（微生物与生化药学专业论文）融合蛋白ctpsod在毕赤酵母中的表达、纯化及抗氧化能力.pdf

摘要 融合蛋白c t p - s o d 在毕赤酵母中的表达、纯 化及抗氧化能力 徼生物与生化药学专业硕士研究生李沛志 指导教师刘堰教授 摘要 超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s es o d ) 是一种在生物界广泛存在的抗氧化 酶，在抗衰老、抗肿瘤、抗免疫疾病和电磁辐射上都起着重要的作用。s o d 主要在细 胞质中发挥作用，但是由于s o d 是生物大分子，没有特异性的受体和通道，不容易跨 过细胞膜进入细胞质，大大降低了生物利用度。 细胞质转导肽( c y t o p l a s m i ct r a n s d u c t i o np e p t i d ec x p ) 是在转导肽t a t 基础上人工 设计的一种新型转导肽，能够携带外源大分子穿过细胞膜，定位于细胞质。本实验利 用含有细胞质转导肽基因序列的s o d 特异引物，以人总r n a 反转录产物为模板，扩 增出了c t p 和铜锌超氧化物歧化酶( c u z ns o d ) 的融合基因。将其克隆到毕赤酵母分 泌表达载体p p i c 9 k 中，成功地构建重组表达载体c t p s o d p p i c 9 k 。通过电激法将 重组载体转化巴斯德毕赤酵母g s l l 5 ，经酵母菌落p c r 和s d s p a g e 筛选得到可表 达重组蛋白的阳性重组子。大量诱导融合蛋白c t p s o d 表达，收集发酵上清经盐析、 透析后，采用镍亲和层析介质纯化重组蛋白，蛋白纯度达到9 0 以上，比活为 6 7 6 5 u m g 。经w e s t e m b l o t t i n g 分析，进一步验证了重组蛋白的正确表达。 为了分析c t p s o d 的生物功能，我们利用邻苯三酚( p y r o g a l l 0 1 ) 诱导h e l a 氧化损 伤，研究了重组蛋白对氧化胁迫下h e l a 细胞的保护作用。6 0 # m o l l 的邻苯三酚处理 细胞4 8 h 后只有4 2 2 细胞存活下来；而c t p s o d 预处理h e l a 细胞，明显提高了 h e l a 细胞在氧化胁迫下的存活率，随着c t p s o d 剂量的从l # m o l l 增加到4 # m o l l ， h e l a 细胞的存活率比对照组上升了l o 到3 0 。c t p s o d 预处理h e l a 细胞，明显 提高了h e l a 细胞的抗氧化能力，和对照组野生型s o d 相比具有显著性差异。结果表 明，c t p s o d 融合蛋白比野生型s o d 更容易进入细胞，具有更高效的抗氧化功能。 关键词：超氧化物歧化酶细胞质转导肽毕赤酵母分泌表达氧化胁迫 两南人学硕 j 学付论文 e x p r e s s i o na n dp u r i f i c a t i o no f f u s i o np r o t e i n c t p so di np i c hi ap a s t o r i sa n da n t i o x i d a n t c a o a c l t va n a l y s i s p o s t g r a d u a t eo f m i c r o b i a la n db i o c h e m i c a lp h a r m a c yl ip e i z h i s u p e r v i s o rp r o f e s s o r a bs t r a c t s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，w h i c hc a t a l y z e st h ed i s m u t a t i o no fs u p e r o x i d er a d i c a li n t o h y d r o g e np e r o x i d ea n dm o l e c u l a ro x y g e n ，a r ef o u n di na l lf r e e l i v i n go r g a n i s m se x c e p t s o m eo x y g e n - s e n s i t i v eo b l i g a t ea n a e r o b e s a ss u p e r o x i d er a d i c a li si n v o l v e di nt h e p a t h o g e n e s i so fav a r i e t yo fd i s e a s e s ，m o r ea n dm o r ea t t e n t i o nh a v eb e e np a i dt ot h ec l i n i c a l a p p l i c a t i o no fs o d s o ds h o u l db ed e l i v e r e dm t r a c e l l u l a r l yt oe x e r ti t st h