（预防兽医学专业论文）dhvⅠ单克隆抗体的制备与胶体金试纸条的研制.pdf

目录 1 2 2d i - ：- i 感染和致病的分子机制9 1 3 鸭病毒性肝炎病毒( d h v i ) 的诊断方法1 0 1 3 1 根据临床症状初步诊断1 0 1 3 2 根据病理剖检变化诊断1 1 1 3 3 病原学诊断1 1 1 3 4 血清学诊断1 2 1 3 5 分子生物学诊断o oo qoo 1 2 1 4d h v oi 的预防与治疗1 3 1 4 1 预防o o oooq 1 3 1 4 2 治疗o o oo gg 1 4 1 5 单克隆抗体研究进展o oqoo o 1 4 1 6 免疫胶体金概述o qooog 1 5 1 6 1 胶体金技术的基本原理1 6 1 6 2 免疫层析的概念1 7 1 6 3 免疫胶体金技术的特点1 7 1 6 4 试纸条的检测原理1 8 1 7 本研究的目的及意义1 9 2 材料与方法2 1 2 1 材料2 l 2 1 1 菌( 毒) 株2 1 2 1 2 实验动物及细胞株2 1 2 1 3 酶和相关试剂2 l 2 1 4 主要仪器2 1 2 1 5 引物设计与合成2 2 2 1 6 溶液系统2 2 2 2 方法2 2 2 2 1 病毒的增殖与纯化2 4 2 2 2 病毒总r n a 提取2 5 2 2 3d h v - iv p i 目的片段的扩增2 5 2 2 4 电泳检测26 2 2 5 目的核苷酸克隆测序2 7 2 2 6 重组表达质粒的构建3 0 2 2 7 重组质粒在大肠杆菌中的表达与检测3 1 2 2 8b a l b c 小鼠的免疫3 2 2 2 9 间接e l i s a 检测方法的建立3 3 2 2 1 0s p 2 o 骨髓瘤细胞的培养3 6 2 2 1 1 饲养细胞的制备3 6 n 2 2 2 4 免疫层析试纸条的组装4 3 2 2 2 5 免疫层析试纸条的性能测试4 3 3 结果与分析4 5 3 1 鸡胚增殖结果4 5 3 2 病毒纯化结果4 5 3 3 目的片段的测序结果4 5 3 4 重组表达质粒的构建和s d s p a g e 结果4 6 3 5w e s t e r nb l o t 分析结果4 7 3 6 间接e l i s a 检测方法的建立4 9 3 7b a l b c 小鼠的免疫及s p 2 0 骨髓瘤细胞的培养结果4 9 3 8 融合筛选结果4 9 3 9 阳性杂交瘤细胞的亚克隆结果5 0 3 1 0 单克隆抗体鉴定结果5 0 i 3 1 1 单抗的纯化与鉴定 3 1 2 胶体金标记抗体最低稳定量的测定 3 1 3 金标抗体吸附于玻璃纤维 3 1 4n c 膜包被单抗和二抗 3 1 5 样品垫的选择 3 1 6 最适标记金颗粒大小的选择 3 1 7 免疫层析试纸条性能的测试 4 讨论 4 1d h v _ iv p i 的表达 4 2 小鼠的免疫5 7 4 3 建立筛选方法5 8 4 4 细胞融合5 8 4 5 阳性克隆的筛选6 0 4 6 腹水的制备6 0 4 7 单克隆抗体的纯化6 0 4 8 蛋白与胶体金结合最佳p h 6 1 4 9n c 膜的选择6 1 4 1 0 胶体金颗粒大小的选择6 1 4 1 1 试纸条的假阳性问题6 2 5 结论”“”一”“”6 3 6 参考文献6 4 7 致 射”“”7 3 i v 符号说明 山东农业大学硕士学位论文 中文摘要 鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒( d h v , d u c kh e p a t i t i sv i r u s ) 引起的主 要发生于3 周龄以下雏鸭的一种传播迅速、致死率高的传染病( w o o l c o c k , p r e ta 1 2 0 0 3 ) 。本课题对d h v - i 病毒结构蛋白v p l 进行了原核表达， 制备了抗d h v - i 的单克隆抗体，研制了检测d h v - i 的胶体金试纸条。 通过r t - p c r 方法扩增d i t v - iv p l 基因片段，并定向克隆到原核表 达载体p e t - 3 2 a ( + ) 中，得到的重组质粒转化进大肠杆菌r o s e t t a ( d e 3 ) p l y s 中，利用i p t g 诱导表达得到大小为4 7 k d 的融合蛋白；w e s t e r nb l o t 分析发现该重组蛋白能与抗d h v - i 阳性血清进行反应，具有良好的免疫 学活性。 用纯化的d h v - i 病毒作为抗原免疫b a l b c 小鼠并建立了间接 e l i s a 筛选方法。