（水产养殖专业论文）黄鳍棘鲷rIL1β生物学活性检测及血清IgM的纯化.pdf

华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 黄鳍棘鲷r i l 1 p 生物学活性检测及血清i g m 的纯化 摘要 本实验室于2 0 0 5 年克隆了黄鳍棘鲷白细胞介素l b ，并将推测的成熟肽基因序 列插入原核表达载体p q e 3 0 ，再转化到大肠杆菌细胞m 1 5 中，构建了原核表达系 统。在此基础上，本研究继续开展黄鳍棘鲷白细胞介索l d 生物学活性方面的研究。 对诱导表达后的重组蛋白采用n i 2 + - c h e l a t i n gs e p h a r o s ef f 层析技术进行了纯 化，并采用梯度透析对纯化蛋白进行复性。结合对插入片段的测序结果以及w e s t e r n b l o t 可以确定，所纯化的重组蛋白即为重组白细胞介素l b ( r e c o m b i n a n ti n t e d e u i d n l p ，r m - l p ) 。经过b a n ds c a n5 0 软件分析，纯化的r l l - l 3 纯度达到9 5 。纯化蛋白 经过离心超滤浓缩后，b r a d f o r d 法测定其浓度为0 1 8 m g m l ；经鲎试剂检测，纯化 蛋白的内毒素含量小于0 9 6 4 酬。 采用p e r c o l l 不连续密度梯度离心分离黄鳍棘鲷头肾白细胞，实验证明，在分离 液密度 0 8 0 9 m l 的界面上富集的细胞中，白细胞超过9 5 。将制备的头肾白细胞 进行原代细胞培养，并用r l l - l p 刺激培养的细胞，2 3 c 培养4 h 后提取细胞的总r n a ， 用r t - p c r 方法检测到，当培养基中r l l - l p 的浓度达到2 0 n g m l 时可以有效提高， l p 基因的转录水平，与5 i i 咖il p s 的刺激效果相当。 + 本研究还分别采用s e p h a r o s e - 6 b 凝胶过滤层析、p h e n y ls e p h a r o s ef f 疏水作用。 层析和r p r o t e i na s e p h a r o s e 亲和层析技术纯化黄鳍棘鲷血清i g m ，并对这三种层析 纯化方法进行了比较。纯化产物进行s d s - p a g e ，电泳结果扫描后经b a n ds c a n 5 0 软件分析显示：单独使用s e p h a r o s e - 6 b 凝胶过滤层析或p h e n y ls e p h a r o s ef f 疏水作 用层析得到的i g m 纯度只有5 6 ；两者联合使用可以达到6 9 ，而r p r o t e i na s e p h a r o s e 亲和层析一步就可以达到8 9 的纯度；纯化得到的黄鳍棘鲷血清i 蛳的 重链和轻链分子量分别为7 3 6 k d a 和2 6 5 k d a 。以r p r o t e i nas e p h a r o s e 亲和层析纯 化的黄鳍棘鲷血清i g m 为抗原，制备其兔的抗血清，经过间接e l i s a 检测，效价 达到1 ：2 5 6 0 0 ，为进一步开展r i l - l l b 的免疫佐剂功能的研究奠定了基础。 关键词：黄鳍棘鲷；重组白细胞介素l b ；活性检测；i # v t ；纯化；问接e l i s a 黄鳐棘鲷r l l - i8 生物学活性检测及血清培m 的纯化 b i o a c t i v i t yt e s t i n go fr e c o m b i n a n ti l - 11 ba n d p u r i f i c a t i o n o fs e r u mi g mi na c a n t h o p a g r u sl a t u s a b s t r a c t i n t e r t e u k i n e - 1 m ，l b ) g c u eo f t h ea c a n t h o p a g r u sl a t u sh a sb e e nc l o n e di no u rl a b t h es e q u e n c e se n c o d i n gp r e d i c t e dm a t u r ep c p t i d ew b - h es u b d o n e di n t oe x p r e s s i o nv e c t o r p q m 0a n ds u b s e q u e n t l yw e r et r a n s f o r m e di n t oec o l im 1 5 t h ef u r t h e rr e s e a r c ho nt h e b i o a e t i v i t yo f i l - 1 1 3i nt h i st h e w sw a s o nt h i sf o u n d a l i o n a f t e rw i gi n d u c e m e n t , t h er e c o m b i n a n tp r o t e i nh a sb e e no b t a i n e di ni n c l