e r a p e u t i ca c t i o n i n s i d et h ec y t o p l a s m ；h o w e v e r , t h e r ei sn os p e c i f i cr e c e p t o ro rc h a n n e lf o rs o dc r o s st h e c e l lm e m b r a n e ，w h i c hg r e a t l yr e d u c e di t sb i o a v a i l a b i l i t y c y t o p l a s m i ct r a n s d u c t i o np e p t i d e ( c x p ) w a san e w l yd e s i g n e dt r a n s d u c t i o np e p t i d e b a s e do nt h eb a s i cd o m a i no fh i vt a tp e p t i d e i tc o u l dc a r r yt h em o l e c u l e sa c r o s st h ec e l l m e m b r a n e 、航t l lap r e f e r e n c et ol o c a l i z ei nt h ec y t o p l a s m i cc o m p a r t m e n t i nt h i ss t u d y , w e u s e dt o t a lr n ao fh u m a nb e i n g st oa m p l i f yt h ec t p s o df u s i o ng e n eb yr e v e r s e d t r a n s c r i p tp c r t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dc t p - s o d p p i c 9 kw a sc o n s t r u c t e db yi n s e r t i n g c t p s o df u s i o ng e n ef r a g m e n ti n t op i c h i ap a s t o r i se x p r e s s i o nv e c t o rp p i c 9 kw h i c h c o n t a i n e da o x lp r o m o t e ra n ds e c r e t i n gp e p t i d e ，a n dt h e nt r a n s f c r e di n t op i c h i ap a s t o r i s g s l1 5b ye l e c t r o p o r a t i o n t h er e c o m b i n a n tg s l1 5 c t p - s o dp i c h i ap a s t o r i sw e r e s c r e e n e db yy e a s tc o l o n yp c ra n ds d s - p a g e ，a n dt h e nw a sf e r m e n t e di nf l a s k s c r u d e e x t r a c tw a so b t a i n e df r o mf e r m e n t a t i o nc e n t r i f u g a ls u p e m a t a n tb ys a l t i n go u ta n dd i a l y s i s t h ef u s i o n - p r o t e i nw a sp u r i f i e do nan ia f f i n i t yc o l u m nt om o r et h a n9 0 p u r i t ya n dt h e p e c i f i ca c t i v i t yw a s6 7 6 5 u m g t h ep u r i f i e dp r o t e i nw a ss t o r e da t 一7 0 0 ci ng l y c e r o lb u f f e r u n t i lu s e w ec o n f i r m e dt h a tt h er e c o m b i n a n tf u s i o np r o t e i nw a sc o r r e c t l ye x p r e s s e db y u s i n gw e s t e r nb l o t t i n ga s s a y t od e t e r m i n ew h e t h e rc t p s o dc a np l a yi t sb i o l o g i c a lr o l ei nt h ec e l l s ，w eh a v e t e s t e dt h ee f f e c to fc t p s o do nc e l l v i a b i l i t yu n d e ro x i d