经反复试验确定了间接e l i s a 筛选阳性杂交瘤细胞株 的最佳反应条件，即纯化的抗原以1 ：8 0 0 稀释，4 包被过夜，以1 ：4 0 0 0 稀释阴、阳性血清分别作为阴阳性对照，反应条件以3 7 9 0 m i n 为最佳， 酶标二抗的工作浓度为l ：1 0 0 0 稀释。取免疫小鼠脾脏与骨髓瘤细胞进行 融合，以建立的间接e l i s a 筛选方法对融合的杂交瘤细胞进行检测筛选， 经过初检、二检、三检共获得阳性杂交瘤细胞株2 1 株，利用有限稀释法 进行了3 4 次亚克隆( 其中最少有两次为单克隆) 后获得5 株能稳定分泌 m c a b 的杂交瘤细胞株，分别命名为1 e 1 0 、4 f 8 、4 e 6 、5 g 4 、5 e ll 。对这 5 株杂交瘤细胞株的稳定性、染色体数、亚类、腹水效价、特异性进行了 鉴定，结果如下：经连续传代2 0 次和冻存后4 个月复苏检测，其分泌抗 体的能力差异不显著，稳定性好；染色体数介于1 0 0 1 1 0 之间，具有典型 的杂交瘤细胞染色体特征；经亚类鉴定，1 e 1 0 、4 f 8 、4 e 6 、5 g 4 、5 e l l 杂交瘤分泌的抗体类型分别为i g g 2 b 、i g m 、i g g l 、i g m 、i g g l ；单抗腹 d i - i v - i 单克隆抗体的制备与胶体金试纸条的研制 水效价分别为1 ：4 0 0 ，1 ：8 0 0 0 ，1 ：8 0 0 0 ，l ：3 2 0 0 0 ，1 ：1 6 0 0 0 ；并具 有很好的特异性。 通过硫酸铵沉淀法对腹水单克隆抗体进行纯化并测定了其蛋白含量； 在确定标记单克隆抗体最低稳定量后，成功制备了金标单克隆抗体；经反 复摸索确定了n c 膜最佳包被单克隆抗体的量为l m g m l ，羊抗鼠最佳包 被浓度为1 ：1 0 稀释，同时两者按照1 i x l c m 喷膜；选择a h l s t r o m 8 9 6 4 和 g r a d e 7 5 8 9 分别作为金标垫和样品垫制备胶体金试纸条。分别用样品稀 释液和病毒液作为阴阳性对照检测试纸条，结果阴性对照只出现质控线而 病毒稀释液出现检测线和质控线。临床检测结果表明该胶体金试纸条特 异、敏感，可用于d h v - i 的快速诊断。 关键词：d h v 、原核表达、单克隆抗体、胶体金、免疫层析试纸条 2 山东农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t d u c kh e p a t i t i si sak i n do fh i g h l yc o n t a g i o u sa n dl e t h a li n f e c t i o u sd i s e a s e w h i c hc a u s e db yd u c kh e p a t i t i sv i r u s d h vc a l li n f e c ty o u n gd u c km a i n l y w i t h i nt h e3 - w e e k - o l dd u c k l i n g s i nt h i ss t u d y , v p1 p r o t e i no fd h v - 1w e r e e x p r e s s e db yp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o ns y s t e m ，t h em o n o c l o n a la n t i b o d i e so f d h v - 1w e r ep r e p a r e da n dt h ec o l l o i d a lg o l ds t r i pf o rd e t e c t i o no ft h ev i r u s w e r ed e v e l o p e d t h ev p1 g e n eo fd h v - 1w a sa m p l i f i e db yr t - p c r , a n dt h ep c r p r o d u c t s w e r ec l o n e di n t o p e t - 3 2 a ( + ) v e c t o rd i r e c t i o n a l l y , t h e n t h e p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nr e c o m b i n a n tp l a s m i dw a st r a n s f o r m e di n t o r o s e t t a ( d e 3 ) p l y s t h ef u s i o np r o t e i