u s i o n t h er e c o m b i n a n tp f o 画nw a sp 砌e dw i t i in i 2 + - c h e l a f i n gs e p h a r o s ef fc h r o m a t o g r a p h y a n dt h ew o no fr e c o m b i n a n tp r o t e i nw a f tt h r o u g hg r a d i e n td i a l y s i s t h er e s u l t so f s e q u e n c h 培a n dw e s t e r nb l o tc mp r o v et h a tt h er e c o m b i n a n tp r o t e i ni st h er e c o m b i n a n t i n t e d e u k i nl p ( r i l - 1 1 3 ) t h ep u r i t yo fp u r i f i e dr m - t 1 3r e a c h e d9 5 b yt h ea n a l y s i so f b a n ds c a n 5 0 t h ec o n c e n t r a t i o no fp u r i f i e dr i l - 1 1 3w a sd e t e r m i n e db yb r a d f o r d 3 m e t h o da n dt h er e s u l tw a s0 1 8 m g ，i i l l t a c h y p l e 幡a m e b o c y t et y t ea s s a yi e v e a l e dt h a tt h e e n d o t o x i n c o n t e m i n t h e p u r i f i e dr l l - l l b w a s l e s s t h a n 0 9 6 4 e u m 1 t h eh e a dk i d n e yl e u k e o e y t e so ft h ea c a n t h o p a g r u s 丘时埘w e r ei s o l a t e du s i n ga d i s c o n t i n u o u sd e n s i t yp e r c o l l 蓼a d i e mc c u t r i f u g a t i o n i ts h o w e dt h a tt h ed e n s i t yo f t 0 s o s r i i lw u s u i t a b l ef o r t h ei s o l a t i o no f h e a dk i d n e yl e u k c u e y t e sa n dt h e 牟玳螂吐学o f l e u k c u e y t ec o u l de x c 麓d9 5 t h el e u k e o e y t e sw e r ei n c u b a t e dw i t hr i l - l f la t2 3 f o r4 h o u r sp r i o rt ot o t a lr n a e x t r a e t i o n t h er t - p c rr e v e a l e dt h a tr l l - 1 1 3c o u l du p - r e g u l a t e t h et r a n s c r i p t i o no f l l - l pa t2 0 n s m la n dt h ee f f e c tc o u l db ee q u a lt o5 t t s m ll p s t h es e n l mi g mo f a c a n t h o p a g r u s a l g $ w a sp u r i f i e db ys e p h a r o s e - 6 bg e lf i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h y , p h e n y ls e p h a r o s ef fh y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o nc h r o m a t o g r a p h ya n d r p r o t e i na s e p 胁a f f i n i t yc h o m a t o 掣a p l l 孓t h o s em e t h o d sw e r ec o m p a r e di ns e v e r a l r e s p e c t s t h er e s u l t so fs d s - p a g ew e 佗a n a l y z e db yb a n ds c a n 5 0 t h ea n a l y s i s i n d i c a t e dt h a tt h ep u r i t yo ft h es e r u mi g ma t t a i n e db ys e p h a r o