a t i v es t r e s s a f t e rt h eh e l ac e l l s w e r ee x p o s e dt o6 0 # m o l lp y r o g a l l o lw i t h o u tc t p s o d ，o n l y4 2 2 o ft h e mw e r ev i a b l e ； t h ev i a b i l i t yi n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yw h e nc t p s o dw a sp r e t r e a t e di nad o s e - d e p e n d e n t 摘要 m a n l i e r t h ec e l l - v i a b i l i t yo fh e l ac e l l sp r e t r e a t e dw i t hl 4 j i l l l 帕儿c t p s o di n c r e a s e d b ya p p r o x i m a t e l y1 0 3 0 a sc o m p a r e dw i t ht h a to ft h ec o n t r 0 1 c t p s o ds i g n j f i c a n t l y i m p r o v e dt h es u r v i v a lr a t eo fh e l ac e l l su n d e rt h ep y r o g a l l o l i n d u c e do x i d a t i v es t r e s s t h e s er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tc t p s o dc o u l dc r o s st h ec e l lm e m b r a n em o r ee f f i c i e n t l y a n dp r o t e c tc e l l sf r o mo x i d a t i v es t r e s s k e y w o r d s ：s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，c y t o p l a s m i ct r a n s d u c t i o np e p t i d e ，p i c h i a p a s t o r i s ，s e c r e t o r ye x p r e s s i o n ，o x i d a t i v e s t r e s s 独创性声明 学位论文作者签名：导师签名： 叫礁 签字日期：年月 日签字日期： 年月 日 趣盒童卫 口 第1 章文献综述 第1 章文献综述 1 1 氧自由基和超氧化物歧化酶 1 1 1 氧自由基的产生和危害 自由基，是含有一个不成对电子的原子或原子团。自由基的种类很多，生 物体内主要是氧自由基，例如超氧阴离子自由基、羟自由基、脂氧自由基、二 氧化氮和一氧化氮自由基等，其占机体内总自由基研究报道的9 5 以上。 氧自由基的来源主要有两个方面：一是外源性自由基，如高温、紫外线照 射或电子辐射作用，某些药物、酒精、吸烟或高压氧中毒等，能导致分子裂解 后形成自由基；二是机体在代谢过程中产生自由基，即内源性自由基；体内电 子传递是自由基形成最普遍最易发生的途径，氧化呼吸链是机体赖以存在的基 础，其中有多次分级电子传递，o ：是电子受体，所以会形成多种活性氧自由基， 如0 2 一，o h ，h 0 2 一，h 2 0 2 和1 0 2 等。另外，在一些病变过程中，如在炎症 病变中，白细胞发生呼吸爆发( r e s p i r a t o r y b u r s t ) 后，机体内0 2 一和o h 水平会 明显升高。 正常时机体可产生少量氧自由基参与正常代谢，体内有一套完整的抗氧化 体系，抑制自由基反应，使得过多的自由基被清除或使自由基减少，以维持自 由基的代谢平衡。但是，当机体在病态、衰老或外源性物质入侵后，这一机制 将遭到破坏，机体不能有效清除产生的自由基，则过多的自由基可直接作用于 细胞，导致组织细胞发生氧应激性损伤【l 埘。 目前研究表明至少存在以下四种导致细胞损伤机n - 自由基对生物膜中 脂质的主要成分多聚不饱和脂肪酸有很高的亲和力，因此生物膜易受自由基攻 击发生过氧化连锁反应，造成生物膜的脂质过氧化损伤，从而导致细胞死亡【3 1 ； 蛋白质中h i s ，p r o ，t r p ，c y s 和t y r 等是自由基的敏感型受体，自由基会使 这些氨基酸残基发生改变，从而使多肽链随之断裂、聚合或交联，蛋白质的构 象和活性位点改变，导致其功能的改变【4 】；自由基攻击d n a 双螺旋外侧敏感 的嘌呤和嘧啶，致使碱基被修饰，氢键断裂，双链或单链也发生断裂。从而影 响d n a 的结构和功能，会因基因突变而导致癌症或遗传病【5 】；对细胞外基质 的破坏，从而使细胞外基质变得疏松，弹性降低。 超氧阴离子自由基( 0 2 一) 是所有氧自由基中的第一个自由基，也是最不 活泼的，但可以经过一系列反应生成其它较活泼的氧自由基。