ne x p r e s s e di nec o l ii n d u c e db yi p t gw e r e 4 7k d a , a n dt h ep r o t e i nc o u l dr e a c t 、航也p o s i t i v es e r u mb yw e s t e r nb l o t , d e m o n s t r a t i n gt h a ti th a dg o o di m m u n o g e n i c i t y t h eb a l b cm i c ew e r ei m m u n i z e d 谢t l lp u r i f i e da n t i g e no fd h v - i ，a n d i n d i r e c te n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( i e l i s a ) u s e dt os c r e e n h y b r i d o m ac e l l sw a sd e v e l o p e d t h eb e s tr e a c t i o nc o n d i t i o n so fi e l i s aw e r e t h a tt h ep u r i f i e da n t i g e nd i l u t e da s1 ：8 0 0a n dc o a t e di n4 f o ro n en i g h t ，t h e n e g a t i v ea n dp o s i t i v es e r u mw e r ed i l u t e da s1 ：4 0 0 0 ，t h et e m p e r a t u r eo ft h e r e a c t i o nw a s3 7 a n dt h er e a c t i o nt i m ew a s9 0 m i n t h es p l e e nc e l l sf r o m i m m u n i z e dm i c ew e r ef u s e dw i t hs p 2 0a n d21p o t i v eh y b r i d o m ac e l l sw e r e o b t a i n e db yi e l i s a l i m i t i n gd i l u t i o nm e t h o dw a sp e r f o r m e dt os u b c l o n e p o s i t i v eh y b r i d o m ac e l l s ，a n d 5 p o t i v eh y b r i d o m ac e l l s t h a t c o u l ds e c r e t m c a b ss t a b l yw e r eo b t a i n e df i n a l l ya f t e r3 - 4s u b c l o n i n g ，n a m e d 弱1eio ，4 f 8 ， 4 e 6 ，5 g 4 ，5 e l1 t h es t a b i l i t y ，c h r o m o s o m en u m b e r , s u b t y p e ，t i t e r so ft h ef i v e m c a b si nt h ea s c i t e sa n ds p e c i f i c i t yw e r ei d e n t i f i e d t h ea b i l i t yo fs e c r e t i n g 3 d h v - i 单克隆抗体的制各与胶体金试纸条的研制 m c a b so ft h eh y b r i d o m ac e l l sw e r es t a b l ea f t e rs e r i a l p a s s a g i n gf o r2 0 t i m e s ，w h i c ki n d i c a t e dt h a tt h es t a b i l i t yo ft h ef i v eh y b r i d o m ac e l l sw e r eg o o d t h ec h r o m o s o m en u m b e r so ft h ef i v eh y b r i d o m ac e i l sw e r eb e t w e e n10 0a n d 110 ，w h i c hw e r ea c c o r d i n g 谢1t h ec h r o m o s o m