s e - 6 bg e lf i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h yo rp h 伽y ls e p h a r o s e1 7 1 ：h y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o nc h r o m a t o g r a p h yw a s o n l ya b o u t5 6 t a k i n gt h ec o m b i n a t i o no fs e p h a r o s e - 6 bg e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y a n dp h e n y ls e p h a r o s ef fh y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o nc h r o m a t o g r a p h yt h ep u r i t yc o u l d a p p r o a c h6 9 0 6 h o w e v e rt h ei g mc o u l dr e a c hap u r i t yo fa p p r o x i m a t e8 9 j u s tu s i n g r p r o t e i nas e p h a r o s ea f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y a l t h o u g ht h er p r o t e 4 nas e p h a r o s e a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yr e v e a l e dt h ee x c e l l e n tp e r f o r m a n c ec o m p a r i n gw i t ho t h e r m e t h o d si n t h i s r e s e a r c h , t h ee x p e n s i v ep r i c el i m i t e di t sw i d e s p r e a da p p l i c a t i o n 竺奎些查兰丝旦堡主兰垒丝奎 s e p h a r o s e - 6 bg e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h ya n dp h e n y ls e p h a r o s ef fh y d r o p h o b i c i m e r a c t i o nc h r o m a t o g r a p h yc o u l ds u p p l yag o o db a l a n c eb e t w e e n p r i c ea n dp e r f o r m a n c e t h ea n a l y s i sa l s os h o w e dt h a tm o l e c u l a rw e i g h t so ft h eh e a v y - c h a i na n dl i g h t c h a i no f i g mw e r er e s p e c t i v e l y7 3 6k d aa n d2 6 5 k d a t h ei g mp u r i f i e db yr p r o t c i na s e p h a r o s ea f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yw a su s e dt op r e p a r er a b b i ts e l aa n t i - i g m t h ei n d i r e c t e l i s a r e v e a l e dt h a tt h et i t e r so f a n t i s e r ar e a c h e d1 ：2 5 6 0 0 t h e s el a i dt h ef o u n d a t i o no f f x l g t h o tr e s e a r c h e so nt h ea d j u v a n te f f e c to f r i l - l p k e yw o r d s ：a e a n t h o p a g r u s 肠抛r e c o m b i n a n ti n t e r l e u k i nl p ；b i o a c t i v i t yt e s t ；i g m ； p u r i f i c a t i o n ；i n d i r e c te l i s a i n 黄鲭棘鲷r l l - i 口生物学活性检测及血清k m 的纯化 缩略语表 a d r e n o r t i c o t r o p h i nh o r m o n e s a m p i c i l l i n a m m o m u mp e r m l f a t e b a