它可以扩散到较 远的距，并经过一系列反应生成其他氧自由基，可对细胞内的膜脂、蛋白质、 酶、核酸和线粒体等进行广泛的攻击，产生了极大的毒害作用【们。机体内维持 自由基代谢平衡的是抗氧化酶系和一些小分子抗氧化剂及其他自由基清除系 两南人7 - 硕 学何论文 统。超氧化物歧化酶是生物机体抗氧化酶体系中重要的成分，是重要的0 2 一清 除剂，其专一地作用于- 0 2 一，催化0 2 一发生歧化反应，从而清除0 2 一。 1 1 2 超氧化物歧化酶 超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，e c1 15 1 1 ，s o d ) 是一种具有特定 生物催化功能的金属酶，广泛的存在于自然界的动物、植物以及一些微生物体 内。1 9 3 8 年由k e i l i n 等人首次从牛红血球中分离得到，1 9 6 9 年m c c o r d 和 f r i d o v i c h 发现这种蛋白具有使超氧阴离子自由基发生歧化反应的能力，催化超 氧阴离子歧化为氧气和过氧化氢，因此将其命名为超氧化物歧化酶【7 1 。 s o d 是超氧阴离子自由基的天然清除剂，起到清除并阻止自由基连锁反应 的作用，构成了机体抗氧化的第一道防线。在机体的生长、发育、成熟、衰老 和死亡过程中起着不可低估的生理和病理性调节作用。自发现s o d 的功能以 来，在天然提取、生物工程制备、性质研究以及实际应用等方面都取得了重大 进展，并具有广阔的应用前景。目前在医学、化妆品、保健食品添加剂等方面 得到了广泛的应用睁j 。 治疗关节病。注射c uz n s o d 能明显减轻骨性关节炎患者的疼痛，改善关 节外形，提高关节活动能力。对类风湿行关节炎患者连续注射c uz n - s o d ，可 明显增强握力，缩短晨僵时间，减轻关节疼痛和肿胀，并降低血沉。 自身免疫疾病。自身免疫疾病的病变过程与超氧阴离子和s o d 有关。相关 研究认为其可能的致病机理是：由于特殊血清断裂因子的作用或其他细胞过程 中产生了大量的自由基所致，因此，s o d 治疗自身免疫疾病是较为有效的方法。 体外实验表明s o d 能有效抑制病人淋巴细胞染色体的断裂速度，也能有效的抑 制血清断裂因子的作用。将脂质体s o d 外涂在c r o h n 氏病患者和皮肌炎病人身 上治疗，取得了明显的疗效。 在治疗癌症时，放疗与化疗过程中会有大量活性氧自由基产生，引起严重 的副作用。临床研究表明，注射c uz n s o d 可有效地降低由于大剂量照射而引 起的副作用。提高x 射线剂量，从而提高治疗效果。最近有报道表明，局部使 用s o d 能够治疗由放疗引起的皮肤放射纤维化。给以接受化疗剂治疗的病人 c uz ns o d ，可使白细胞数量维持在可以耐受的水平，并且可增加给药次数和化 疗剂的剂量而不引起骨髓抑制。 人体衰老时，体内抗氧化保护酶体系机能降低，眼内可产生过量的自由基， 引起眼内蛋白质，尤其是“和b 晶体蛋白质的交联而导致白内障。所以使用s o d 对于辅助治疗白内障有较好的疗效。 治疗多种皮肤病。不少皮肤病与自由基过量有关，故可用s o d 治疗多种皮 肤病，如银屑病、皮炎、湿疹、疹痒病、皮肤肿瘤、皮肤老化、射线以及光致 2 第1 幸文献镓述 皮肤病。 治疗氧中毒。人体氧中毒有三种类型：肺型氧中毒、神经性氧中毒和眼型氧 中毒；s o d 对其均有治疗作用。 日用化工上的应用【9 1 。s o d 在化妆品、牙膏等日化工业等方面的开发成功 是其应用领域的重大突破。世界各国对s o d 化妆品感兴趣的原因有三：一是 s o d 作为抗氧化酶，能有效防止皮肤衰老、祛斑和抗皱；二是抗辐射，可以防 晒；三是抗炎，可防止一些皮肤炎症。在国内，许多实验室研制添加c uz ns o d 的化妆品。虽然配方不同，但临床观察结果指出，该化妆品有消除黄褐斑、老 年斑等显著效果。 食品工业上的应用。具有良好的抗衰老、抗炎、抗辐射、抗疲劳等保健强 身的效果。目前已有添加有s o d 的蛋黄酱、牛奶、可溶性咖啡、啤酒、白酒、 果汁饮料、奶糖、酸牛乳、冷饮类等类型的保健食品面市；制成多种剂型的s o d 或复合型食品，已有s o d 胶囊剂、片剂、口服液、脂质体、颗粒剂等形式的 s o d 保健食品；用作抗氧剂，与其它抗氧剂一样，s o d 可作为罐头食品、果汁、 啤酒等的抗氧剂，防止过氧化酶引起的食品变质及腐败现象；以富含s o d 的原 料加工制成保健食品，如大蒜饮料、刺梨s o d 汁等。 1 2 蛋白转导肽研究进展 1 2 1 蛋白转导域 有许多生物活性分子由于自身的生物化学特性而无法通过生物膜。如果将 一些与机体功能紊乱或疾病发生相关的外源蛋白转运进入细胞将使这些蛋白具 有很好的药用潜力。但是，通常情况下蛋白质具有的亲水性特性和高分子量使 其不能自由跨过细胞膜。 最近几十年发现一种新的策略，运用可以穿过细胞膜的短肽做为载体运输 蛋白进入细胞【1 0 舶】。p e n e t r a t i n 1 6 1 和来源于h i v - 1 反式激活蛋白( t a t ) 的碱性结 构域是典型代表。