en u m b e ro ft h eh y b r i d o m a c e l l s t h es u b t y p eo f1 e 1 0 ，4 f 8 ，4 e 6 ，5 g 4a n d5 e l1w e r ei g g 2 b ，i g m ，i g g l ， i g ma n di g g lr e s p e c t i v l y , a n dt h et i t e r so ft h em c a b si nt h ea s c i t e sw e r e1 ： 4 0 0 ，1 ：8 0 0 0 ，1 ：8 0 0 0 ，l ：3 2 0 0 0a n d1 ：1 6 0 0 0 a 1 lt h ef i v em c a b sw e r e s p e c i f i cf o rd h v i t h em c a b sw e r ep u r i f i e db ya m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o nm e t h o d ， a n dw e r el a b e l e ds u c c e s s f u l l yb yc o l l o i d a lg o l d t h ec o m b i n a t i o nw a s o p t i m i z e dw i t ht h ec o n d i t i o n so ft h ec h e c kl i n ea n dt h ec o n t r a s tl i n es p r i n k l e d l m g m la n d1 ：10d i l u t e dp r o t e i nw h e nm a k e st h es t r i p ，m e a n w h i l e2l i n e s s p r i n k l e dll a l c m t h eg l a s sf i b r eo fa h l s t r o m8 9 6 4a n dg r a d e 7 5 8 9w e r e u s e d 弱c h r o m a t o g r a p h i cm a t e r i a l st od e v e l o p ec o l l o i d a lg o l ds t r i p u s i n g d i l u t i n gb u f f e r 嬲n e g a t i v ec o n t r o la n dd h v - id i l u t e dw i t hd i l u t i n gb u f f e ra s p o s i t i v ec o n t r o l ，t h en e g a t i v ec o n t r o lo n l ya p p e a r e da c o n t r a s tl i n ew h i l et h e p o s i t i v ec o n t r o la p p e a r e dac h e c kl i n ea n da c o n t r a s tl i n eo nt h ec o l l o i d a lg o l d s t r i p c l i n i c a lt e s tr e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ec o l l o i d a lg o l ds t r i pw e r es p e c i f i c a n ds e n s i t i v ef o rd e t e c t i n gd h v - i a b s t r a c t ：d u c k h e p a t i t i sv i r u s ；p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n ；m o n o c l o n a l a n t i b o d y ；c o l l o i d a lg o l ds t r i p 4 山东农业大学硕士学位论文 1 引言 1 1 鸭i 型病毒性肝炎病毒( d h v - i ) 概述 鸭病毒性肝炎( d u c k r a lh e p a t i t i s ，d v h ) 俗称“背脖病”，是由鸭 肝炎病毒( d u c kh e p a t i t i sv i r u s ，d h v ) 引起的雏鸭的一种高度致死、传播 迅速、以肝炎为主要病变特征的病毒性疾病( w o o l c o c ke ta 1 ，2 0 0 3 ) 。