s ep a i r b o v i n es e m ma l b u m i n c o m p l e m e n t a r yd n a c y t o k i n e c o l o n ys t i m u l a t i n gf a c t o r d o u b l ed i s t i l l e d ，砒e f d e t h y lp y r o c a r b o n a t e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h p s p h a t e e t h i d i u mb r o m i d e e 占c h e r i c h i ac o l i e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y e r y t h r o p o i e t i n e n d o t o x i nu n i t f r e u n d sc o m p l e t ea d j u v a n t f i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r f r e u a d si n c o m p l e t ea d j u v a n t g r a m h o u r n _ - l pc o n v e r t i n ge l l z y m e i n t e r f e r o n i m m u n o g l o b u l i n i n t e r l e u k i n i n t e r l e u l d n l 5 i 螂o p y lb - i ) - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e k i l od a l t o n k a n a m y c i n l i p o p o l y s a c c h a r i d e l y m p h o t o x i n i v 肾上腺皮质激素 氨苄青霉素 过硫酸铵 碱基对 牛血清白蛋白 互补d n a 细胞因子 集落刺激因子 双蒸水 焦碳酸二乙酯 脱氧核糖核酸 三磷酸脱氧核( 糖核) 苷 溴化乙锭 大肠杆菌 乙二胺四乙酸 酶联免疫吸附试验 红细胞生成素 内毒素单位 弗氏完全佐剂 成纤维细胞生长因子 弗氏不完全佐剂 克 小时 ，l b 转换酶 干扰素 免疫球蛋白 白细胞介素 白细胞介素l b 异丙基- b d 硫代半乳糖苷 千道尔顿 卡那霉素 脂多糖 淋巴毒素 一挪栅姊姒一儇跚一一一口一一一啪即默髓姒g h譬；研k儿哪一妣：虿鹏 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 m a n n a n - b i n d i n gp r o t e i n 2 - m e r c a p t o e t h a n o l m i l l i g r a m m i n u t e m i l i l i t r e m e s s e n g e rr n a m o l e c u l a rw e i g h t n a t u r a lk i l l e rc e l l o p e nr e a d i n gf l a m e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p y r r o l i d i n ed i t h i o c a r b a m a t e p h o r b o b m y r i s t a t e - a c e t a t e r e t i n o i ca c i d r e c o m b i n a n ti n t e r l e u l d nl p r i b o n u c l e o t i d ea c i d r e v e r q g t r a n s 丽p t i o n - p c r s t e me e l lf a c t o r s o d i u md o d e c y lm l p a t e s e c o n d c = y t o t o x i ctl y m p h o c y t e s n , n , n , n - t e t r a m e t h y le t h y l e n e d i a m i n e t u m o rn e c r o s i sf a c t o r t r i - ( h y d r o x y m e t h y l ) m e t h y l a m i n e m i c r o g r a m m i c r o l i t r e v 甘露糖结合蛋白 2 巯基乙醇 毫克 分钟 毫升 信使r n a 分子量 天然杀伤细胞 开放阅读框 聚合酶链式反应 吡咯烷二硫代氨基甲酸盐 - l o g i f 豆蔻酸佛波醇乙酸酯 维生素a 酸 重组白细胞介素l p 核糖核酸 反转录p c r。， 干细胞生长因子 十二烷基硫酸钠 秒 细胞毒t 细胞 n n n ，n 7 四甲基乙二胺 肿瘤坏死因子 三羟甲基氨基甲烷 微克 微升 。 