这些短肽片段被称为蛋白转导域( p r o t e i nt r a n s d u c t i o nd o m a i n s ， p t d ) 或转导肽( t r a n s d u c t i o np e p t i d e ) ，也称为细胞渗透蛋白( c e l lp e r m e a b l e p r o t e i n s ，c p p ) 或膜转位序列( m e m b r a n et r a n s l o c a t i n gs e q u e n c e s ，m t s ) 、胞膜穿透 肽( m e m b r a n ep e n e t r a t i n gp e p t i d e s ，m m p ) 等，下面统称转导肽。通过化学或者基 因工程的方法将这些短肽和蛋白分子相连接，可以将多种蛋白转运进入细胞并 发挥相应的功能。这些特性为药物运输和治疗丌辟一条新的途径。 现在已报道的具有相似跨膜转运能力的多肽有很多种，但根据其结构特征 大致可以分为四类：富含精氨酸、具有碱性结构，含有很少的疏水氨基酸； 例如模式转导肽寡聚精氨酸短肽【1 8 1 9 】、来源于h i v - 1 的蛋白转导域t a t l l 5 i 。 两南人硕t - ：何论文 同样具有碱性结构，但富含赖氨酸，含有疏水氨基酸色氨酸( 有报道认为对转 运能力起重要作用) 。来自于果蝇同源域蛋白第三个螺旋域( 4 3 5 8 ) 的p e n e t r a t i n 1 3 , 1 6 属于这一类。含疏水氨基酸，没有带电荷的侧链。如来自成纤维细胞生 长因子分泌信号序列疏水区域的膜转位肽( m e m b r a n et r a n s l o c a t i n gs e q u e n c e p e p t i d em t s ) 。人工设计的嵌合转导肽，含有1 个疏水部分和1 个亲水部分， 如m p g 和t r a n s p o r t a n 等。 富含精氨酸的转导肽包括t a t 是研究最热、运用最多的一类，主要是因为 这类转导肽具有运输多种分子的能力，例如寡聚核苷酸【2 5 1 、小分子量的药物 【2 眈7 1 、非共价结合的超分子复合物【2 8 之9 1 、磁珠【3 0 1 和脂质体【3 1 。3 2 1 等。转导肽t a t 来源h i v - i 反式激活蛋白( t a t ) 的碱性氨基酸富集区；1 9 8 8 年g r e e n 和f r a n k e i 首次报道了h i v - 1 的反式激活蛋白t a t 能够跨膜导入细胞内部；1 9 9 4 年，f a w e l l 等发现与t a t 共价结合的异源蛋白可被其转移到细胞内，即h i v - t a t 具有蛋白转 导活性。随后，v i v e s 等的研究进一步证实，h i v - t a t 中有一个富含碱性氨基酸、 带有正电荷的多肽片段( 4 8 5 7 ) 与蛋白转导功能相关，称之为蛋白转导域( p r o t e i n t r a n s d u c f i o nd o m a i n ，p t d ) 2 1 1 。 1 2 2t a t 转运机制研究进展 转导肽的转运机制是最近研究的热点，虽然在转导肽的转导机制方面还存 在争议，没有一个定论，但是最近的很多研究结果普遍认为胞吞途径在转导过 程中发挥一定的作用。早期有些人认为转导肽可以打乱细胞膜结构直接进入细 胞，但是大部分人认为t a t 通过非胞吞的途径进入细胞的这种观点是不正确 的，是实验过程中的假象造成的【2 8 3 1 彤】。最近d o w d y 等研究发现t a t 和其他 一些富含精氨酸的转导肽通过一种特殊的胞吞作用巨大胞饮作用进入细胞。这 为研究转导肽转运机制提供了一种全新的模式。对转导肽转运机制的深入了解， 可以提高转运效率以达到最终应用于临床的目标。 d o w d y 等人的很多数据表明l 盯介导蛋白转导是一个多步骤的过程，包括 仉盯与细胞表面的结合、刺激细胞通过巨胞饮作用吸收t a t 及其连接的分子进入 巨胞饮泡，然后从胞饮泡中逃逸进入细胞质。研究认为，第一步是通过和细胞表 面普遍存在的糖链结合而吸附到细胞膜上。t a t 引起巨胞饮作用的机制还不知 道，可能由于t a t 和细胞表面的蛋白、蛋白多糖或糖脂等结合引起的。巨胞饮途 径是所有细胞都有的液相细胞内吞作用，是t a t 和多聚精氨酸转运作用所需要的 途径【2 5 2 6 l 。t a t 转导的最后一步就是从巨胞饮泡中逃逸进入细胞质；这个过程很 可能依赖胞吞泡内p h 值的下降，同时在其他因素的作用下促使t a t 轻微扰乱细 胞膜，将t a t 及其连接分子释放进入细胞质。 4 第1 币文献综述 1 2 2 1 与细胞膜的结合 在细胞膜上与t a t 结合的分子是否有利于转导还不清楚。n ”的重要组成成 分，带高电荷态的精氨酸残基是其转导功能所必须的，如果替换掉其中的任何一 个精氨酸都会严重地消弱转导能力【2 7 】。精氨酸不同于其它带正电荷的氨基酸，因 为精氨酸胍基共振稳定性使其具有高等电点，还有胍基能与硫酸盐、磷酸根和羧 酸根等阴离子结合形成二齿氢键1 2 8 1 。这种二齿氢键作用很可能对n 蛆与细胞膜结 合和蛋白转导都起很重要作用。w 汀与细胞膜蛋白的酸性区域、硫酸乙酰肝、膜 磷脂头部基团等的相互作用可能是引起巨胞饮作用和t a t 的跨膜转导的关键。 