该 病可由三种不同的病原引起，分别称为d h v - i 、d h v - i i 、d h v - i i i ，相互 之间没有血清学关系，其中d h v - i 引起的鸭病毒性肝炎呈世界性分布。 鸭病毒性肝炎最早于1 9 4 5 年发现于美国( l e v i n ea n dh o f s t a d 1 9 4 5 ) 。 并于1 9 5 0 年从鸡胚中首次分离到病原，即d h v - i ( l e v i n ea n df a b r i c a n t ， 1 9 5 0 ) 。随后世界很多国家报道了d h v 的流行。在我国，1 9 6 3 年上海畜 牧兽医研究所黄均建首次报道了鸭病毒性肝炎发现于上海( 黄君建， 1 9 6 3 ) ，其后北京( 王平等，1 9 8 0 ) 、浙江( 任祖伊和吴国栋，1 9 8 5 ) 、福 建( 蒋文灿等，1 9 8 9 ) 等地都先后报道了d v h 的发生和流行。同时，国 内学者通过病毒分离、中和试验和血清被动免疫保护试验，证实我国流行 的d v h 病原为d h v - i 。我国d h v - i 变异株是由林世堂等首先报道的( 林 世堂等，1 9 9 6 ) ，其血清中和试验结果与s a n d u 的报道类似。2 0 0 6 年，郑 献进等报道了d h v - i 变异株iv 的存在( 郑献进等，2 0 0 6 ) 。 1 1 1d h v - i 的病毒学分类与理化特性 i 和型d h v 属于小核糖核酸病毒科( p i c o r n a v i r i d a e ) ，i i 型d h v 因其颗粒形态呈星状，被归属于星状病毒科( a s t r o v i r i d a e ) ( f a u q u e tc m e ta 1 ，2 0 0 5 ) 。i 型鸭肝炎由于与肠病毒类似，最初被归为肠病毒属( t a u r a s o e ta 1 ，1 9 6 9 ) 。近几年m n c h u lk i m 等( 2 0 0 6 ) ，t s e n g 等( 2 0 0 7 ) 以及d i n g ， c 等( 2 0 0 7 ) 通过对蛋白以及3 u t r 基因在结构和分类地位上与小核 糖核酸病毒科中的其他种属相比具有独特特性，由此建议d h v - i 应与小 核糖核酸病毒科中的9 个病毒属( s t a n w a ye ta 1 ，2 0 0 5 ) 肠病毒属 ( e n t e r o v i r u s ) 、鼻病毒属( r h i n o v i r u s ) 、心病毒属( c a r d i o v i r u s ) 、口蹄 疫病毒属( a p h t h o v i r u s ) 、肝病毒属( h e p a t o v i r u s ) 、双埃柯病毒属 ( p a r e c h o v i r u s ) 马鼻炎病毒属( e r b o v i r u s ) 嵴病毒属( k o b u v i r u s ) 、捷申 5 d h v - i 单克隆抗体的制各与胶体金试纸条的研制 病毒属( t e s c h o v i r u s ) 等并列成为小核糖核酸病毒科的一个新种属。 d h v - i 对乙醚、氯仿、胰酶、3 0 0 m l l 甲醇或硫酸铵有抵抗力； 受p h 3 0 的环境；对热也有较强的抵抗力，5 6 1 h 仍有部分病毒存活 6 2 3 0 m i n 可使其全部灭活( s a i f y m e ta 1 ，2 0 0 3 ) 。病毒对常用消毒剂 有明显的抵抗力，2 0 砒几来苏水3 7 6 0 m i n 、l m l l 福尔马林3 7 均不能使其彻底灭活，但在i o m l l 福尔马林或者2 0 9 l 氢氧化钠 1 5 2 0 h 可使病毒完全灭活；病毒在外界环境中能存活3 7 d ；4 c 条件下 存活两个月以上，2 0 则可存活数年。 1 1 2d h v i 病原性 i 型鸭肝炎病毒使l 3 周龄的雏鸭产生严重疾病，传播迅速，1 0 龄以内的雏鸭死亡率高达9 0 9 5 ，雏鸭可能在出现临床症状后的 内死亡( s a n d h ut s e ta 1 ，19 9 2 ) 。4 - - - 5 周龄以上的鸭以及鸡和火鸡不呈现 临床症状，但可带毒几周。将大量病毒接种刚出壳的雏鸡、雏火鸡、雏雉、 雏珠鸡和雏鹌鹑，可使其出现不同程度的临床反应。 自然感染的潜伏期仅1 8 - - 一2 4 h ，但也有长达5 天的报道。雏鸭突然发 病，精神萎顿，嗜眠，呈脚弓反张姿势，并在几小时内死亡。某些病鸭排 出绿色液状粪便。 病变主要在肝脏，肝脏明显增大并水肿，并有许多出血点，由针头大 至黄豆粒大。胆囊肿胀，充满胆汁，显微镜下观察，肝细胞在感染初期呈 空泡化，后期则出现病灶性坏死。