胞 r c d 御嘴-蓦m一姗呦吣呱一啦从叫眦一；i誊|嫩嘲肿-耋峙m 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 丕 如需保密，解密时间年月 日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材科，指导教师对此进行了审定与我- n - r 作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研牲獬：二陋芡帆硼年川丫日 黼警：孙舨导师张刎7 ：诉褂柳期：“：午日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 第一章文献综述 l 细胞因子与i l 1 概述 1 1 细胞因子的概念及分类 细胞因子( c y t o k i n e , c k ) 是由多种细胞产生的一类非抗体非补体能调节细胞生 长分化，调节免疫功能，参与炎症发生及创伤愈合的激素样( 微量而高效) 可溶性 小分子多肽类物质( 王世若等，2 0 0 1 ) 。对于细胞因子的分类，目前尚无统一的标 准，不过大多根据细胞因子的功能或来源进行分类( 金伯泉，2 0 0 3 ) ： 根据细胞因子主要的功能不同分为； ( 1 ) 白细胞介素( i n t e r t e u k i n , 几) 白细胞介素又称白细胞问素，简称白介素。最初是指由白细胞产生又在白细胞 间发挥作用的细胞因子，后续研究发现该因子可以由淋巴细胞、单核细胞或其它非 单个核细胞产生，在细胞间相互作用、免疫调节、造血以及炎症过程中起重要调节 作用。在1 9 7 9 年第二届淋巴因子国际研讨会上，将介导白细胞间相互作用的一些 细胞因子命名为白细胞介素，并以阿拉伯数字排列，如，l 、i l - 2 、i l - 3 等( 王世 若等，2 0 0 1 ) 。 ( 2 ) 集落刺激因子( c o l o n ys t i m u l a t i n gf a c t o r , c s f ) 集落刺激因子根据不同细胞因子刺激造血干细胞或分化不同阶段的造血细胞 在半固体培养基中形成不同的细胞集落，分别命名为g ( 粒细胞) c s f 、m ( 巨噬 细胞) - c s f 、g m ( 粒细胞、巨噬细胞) c s f 、m u l t i ( 多重) - c s f ( i l - 3 ) 、红细 胞生成素( e r y t h r o p o i e t i n , e p o ) 、干细胞生长因子( s t e mc e l lf a c t o r , s c f ) 等。不同 c s f 不仅可刺激不同发育阶段的造血干细胞和祖细胞增殖和分化，还可促进成熟细 胞的功能。 ( 3 ) 干扰素( i n t e r f e r o n , 玎附) 干扰素是1 9 5 7 年发现的细胞因子，也是最先发现的细胞因子，因其具有干扰 病毒感染和复制的能力故称干扰素。1 9 8 0 年国际干扰素命名委员会对干扰素命名做 了规定，先根据动物来源确定分类系统，再按抗原特异性分型，以a 、1 3 、丫表示， 根据干扰素产生的来源和结构不同，可分为刀f h 、i r n - p 和玎附吖，他们分别由白 细胞、成纤维细胞和活化t 细胞所产生。各种不同的i f n 生物学活性基本相同，具 有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等作用。 ( 4 ) 肿瘤坏死因子( t u m o rn e c r o s i sf a c t o r , t n f ) 肿瘤坏死因子因最初发现这种物质能造成肿瘤组织坏死而得名，根据其产生来 源和结构不同，可分为t n f 吨和t n f p 两类，前者由单核巨噬细胞产生，后者由 活化t 细胞产生，又名淋巴毒素( 1 y m p h o t o x i n , l t ) 。两类t n f 基本的生物学活性 黄鳙棘鲷r l l - ib 生物学活性检测及血清i g m 的纯化 相似，除具有杀伤肿瘤细胞外，还有免疫调节、参与发热和炎症的发生。大剂量t n f - 4 1 可引起恶液质，因而t n f 伍又称恶液质素( c a c h e c t i n ) 。 ( 5 ) 转化生长因子一p 家族( t r a n s f o r m i n gg r o w t h 蠡c 坼bf a m i l y , t g f - pf a m i l y ) 转化生长因子b 家族由多种细胞产生，主要包括t g f - p i ，t g f - j 3 2 、t g f 一1 3 3 、 t g f p l p 2 以及骨形成蛋白( b m p ) 等 ( 6 ) 趋化因子家族( c h e m o l d n ef a m i l y ) 趋化因子家族包括c - x - c a 和c - c p 两个亚族，前者( c x - c a ) 主要趋化中 性粒细胞，主要的成员有i l - 8 、黑素瘤细胞生长刺激活性( g l 旧肿g s a ) 、血小板 因子_ 4 ( p f - 4 ) 、血小板碱性蛋白、蛋白水解来源的产物c t a p - h i 和 b - t h r o m b o g l o b u l i n 、炎症蛋白1 0 ( i p - l o ) 、e n a - 7 8 ：后者 c - c p ) 主要趋化单核细 胞，这个亚族的成员包括巨噬细胞炎症蛋白l a ( m i p 1 a ) 、m i p 1 b 、r a n t e s 、 单核细胞趋化蛋白1 ( m c p - 1 m c a f ) 、m c p 2 、m c p - 3 和1 - 3 0 9 ( 7 ) 其它细胞因子 如表皮生长因子( e g f ) 、血小板衍生的生长因子( p d g f ) 、成纤维细胞生长 因子( f g f ) 、肝细胞生长因子( h g f ) 、胰岛素样生长因子i ( i g f i ) 、i g f i i 、 白血病抑制因子( u f ) 、神经生长因子( n g f ) 、抑瘤素m ( o s m ) 、血小板衍生 的内皮细胞生长因子( p d e c g f ) 、转化生长因子吨( t g f 吨) 、血管内皮细胞生长 因子( v e g f ) 等。 从功能上看，白细胞介素( m ) ，干扰素( 刀f n ) 、集落刺激因子( c s f ) 、肿瘤 坏死因子( t n f ) 、转化生长因子( t g f - p ) 以及趋化因予等，其作用是以调节免疫 应答为主；血小板衍生因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子及表皮生长因子 等，其作用以促进细胞增殖为主。 根据产生细胞因子的细胞种类不同分为： ( 1 ) 淋巴因子( 1 y m p h o k i n e ) 主要由淋巴细胞产生，包括t 淋巴细胞、b 淋巴细胞和n k 细胞等。重要的淋 巴因子有，2 、，3 、一、，5 、i l - 6 、i l - 9 、，l o 、，1 2 、，1 3 、，1 4 、i f n - y 、 t n f b 、g m - c s f 和神经自细胞素等。 ( 2 ) 单核因子( m o n o k i n e ) 主要由单核细胞或巨噬细胞产生，例如i l - i 、儿6 、k , - 8 、n 吓a 、g c s f 和 m c s f 等。 ( 3 ) 非淋巴细胞、非单核巨噬细胞产生的细胞因子 主要由骨髓和胸腺中的基质细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞等细胞产生，如 e p o 、i l - 7 、i l - 1 1 、s c f 、内皮细胞源性i l - 8 和n b 等。 2 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 1 2 几1 的结构及进化 目前有关人类和高等脊椎动物白细胞介素的研究进展十分迅速，国内外报道己 发现的白细胞介素己有2 9 种( s h e p p a r de ta l ，2 0 0 3 ) ，其中白细胞介素1 ( i n t e r l e u k i n - i ， ，1 ) 被认为是其中重要的成员之一。i l - i 家族由4 个重要的成员组成：i l - l a 、，1 6 、 i l - i 受体拮抗物( i l - i 鼬p t o ra n t a g o n i s t ，i l - i r a ) 和i l - 1 8 ，此外最近还发现了该 家族四种新的分子：f i l l s 、f i l l 、f 几l ( 和f i l l t i ( s m i t he ta l ，2 0 0 0 ) 。 在i l - i 家族中i l - l a 和i l - l p 的同源性最高，编码人i l - i 的基因位于第2 号染 色体，i l - l a 和，l b 都含有7 个外显子( d i n a r e l l o ，1 9 8 8 ) 。两者在基因组分别为 l o 5 曲和7 5k b ，蛋白质产物分别由1 5 9 和1 5 3 个氨基酸残基组成，分子量为1 7 5 k d a ，二者之间的碱基和氨基酸序列同源性分别为4 5 和2 6 ( f u m t a n ie ta l , 1 9 8 6 m a r c he ta l , 1 9 8 8 ) 。 i l - l a 和i l - l p 不仅在基因水平上相近，其三维结构也非常相似。事实上，1 家族成员也都具有一个争三叶草形结构，以i l - 1 1 b 为例( 见图1 1 ) ，该分子含1 2 条反向平行的p 折叠( 依次命名为p l - 1 2 ) ，由转角、短环或长环连接。口l 、艮、艮、 f i s 、尚、p 1 2 形成一个p 筒，除b ( 有一个p 突起) 外，所有的折叠都是规则的：i l - 1 1 b 1 2 条折叠构成3 个拓扑单位( 八b ，c ) ，每个拓扑单位含5 条折叠( m u r z i n 就a l ， 1 9 9 2 ) 。 图i - i h j l p 分子结构模型( 摘自s m i t h d ee t i i ，2 0 0 0 ) f i g e l - im o l e c u l a rm o d e lo fb u - i p ，l d 和n - i p 也存在明显区别，两者前体分子均为3 i g j ) a ，而且无信号肽， 但是，l i m a 的前体分子具有生物学活性，主要以胞内或膜结合形式存在。