t a t 、其它多聚阳离子转导肽与硫酸化聚糖有很强的结合能力，例如硫酸肝 素，溶液中存在硫酸肝素可以和细胞膜竞争结合t a t ，抑制t a t 的转导作用 【2 9 3 0 。事实上，细胞膜表面的多聚阴离子聚糖的糖链在t a t 转导的作用还存在 争议，大量的实验数据证明聚糖在转运过程中发挥作用，但是也有一些文章得出 相反的结论【3 1 0 2 1 。 基于多种方法得到的数据，比如利用荧光标记多肽或蛋白，很多人得出转导 需要硫酸乙酰肝素的结论。这些数据表明在缺少或者没有聚糖的细胞中转导作用 会减弱【3 4 刁5 1 ，减弱的程度依检测方法不同而不同，在很多试验中，减少或者缺失 聚糖并没有将转到作用降低到对照组的水平【3 6 1 。要得出t a t 转导作用需要硫酸乙 酰肝素等聚糖的结论，必须有更稳定、灵敏的定量分析方法来判断在聚糖缺失的 细胞中转导作用的降低程度，这种降低是不是真的由于聚糖缺失造成的。 乙酰肝素、硫酸软骨素聚糖和唾液酸在细胞表面形成和碱性n 盯结合的负电 荷聚集区。这些聚糖既是t a t 的结合区域，又促使t a t 和细胞膜发生作用。除了 实验数据表明硫酸类肝素参与了转导，这个理论比较受欢迎还有其他原因：首先， t a t 与结合分子之间的作用不可能是标准的配体受体相互作用，因为将氨基酸序 列打乱或者转变为d 型氨基酸，转导肽和野生型的仍具有相同的转导能力【2 7 ，3 3 1 。 其次，转导作用不依赖于细胞类型，虽然每种细胞表面的聚糖类型不尽相同，但 是所有的细胞膜都包被有可以和t a t 结合的多糖；n 盯精氨酸胍基与硫酸根形成 的氢键可以增加多肽的疏水性，从而有利于t a t 和细胞膜发生作用【2 8 1 。 1 2 2 2 巨胞饮途径在转导过程中的作用 在早期的研究中，认为h i v t a t 蛋白是通过胞吞途径进入细胞【】，但是随后 的研究结果认为t a t 和其他转导肽在40 c 可以被细胞吸收，这种方式不依赖于细 胞的能量代谢。从而得出转导肽通过直接移位穿过细胞膜的结论。相反，最近的 实验数据表明转导作用不能在4 c 发生，是一个依赖细胞a t p 和细胞骨架重排的 主动过程，而不是被动的物理过程【1 9 , 2 3 , 2 5 , 3 9 , 4 0 。 两南人学硕十位沦文 巨胞饮作用是一种液相胞吞作用，是所有细胞都具有的一种胞吞途径，外源 大分子都通过这种途径被细胞吸收。有研究报道多种蛋白聚糖和t a t 短肽或全长 的h i v t a t 蛋白结合，并可作为t a t 的受体，引起巨胞饮作用【3 7 】。另外，多配体 蛋白聚糖在成纤维细胞生长因子通过巨胞饮途径吸收进入细胞的过程中起重要 作用，这表明蛋白聚糖可能促使t a t 通过巨胞饮途径进入细胞【3 引。 有大量的数据表明巨胞饮作用是t a t 转导的机制。d o w d y 和其他实验室的结 果表明，t a t 、其它一些带正电荷的转导肽通过巨胞饮作用被细胞吸收，利用巨 胞饮的抑制剂可以减弱或消除转导作用 2 6 , 3 9 】。更重要的是，n 订或t a t 融合蛋白 可以诱导细胞吸收中性葡聚糖( 中性葡聚糖是巨胞饮途径的标志物，通过巨胞饮 作用被细胞吸收) 2 6 , 4 1 】。t a t 能够引起巨胞饮作用，这表明这些短肽不是通过被 动的途径进入细胞，而是通过激起特定的胞吞作用而被细胞吸收。在巨胞饮作用 抑制剂如细胞松弛素d 或者阿米洛利存在的情况下，t a t 和t a t 融合蛋白的转导 作用就会降低到对照组的水平【2 够9 1 。另外，多聚精氨酸转导肽的转导作用也对阿 米洛利和细胞松弛素d 非常敏感，这就更进一步说明巨胞饮途径在多聚阳离子转 导肽的转导过程中起重要作用 2 5 , 4 2 。g t p a s er a c 的活性是转导作用必需的，这与 r a c 在巨胞饮过程关键步骤肌动蛋白的重排中发挥作用相一致 3 6 , 4 3 】。 已有报道，网格蛋白和质膜微囊介导的胞吞作用在其他转导肽的转导过程中 发挥作用，但是这两种胞吞作用在t a t 的转导中是否起作用还不很清楚。但是也 有一些数据表明这些途径至少在t a t 的转导中起了部分作用 4 4 4 6 1 。但是d o w d y 实验室的结果数据表明t a t 的转导可以在缺乏质膜微囊的细胞中发生，也不被网 格蛋白介导胞吞作用的抑粉u d o m i n a n tn e g a t i v ed y n a m i n l 所抑制。那么这些转导 肽具体是通过哪种胞吞途径转运进入细胞，还存在一定的争议。但是现在的研究 数据表明：至少胞吞作用是t a t 和其它许多富含精氨酸的转导肽跨膜转导所必须 的 4 0 , 4 5 】，至于具体通过哪种胞吞作用可能因为转导肽的类型，或者携带分子特性， 转导细胞的类型不同而不尽相同，也就是说转导过程是一个复杂的机制，而非单 一机制【删。转导肽的类型、转导肽携带的分子特性以及细胞类型等很多因素导致 对转导机制的争议【4 6 1 。 1 2 2 3 转导肽在细胞内的运输 关于转导肽转运最基本的问题是这些短肽或蛋白是怎么穿过细胞膜的。这仍然是 没有解决的问题，虽然已有很多的细胞和生物物理学的实验数据，但仍然没有非 常明确的结论。现在大部分的人赞同蛋白转导是通过胞吞的途径，在没有胞吞作 用发生的情况下，不会发生蛋白转导【2 5 ，2 6 ，3 5 ，4 0 , 4 5 j 。