中枢神经系统可能有管套现象。各毒株 的毒力明显不同，可能有自然弱毒株的存在。 1 1 3d t n i 流行病学 本病一年四季均可发生，无明显的季节性，但在孵化季节发病率会 明显增加。主要感染1 0 日龄以内的雏鸭，可引起9 0 - - - 9 5 的死亡率。4 5 周龄以上的鸭以及鸡和火鸡不呈现临床症状，但可带毒几周。雏鸡、雏 火鸡、雏雉、雏珠鸡和雏鹌鹑一般不感染该病毒，但当大量病毒接种刚出 壳的雏鸡、雏火鸡、雏雉、雏珠鸡和雏鹌鹑，可使其出现不同程度的临床 反应。成年鸭虽无发病报道，但不能排除感染带毒、散毒的可能性，有资 料报道病愈康复鸭的粪便中可连续排毒1 2 个月( 汪铭书等，1 9 9 7 ) 。目 6 山东农业大学硕士学位论文 前还没有研究证明该病可通过鸭蛋垂直传播。另外鸭舍内的老鼠及水中的 鱼类也可能带毒并成为传染源( d e m a k o vgp ，1 9 7 9 ) ；我国台湾学者也曾 报道在鸭肝炎疫区人工养殖的吴郭鱼和鲤鱼的场内容物中也有多量的 d h v - i 型病毒存在( 司兴奎等，2 0 0 1 ) 。从临床情况看，本病主要通过消 化道分泌物、排泄物排出病毒，污染饮水、陆地环境、水域，而使健康雏 鸭经呼吸道、消化道感染。同一水塘、同一场地饲养的雏鸭群，其中个别 鸭发病后，其余鸭一般难以幸免。同一场地，前一批鸭发病后，如清场消 毒与场地空置时间较短，则后一批雏鸭亦难免感染发病。 1 2d h v - 1 分子生物学研究 1 2 1 病毒基因组及主要结构和功能蛋白的特性 1 2 1 1d h v - i 基因组及其主要结构 根据韩国的m i n - c h u lk i l n 等( 2 0 0 6 ) 分离得到的d r l - 6 2 和r 8 5 9 5 2 株的全基因组序列可知，d i - i v - i 病毒基因组由约为7 6 9 1 和7 6 9 0n t 碱基 组成的单股正股r n a ，其含有一个较大的开放阅读框( o p e n r e a d i n gf r a m e ， o r f ) 。基因组r n a 由5 非编码区( u n t r a n s l a t e dr e g i o n ，u t r ) 、开放阅 读框( o i 珂) 、3 u t r 和p o l y ( a ) 尾组成，它作为遗传物质稳定传代的 同时还可以直接作为m r n a 指导合成一条完整的病毒多肽链。5 u t r 长 约6 2 6 n t ，含有v p g 蛋白、功能未知区和内部核糖体进入位点( i n t e r n a l r i b o s o m ee n t r ys i t e ，i r e s ) 。o r f 由起始密码子、p 1 结构蛋白基因、p 2 和p 3 非结构蛋白基因，以及终止密码子组成，长度约为6 7 5 0 b p 。它表达 一条完整的蛋白质，然后在一系列酶的作用下产生p 1 、p 2 和p 3 蛋白。 p 1 、p 2 和p 3 蛋白进一步酶解形成病毒功能性蛋白。p 1 产物酶解形成v p 0 、 v p l 、和v p 3 三个终产物。p 2 蛋白酶解成2 a 1 、2 a 2 、2 a 3 、2 b 和2 c 五 个终产物。p 3 蛋白酶解成3 a 、3 b 、3 c 、3 d 蛋白。3 u t r 与病毒的复制 过程相关这是小r n a 病毒共同的特征( r o h l le ta 1 ，1 9 9 5 ) 。d h v - i 基因结 构示意图如图1 所示。 7 d h v - i 单克隆抗体的制备与胶体金试纸条的研制 业 二互二工二三二工二】二二，里 8 转录 2 a l 业吓丑亘叵立五王正王正正工三 芏坚 图1d h v - i 病毒基因组结构示意图 f i g 1d h v - ii , e n o m es t r u c t u r ec o n c e p t u a id i a 2 r a m 1 2 1 2d h v - i 基因表达功能蛋白的作用及其特性 虽然d h v - i 基因表达蛋白的具体功能还没有实验数据支持，但是从 基因结构分析来看，它与小r n a 病毒科已知病毒基因结构非常相似。从 现有对小r n a 病毒表达蛋白的功能认识来看，蛋白质p 1 经蛋白酶水解 形成v p l 、v p 2 、v p 3 、v p 4 它们是构成蛋白质衣壳的主要成分，其中v p l 、 v p 2 、v p 3 位于病毒衣壳的外表面，v p 4 位于病毒衣壳内，紧贴于v p l 、 v p 2 、v p 3 复合体。