进行了进一步的改进；国内徐润林、白庆笙【冽针对上 述两人中存在着的耗时长、不易掌握等缺点，进行改良取得了较好的结果。蛋白银染色 法可以获得高质量的永久封片，但是该方法对经验和操作技术较为依赖，需要研究者不 断积累经验以获得对不同种类的合适的方法。 ( 6 ) 荧光标记方法 荧光是指某些物质在紫外线的激发下发出可见光的现象。近年来，荧光标记术被广 泛地运用于原生动物纤毛虫微管类细胞骨架的研究。根据标记方式的不同，可以分为直 接荧光标记和免疫荧光标记。 直接荧光标记方法 利用某些特定的荧光素的特定化学基团和微管发生特异性的共价结合，从而实现对 微管进行精确定位的技术。常见的荧光素有f l u t a x 、f i t c 、罗丹明等。s o u t o ( 1 9 9 5 ) 等发现f l u ( 一种紫杉醇的衍生物) 可以特异性地连接到微管上去【2 l 】，此后针对 f l u t a x 与微管的相互作用及其动力学研究也在不断地深入瞄之4 】；而a 玎e g u i ( 2 0 0 2 ) 【2 5 2 叼等首次将这种方法技术引入到原生动物纤毛虫微管类细胞骨架的研究中并对之进行 改进，他发现这种方法具有简单、快速等诸多优点，对于传统的方法( 如蛋白银法等) 是一种很好的补充，特别是对于纤毛虫的纤毛下器。基于这种技术，也已经出现了许多 有意义的成果，如s h e i l ab l e c k e ( 2 0 0 2 ) 等对研c 矗d m d 万船v 四懈z 西【2 7 】的研究，顾福康 所在实验室针对腹毛目纤毛虫做了很多有意义的工作【2 8 2 9 1 。 免疫荧光标记技术 。 利用荧光素标记的抗体和抗原微管发生特异性结合，从而显示微管及其动态的一种 方法。相比直接荧光标记术，免疫荧光标记术亲和性、特异性更高，基于抗体的特殊结 构也更加具有灵敏性。a 玎e g u i 等( 1 9 9 4 ) 【3 0 】利用b 微管蛋白抗体标记和鞣酸一透射电 镜对e 印z d f 酷力c 口砌i 进行了研究，l i a n g 等( 1 9 9 6 ) 报道了其对八肋游仆虫( e 印肠泐 5 华东师范大学硕士学位论文 d c 幻一，z 口忽岱) y 微管的标记【3 l 】，周素娟、史磊等分别对冠突伪尾柱虫( 风p 砌“聊纱缸 砷纪缸) 、草丛土毛虫( 乃州们如口s 抛m p ，z 红c d 肠) 的细胞微管骨架及其形态发生过程进 - 行了深入的研究盼3 3 1 。 此外，作为一种荧光显微镜，近来发展的激光扫描共聚焦显微术( 1 舔e rs c 锄i n g c