但是胞吞作用仅仅是将转导肽 从细胞膜表面移位到囊泡结构中，严格意义上说，在囊泡内部依旧是在细胞外部。 在胞吞过程中，多肽依旧滞留在囊泡状结构中，但转导肽必须从囊泡中进入细胞 6 第1 葶文献综述 质，因为大多数生物活性分子必须到达细胞内的特定部位才能发挥作用。从囊泡 状结构中逃逸进入细胞质似乎是蛋白转导过程中的一个限速步骤。 从囊泡中逃逸依赖于多种因素，这些因素与已知的影响胞吞泡成熟的因素一致。 第一，降低p h 值可以增强t a t 与质膜的相互作用，相反，内吞泡中的p h 值稳定 则会抑制转导作用。第二，转导作用依赖于膜电位改变，膜电位的改变同样伴随 着胞吞作用。第三，减少胞吞泡内物质浓度，或者胞吞泡移动路线上的膜脂和蛋 白的浓度；这些因素可有利于t a t 与细胞膜作用，然后扰乱细胞膜进入细胞质。 胞吞泡中p h 值的降低是t a t 逃出囊泡所必须的，但p h 降低和质膜紊乱之间 的关系还不清楚【4 5 】，精氨酸和脂质头部基团或硫酸乙酰肝素的作用可能使t a t 更具有强的疏水性，增强了t a t 同细胞膜的作用【2 8 l 。膜电位曾被认为是驱动t a t 和其他转导肽穿膜的因烈2 9 1 ，但是却没有足够的证据来支持这个观点。细胞膜去 极化物质具有抑制转导的作用，但是这会间接的影响到细胞的其他生理反应，如 胞吞作用在细胞膜去极化后被打断。 一些研究发现大于9 0 荧光标记蛋白或多肽都出现在点状的泡状结构中，而 不是在细胞质或者细胞核中。利用一些胞吞泡裂解剂如氯喹可以增强转导的效 率，这些结果表明转导肽跨过细胞膜后仍滞留在小囊泡中【4 7 。4 8 1 。如果这些多肽一 直滞留在囊泡中，那么对于转导作用就是一个瓶颈。但是囊泡中聚集着高浓度的 目的蛋白，如果破除这个环节的限制，那么可以大大提高转导效率。事实上， w a d i a 等人通过将p h 依赖型的质膜破裂肽与t a t 融合，提高了融合肽从胞吞泡 中逃出的能力从而曾强了转导作用【2 6 】。如果突破转导肽穿膜后滞留在囊泡中瓶 颈，那么可以极大提高转导的效率。 转导肽通过胞吞途径转导的理论仍存在很多疑问，比如胞吞泡在细胞内部如何运 输，这个课题现在所知很少。t a t 转导后的巨胞饮泡是沿着微管运输，但是运输 的方向和目的地缺并不是道【2 5 】。 1 2 3 应用及前景 t a t 和其它转导肽在解决药用大分子运输存在的老问题上具有很大的潜力。 大分子活性物质的特异性和效果是小分子物质所无法比拟的。传统的基因治疗是 利用病毒作为运输载体，将外源的核酸分子注入细胞来治疗疾病，但是这种方式 存在细胞毒性和免疫原性的问题。利用t a t 作为载体运输具有治疗作用的大分 子，可以避免基因治疗中存在的副作用。 许多临床和基础研究都在致力于利用t a t 来运输具潜在药物分子的工作。用 来治疗的疾病包括癌症、神经性病变疾病等。t a t 存活素多肽有望在多种癌症 治疗中起作用，包括前列腺癌、乳腺癌、自血病黑素瘤和神经胶质瘤等1 4 9 1 。t a t 存活素与h s p 9 0 作用，致使特异性癌细胞凋亡。另一个基于t a t 策略诱导癌细胞 7 阳南大学硕 j 7 ：何论文 凋亡的例子是将p 5 3 激活蛋白或p 5 3 与t a t 融合引入细胞【5 0 引】。这些多肽和蛋白在 小鼠癌症模型中具有很好的效果，很可能作为传统治疗的辅助性治疗【5 2 5 3 1 。 另一个应用领域是缺血性中风和神经性变疾病。t a t 与蛋白激酶c 抑制多肽融合， 在治疗缺血再灌注疾病小鼠模型中有很好效果。在体外实验中，n u p k c 具有 很强的活性，现正在进行临床实验来评价应用于人体治疗时的效果m 5 5 1 。b c l - x 1 、 胶质细胞源性神经营养因子( g d n f ) 、o f - 突触核蛋白、超氧化物歧化酶等与t a t 融合，已经用来治疗神经变性疾病【5 6 - 5 9 。 在利用t a t 运输外源分子的研究中，运输s i r n a s 比较热门，也是比较重要的 应用。理论上s i r n a s 可以用于几乎所有疾病的治疗，并且由于s i r n a 高效价，t a t 在运输的效果比其他分子较好，现在已经取得了丰硕的成果 2 0 l 。 1 3 巴斯德毕赤酵母表达系统 巴斯德毕赤酵母p i c h i ap a s t o r i s 是在8 0 年代初期发展起来的优良酵母表达 系统，自被开发以来一直受到人们的重视和广泛应用。毕赤酵母是单细胞真核 生物，属于甲醇营养型酵母。由于细胞体内含有甲醇代谢途径所必需的酶，如 乙醇氧化酶( a o x ) 、二羟丙酮合成酶和过氧化氢酶等，毕赤酵母能在以甲醇 为唯一碳源和能源的培养基中生长。其中乙醇氧化酶( a o x ) 是甲醇代谢途径 中的十分重要的酶。甲醇代谢途径由a o x 催化甲醇为甲醛和过氧化氢；过氧 化氢酶又降解过氧化氢为氧气和水。过氧化氢又进一步氧化甲醛为甲酸和c 0 2 ， 这样通过两种脱氢酶的作用使细胞以甲醇为唯一碳源。此外，a o x 基因启动子 调控外源基因的表达。在甘油、葡萄糖等其它碳源存在的条件下，a o x 基因表 达抑制，外源基因不被表达。只有当甲醇为唯一碳源时，a o x 大量合成，外源 基因被调控表达。