以f m d v 为例，v p l 蛋白是其主要免疫原性蛋白 ( r o s s m a ne ta 1 ，1 9 8 5 ；i t oe ta 1 ，2 0 0 4 ；o b e r s t ee ta 1 ，1 9 9 9 ) ，它含有b 细胞抗 原表位和t 细胞抗原表位，能诱导机体产生中和抗体。另外，b 细胞抗原 表位区构成“g h ”环暴露在病毒粒子的表面，环内的r g d ( 精氨酸甘氨 酸天冬氨酸) 序列高度保守，是病毒的宿主细胞结合的特异性位点 ( b o o n y a k i a te ta 1 ，2 0 0 1 ；i t oe ta 1 ，2 0 0 4 ；j o k i k o r p e l ae ta 1 ，2 0 0 0 ；p u l l ie ta 1 ， 19 9 7 ；s t a n w a ye ta 1 ，19 9 4 ；s t a n w a ya n dh y y p i i ，19 9 9 ) 。v p 4 与内部的r n a 结合，起稳定病毒蛋白结构的作用。2 a 蛋白为分裂初期的的先驱蛋白质， 他从病毒翻译产生的多聚蛋白自裂解成熟。2 a 蛋白酶的主要功能是催化 多聚蛋白水解产生结构蛋白( p 1 ) 及非结构蛋白( p 2 、p 3 ) 两部分产物， 它也与终止宿主细胞合成其本身所需蛋白质有关( m a t t _ h e w se ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 目前关于小r n a 病毒2 b 和2 c 蛋白的具体功能还不清楚，但已有研究显 示2 c 蛋白有a t p a s e 活性。同时，2 a 、2 b 、3 a 、3 b 四种蛋白质则与病 毒r n a 的复制有关。3 c 蛋白酶是催化裂解小r n a 病毒多聚蛋白中非结 构蛋白部分的关键酶，具有丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶双重特性，多 8 坐查奎些奎堂堡主兰垡笙奎 聚蛋白的大多数切割都将由病毒编码的3 c 蛋白来完成。3 d 蛋白为依赖 r n a 的r n a 聚合酶( r n a d e p e n d e n tr n ap o l y m e r a s e ) ，在病毒r n a 复 制时主导转录及复制反应。 1 2 2d h v - i 感染和致病的分子机制 1 2 2 1 病毒结构与感染的关系 病毒与细胞表面受体结合是感染细胞的前提，而病毒表面结构是决定 病毒与细胞受体结合的基础。虽然各种病毒与受体的结合表现出一些独特 的性质，但其实质仍然是蛋白质与蛋白质的相互作用过程，遵循蛋白质结 合的动力学规律。目前对病毒与受体的具体结合过程仍然停留在直接观察 和推理描述水平。d h v - i 的形态结构、衣壳结结构蛋白组成和和肠道病 毒属的其他成员具有很大程度的相似性，而一直同属于肠道病毒属的脊髓 灰质炎病毒是目前研究最为透彻的。当脊髓灰质炎病毒与受体在生理温度 下结合时，诱导病毒衣壳产生构象变化。形成传统病毒学抗原分析中所称 的“a ”抗原，它的形成使病毒稳定性降低，呈现疏水性，从而有利于病毒 侵入宿主细胞胞浆；此外在生理条件下v p ln 端向外暴露有利于a 颗粒 附着于脂质体；同时v p ln 端和v p 4 结构暴露可以在细胞膜上形成孔道， 这种形态变化和结构特点有利于病毒吸附和侵入宿主细胞( 李琦涵等， 2 0 0 4 ) 。病毒通过表面凹陷的“峡谷”结构与受体n 端结合( 殷震等，1 9 9 7 ) ， 进而可以明确推论当多个受体都以此方式结合病毒时，病毒亚单位以5 对称轴形成的五聚体结构就可以和膜发生近距离结合，也就使病毒结构蛋 白v p ln 端和v p 4 插入脂膜成为可能。当然这个过程是否与d h v 吸附 侵入模式完全一致仍需要进一步的实验数据支持。 1 2 2 2 病毒核酸的复制 正链r n a 病毒基本的增殖过程是病毒利用自身核酸翻译产生病毒特 异的蛋白质产物，与此同时病毒以自身核酸为模板合成与其互补的负链 r n a ，再以此负链r n a 为模板合成子代正链r n a ，子代正链r n a 一部 分作为m r n a 一部表达病毒蛋白，另一部分作为病毒遗传物质装配到子 代病毒粒子( 殷震等，1 9 9 7 ) 。 1 2 2 3 病毒翻译及其调控机制 小r n a 病毒翻译机制具有自身的独特性，他的翻译起始过程不依赖 0 v p 4 ，完成病毒的组装。成熟的病毒粒子在细胞内的蓄积达到一定水平后 将彻底破坏细胞，释放病毒。作为同属的d h v 病毒是否也有同样的装配 机制有待于进一步的实验证明。 1 3 鸭病毒性肝炎病毒( d 肼i ) 的诊断方法 1 3 1 根据临床症状初步诊断 i 型鸭肝炎病毒所引起的鸭肝炎症状，其潜伏期为l - 2 d 。