细胞凋 亡后释放到胞外，被多种酶切割成1 7 ) a 的成熟肽。而n - 1 1 3 的前体肽是没有活 性的，酶切后的成为有活性的成熟肽分泌到胞外。这种酶就是n - i p 转换酶( ，l p 3 黄鳍棘鲷r l l - ! b 生物学活性检测及血清i g m 的纯化 c o n v e r t i n ge n z y m e , l c e ) 。 i l - i r a 是，l 的一种特殊拮抗物，通过选择性剪接形成胞内型和分泌型两种 形式。i l - i r a 与m - 1 1 3 具有很高的氨基酸同源性，人们推测i l - i r a 很可能起源于 3 5 亿年前一个m - l j ；基因的复制本。i l - 1 8 之所以归入，l 家族主要是与其他成员 具有结构上的相似性。与i l - i i ；一样，i l - 1 8 的前体也没有信号肽，经过i c e 切割 后成为活性形式( s e c o m b e se ta l , 1 9 9 9 ) 。 现有的研究表明，i l - i 和成纤维细胞生长因子( f i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r , f g f ) 可能起源于共同的祖先基因，最明显的证据就是两种细胞因子都具有一个b - 三叶草 形结构( 见图1 - 2 ) ，而且两者有显著的氨基酸同源性，以及没有信号肽等等( d i n a r e l l o ， 1 9 9 1 6 ) f g f l l 严1 8 毋再一 卧k oo。、 i l - l r a i l * 1 l ； 图l - 2 争三叶草细胞因子家族的可能的进化过程( 摘自s e c o m b e scj e ti i ，1 9 9 9 ) f 嘻l - 2 p o s s i b l ee v o l u t i o n a r ye v e n t sw i t h i nt h e 弘t r e f o i lc y t o k i n ef a m i l y 1 3 几一1 的生理功能 i l - 1 是高活性的细胞因子，极低浓度即有很强的生物学活性，在生理和病理反 应中起着复杂的类似激素的作用。，l 的生物学作用十分广泛，是介导机体炎症反 应和免疫应答的关键调节因子，此外i l - i 还具有抗肿瘤作用。目前的研究多集中于 炎症反应和免疫反应两方面( 王世若等，2 0 0 1 ) 。 ( 1 ) 在炎症反应中的作用，l 作用的靶细胞不仅有淋巴细胞，还有嗜中性粒 细胞、纤维母细胞及肝、胰、肌肉，脑等器官的细胞，l 靶细胞的范围如此广泛， 与其在感染、免疫应答、外伤、炎症反应中的介质作用有直接关系，炎症反应是与 很多器官、组织有关连的复杂的机体反应过程，作为炎症反应初期的介质而起作用 4 = 一 一3 、 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 的，l ，具有多种作用，如当巨噬细胞吞噬病原菌被活化时，其结果是伴随感染的 发生，引起机体发生各种反应，如发热，引起体温升高，因为i l - 1 能促进前列腺素 e - 2 0 o e - 2 ) 的产生，p g e 2 值的升高，刺激下丘脑的体温调节中枢，引起发热，现 在认为它是与内原性热原质( 白细胞热原质) 为同一物质；再如，在炎症局部产生 的i l - i 具有趋化因子的作用，使白细胞集中于炎症局部，并进而使其活化，增强杀 伤作用，又如在感染的急性期，肝细胞能合成急性期蛋白( a c u t ep h a s ep r o t e i n ) ，像 d 反应蛋白、淀粉样蛋白，其血清值可高达正常值的1 0 0 倍，其他如结合珠蛋白、 纤维蛋白原、血浆铜蓝蛋白的产生亦亢进，这与i l - i 的刺激有直接关系。 ( 2 ) 在免疫应答调节中的作用，i l - 1 在免疫反应中的作用广泛，i l - 1 可刺激t 细胞发生有丝分裂反应，当抗原或有丝分裂原刺激t 细胞发生增殖反应时，必须有 i l - i 参加，方可增强反应的发生。i l - i 可诱导淋巴细胞释放淋巴因子，如t h 细胞 分泌i l - 2 必须有i l - 1 参与，故曾称为“i l - 2 释放激素”，i l - 1 可促使t 细胞膜发生 变化，包括使细胞膜粘滞度增加，促使细胞功能成熟，使t 细胞结合抗原能力增强， 增加抗原结合细胞的百分率，l 可诱导细胞毒t 细胞( c y t o t o x i ctl y m p h o c y t e s , t c 或c t l ) 的产生，但这种作用是间接地，需先诱导i l - 2 的释放，再经i l - 2 的支 持，c t l 方能生长增殖，i l - 1 可加强天然杀伤细胞( n a t u r a lk i l l e rc e l l , n k 细胞) 的 活性，但单纯的i l - i 对n k 细胞没有刺激作用，只有r - i 加上，2 或干扰素，或 加上两者才能明显地增强n k 细胞的活性。可促进b 细胞增殖，分化为产生抗体的 细胞。 此外，l 还具有抗肿瘤作用，l 除了对肿瘤细胞的生长有直接的抑制作用 外，还可提高抗癌细胞因子如，2 、卫f n 吖的产生，以及增强t c 及n k 细胞的活 性，并可与i l - 2 和l f l q - y 一起提高t c 和n k 活性，发挥抗肿瘤作用。 