由于此表达系统的表达载体不是以自主复制的质粒存在，而 是整合到酵母染色体中，外源基因不易丢失，所以构建的工程菌株十分稳定。 毕赤酵母作为真核细胞生物比哺乳动物细胞易于进行遗传操作、生长迅速， 又能克服大肠杆菌表达系统缺乏转录后加工修饰的缺陷，可以对外源蛋白进行 正确的翻译和翻译后的加工修饰，合理的空间折叠，非常有利于真核基因的表 达。毕赤酵母除了具有与酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e s i v i a e ) 一样易于操作培 养等特点外，自身还具有独特的优点： 1 、毕赤酵母生长培养基中的盐、生物素、碳源等都较易得到，培养基成本 低廉。 2 、在毕赤酵母中表达的蛋白质可以胞外分泌又可胞内表达，其自身分泌的 背景蛋白很少，十分有利于蛋白纯化。 3 、对表达蛋白的糖基化程度低。毕赤酵母加在表达蛋白的糖链长度要比酿 酒酵母所加的糖残基短很多，可避免外源蛋白生产过强的免疫原性或糖链过长 8 第1 辛文献综述 干扰外源蛋白正确折叠而影响其功能。 4 、具有乙醇氧化酶基因( a o x ) 启动子或磷酸甘油酸脱氢酶( g a p ) 基 因启动子，可严格调控外源蛋白的表达。 5 、毕赤酵母具有强烈的好氧生长偏爱性，可进行细胞高密度培养，利于大规 模工业化生产。毕赤酵母能高水平分泌外源蛋白，如破伤风片段c 在毕赤酵母 中的产量高达1 2 9 l 。 9 笫2 章绪论 第2 章绪论 2 1 研究目的与意义 铜锌超氧化物歧化酶( c u z ns u p e r o x i d ed i s m u t a s ec u z ns o d ) 是一种能专一 清除超氧阴离子自由基的抗氧化酶。目前。s o d 作为药用酶已开始应用于骨关 节炎、类风湿性关节炎以及红斑狼疮等疾病的治疗，尤其对治疗关节炎及类风 湿关节炎有明显疗效。在治疗心肌缺血症与缺血再灌注综合症及某些心血管疾 病方面也有可喜的效果，并能够防辐射，目前临床上常用来辅助放疗和化疗以 降低大剂量照射引起的副作用。 由于细胞膜对细胞外环境的天然屏蔽作用，除了具有特定转运机制的分子 可以进入细胞，外源多肽、蛋白质、纳米药物运输载体等大分子物质很难进入 细胞。向细胞内高效运输大分子药物是药物运输中存在的难题。s o d 存在同样 的问题。s o d 主要在细胞质中发挥作用，但是由于s o d 是生物大分子，没有 特异性的受体和通道，不容易跨过细胞膜进入细胞质，大大降低了生物利用度。 细胞质转导肽( c y t o p l a s m i ct r a n s d u c t i o np e p t i d ec t p ) 是在转导肽t a t 基础上 人工设计的一种新型转导肽，可以转运大分子穿过细胞膜定位于细胞质【6 1 1 ，一 些研究也进一步表明c t p 的确有运输药物分子定位细胞质的偏好性【7 0 。7 1 1 。c t p 作为一种新型运输工具为细胞质靶向的药物大分子跨膜运送提供了很大的便 利。本实验将c t p 基因和人c u z ns o d 基因融合，构建真核融合表达载体 c t p s o d p p i c 9 k ，旨在获得能够表达具有生物活性融合蛋白的毕赤酵母工程 菌株，纯化获得具有活性的融合蛋白，研融合蛋白的抗氧化能力，以及细胞质 的靶向能力，期望获得具有跨膜转导能力和定位细胞质的偏好性的s o d ，以更 好的发挥s o d 的活性。 2 2 研究内容 实验内容涉及到人胎盘组总r n a 提取，反转录合成c d n a 第一条链；设计 含有c t p 序列和h i s 6 纯化标签的引物，扩增c t ps o d 序列；真核融合表达载 体c t p s o d p p i c 9 k 的构建及测序鉴定；重组质粒电击转化鼻赤酵母g s l l 5 ， 阳性重组子及蛋白表达菌株的筛选；蛋白纯化及w e s t e r - b l o t t i n g 验证；纯化蛋 白比活测定；h e l a 细胞邻苯三酚细胞氧化损伤模型建立，及融合蛋白抗氧化能 力研究。 筇3 章寅验材_ 5 ： 及仪器 3 1 实验材料 第3 章实验材料及仪器 3 1 1 菌株和质粒 毕赤酵母菌株g s l l 5 ，质粒p p i c 9 k 购自i n v i t r o g e n 公，宿主菌e c o i lt o p l 0 本实验室保存。 3 1 2 主要试剂 各类限制性内切酶，t 4 d n a 连接酶，t a q 酶，高保真酶p r i m e r s t a r t m h s d n ap o l y m e r a s e 等购自t a k a r a 公司；r n a s e 购自上海生工。含酚红的d m e m 培养基( h y c l o n e 公司，美国) ，小牛血清( h y c l o n e 公司，美国) ，胰蛋白酶， 双抗( 青霉素，链霉素，h y c l o n e 公司，美国) 。 3 1 3 引物及测序 两条引物均由上海生工全长合成；重组质粒由上海生工完成测序。 3 1 4 主要试剂 试剂名称生产单位 纯级 y n b b i o t i n p e p t o n e t r y p t o n e y e a s t