2 鱼类i l 1 p 的研究进展 2 1 鱼类，邛的克隆及序列分析 1 9 9 9 年z o u 等根据已知的哺乳类的x l - l p 基因序列，利用同源克隆的方法从虹 鳟( 仂娥呐帅c 而螂m y k i s s ) 中克隆出i l - l f ，基因的全长c d n a 序列。随后又利用同 源克隆或文库筛选的方法克隆了一大批鱼类的l l - l l b 基因，包括：鲽( p l e u r o n e c t e s p l a t e s s a ) 、狗鱼( e s o xr e i c h e r t i ) 、鲤( c y p r i n u sc a r p i o ) 、乌颊海鲷( a p a r u s m a c r o c e p h a l u s ) 、舌齿鲈( d i c e n t r a r c h u si a b r a x ) 、花鲈( l a t e o l a b r c c c j a p o n i c u s ) 、金 头鲷( s p a r u s a u r a t a ) 、大菱鲆( s c o p h t h a l m u s n u m m u s ) 、真鲷( p a g r u s m a j o r ) 、金 鱼( c u t r a s s i u s a u r a t u s ) 、斑马鱼( d a n i or e r i o ) 、小斑点鲨( s c y l i o r h i n us c a n i c u l a ) 、 鳜( s i n i p 8 r c ac h u a t s d 、黄鳍棘鲷( a c a n t h p a g r u st a m s ) 、尼罗罗非鱼( o r e o c h r o m i s n l l o a c u s ) 等( 李建柱，2 0 0 5 ；l e ee ta l , 2 0 0 6 ) 。 对鱼类i l - 1 1 b 基因分析表明，鱼类，l b 的内含子数量变化较大，但是同源性 5 黄鳝棘鲷r l l - ib 生物学活性检测及血清x g m 的纯化 较高( 见图1 3 ) ，例如虹鳟和鲽3 o r f ( 开放阅读框，o p e nr e a d i n gf r a m e ) 中2 3 7 b p 的一段序列分析表明，两者的核苷酸同源性达到7 0 ( s e c o m b e s 既a l , 1 9 9 9 ) ，进 一步构建的，l p 蛋白质分子模型也证明了鱼类m - l p 的高同源性( s c a p i g l i a t ie ta l , 2 0 0 4 ) 。 鱼类n 。- 1 1 3 与哺乳动物也具有很高的同源性，例如虹鳟与哺乳动物的氨基酸同 源性达到4 9 5 6 ( z o ue ta l , 1 9 9 9 b ) 。此外与哺乳动物一样，鱼类，l b 也没有信 号肽，而且实验证明，人类，l 的抗血清可以抑制鱼类，l 的生物学活性，这也 暗示了两者蛋白分子之间结构上的相似性( s c a p i g l i a t ie ta l , 2 0 0 4 ) 但是鱼类几- l p 与哺乳动物相比有一个明显的不同，至今克隆到的基因进行序列分析后均没有发现 i c e 的酶切位点。 图1 = 3 虹鳟n 一- q l ( a ) 和舌齿鲈f l 一- l p ( b ) 的分子模型( 摘自s c a p i g l i a t ig e ti t , 2 0 0 4 ) f 嘻1 = 3m o l e c u l a rm o d e l so f t r o u tm - l pa n ds h b a s sm - l p 6 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 2 2 鱼类几1 b 的表达及调控 在i l - l p 基因表达及调控的研究中，w a n g 等( 2 0 0 2 ) 对虹鳟，l1 3 基因的启动 子序列进行了研究，分析发现在t a t a 框上游1 9 2 1 个碱基处有n f r 。b 顺式作用元 件，推测i l - i1 3 基因的转录可能受n f r 。b 的调控；一个佐证就是e n g e i s m a 等( 2 0 0 1 ) 研究发现，n f r b 抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐( p y r r o l i d i n ed i t h i o c a r b a m a t e , p d t c ) 可以抑制l p s 诱导的鲤鱼i b l l 3 的转录。z o u 等( 2 0 0 0 ) 在研究影响虹鳟 n - l l a 转录的因素时发现，转录水平受l p s 剂量的影响，1 s l 倒m ll p s 诱导下的表 达量比0 1 陷，l i i l 时提高了近1 8 倍，并且在5 p g a d 时表达量达到最大。i l - l l b 转录 水平也受到温度的影响，在2 2 下l p s 刺激后1 l - 1 1 3 基因的转录水平较4 下增加 了8 倍。 另外一个值得注意的现象就是在几种鱼类中发现了i l - l p 不同的剪接产物。z o u 等( 1 9 9 9 a