该病流行 过程短促，发作和传播快，一旦发生，发病率急剧上升，短期内即可达到 高峰，死亡常在4 5 d 发生，随即迅速下降以至终止，这是由于潜伏期 及病程短，而雏鸭易感性又随日龄增长而下降所致。雏鸭发病初，精神委 顿，废食，眼半闭呈昏睡状，以头触地，不久即出现神经症状，运动失调 身体倒向一侧，两脚痉挛踢动，死前头向背部扭曲，呈“脚弓反张”状态并 于出现此症状后几小时或十几分钟死亡。 1 3 2 根据病理剖检变化诊断 病毒性肝炎死鸭体况良好，被毛外观亦较好，喙端和爪尖淤血而呈暗 紫色。剖检病变主要在肝脏，表现为肿大、质脆、色暗淡或发黄，表面有 大小不等的出血斑或出血点。其他器官表现为，胆囊肿胀呈长卵圆形，内 充满胆汁，胆汁呈褐色、淡茶色或淡绿色；脾有时肿大呈班驳状；多数病 1 0 山东农业大学硕士学位论文 历肾肿胀，灰暗色，血管明显呈暗紫色的树枝状；日龄较大的小鸭可能继 发有细菌性败血症的变化，如传染性浆膜炎、沙门氏菌病等。最急性死亡 的可能无任何明显病变，诊断时须多剖检一些死鸭。 1 3 3 病原学诊断 病毒性肝炎在流行病学和临床症状上的特点是仅发生在3 周龄以下 的雏鸭，成年鸭不见发病；该病发病急、传播迅速、病程短、死亡率高， 病鸭有明显的神经症状。剖检变化主要表现在肝脏的变性和出血，根据以 上特点可作出初步诊断。进一步的确诊需在实验室进行病毒的分离鉴定， 基本过程如下： ( 1 ) 病料采集 无菌采集典型患病雏鸭肝脏病料，无菌环境低温保存作为分离材料。 ( 2 ) 病料处理 将肝脏病料剪碎、磨细，用灭菌生理盐水或p b s 液稀释重悬反复冻 融三次，离心，取上清液加入青霉素、链霉素使之浓度为2 0 0 0 i u m l ，作 为病毒分离接种材料。 ( 3 ) 胚胎接种 将病毒分离材料接种于1 0 1 4 日龄易感鸭胚( 杜平等，1 9 8 5 ；h g r f l h r l t lp u r c h a s ee ta 1 ，1 9 9 3 ) 或8 1 1 日龄鸡胚6 - - 1 0 枚，每胚绒尿腔接种 毫升0 2 m l 。鸭胚一般2 4 - - 9 6 h 后死亡；鸡胚死亡差异较大，较不稳定， 通常在接种后2 - 6 d 死亡。胚胎特征性病变是胚体生长停滞。全身皮肤和 皮下充血、出血。腹部和股部皮下发生水肿，尿囊液增多和变为淡绿色， 肝脏肿大，呈淡绿色，或红黄色，表面有淡黄色的坏死灶。死亡时间较长 的胚胎中，尿囊液明显变绿，肝脏病变和胚胎发育受阻更加明显。 ( 4 ) 易感雏鸭接种 用病毒分离材料或感染鸭胚鸡胚尿囊液接种l 7 日龄易感雏鸭5 1 0 只，皮下或肌肉注射，0 2 m l 只，接种后2 4 h 开始发病和死亡，并具 有典型临诊症状和病理变化。 ( 5 ) 细胞培养 将病毒分离材料接种于单层鸭胚肝细胞，室温吸附1 5 m i n ，加入细胞 营养液于3 7 c 细胞培养箱中培养观察，本病毒能引起细胞变圆等病变。 1 1 d h v - i 单克隆抗体的制各与胶体金试纸条的研制 1 3 4 血清学诊断 ( 1 ) 血清中和试验：用已知阳性血清中和分离的d h v 后，接种1 7 日龄易感雏鸭或1 0 - 1 4 日龄鸭胚，接种量为1 0 m l 只或0 2 m l 胚，同 时设置阳性对照。观察9 6 h 内雏鸭或鸭胚死亡情况。用阳性血清中和d h v 后接种雏鸭或鸭胚的保护率为8 0 - - 1 0 0 ，而对照鸭死亡率5 0 以上。 以上两种试验实用强、特异性高，但所需时间较长，是目前用于诊断或血 清流行病学调查的常规方法。 ( 2 ) e l i s a 检测d h v 抗原或抗体：应用抗d h v 的单抗进行e l i s a 夹心法，可用于鉴定鸭胚或鸡胚的d h v 分离物。应用e l i s a 和间接 e l i s a 法检测d h v 抗体，是一种敏感、快速、准确而简便实用的方法。 ( 3 ) d o t - e l i s a 诊断d h v ：应用单抗直接检测病死雏鸭肝、鸭胚 及鸡胚尿囊液中d h v 的斑点，是一种微量、快速、特异、简便的诊断方 法。 ( 4 ) 胶体金免疫电镜技术检测d h v 强毒和弱毒，具有简便、快速、 灵敏、直观等特点，可作为检测d h v 的常规方法。 ( 5 ) s p a 协同凝集试验快速检测d h v 应用s p a 协同凝集试验 检测d h v ，具有高度特异性。人工感染强毒致死雏鸭肝脏病料检出率为 1 0 0 ，q l 7 9 疫苗毒株致死鸡胚尿囊液的检出率为1 0 0 。强毒样品中含 毒量需达1 0 0 0 l d 5 0 0 2 m l ( 1 日龄雏鸭) 时才出现阳性；弱毒疫苗样品中需 含1 0 0 0 0 l d 5 0 0 2 m l ( 9 日龄鸡胚) 才出现阳性。该法具有特异、简便、快 速、敏感等优点，特别适合于临床应用及实践中对疫苗含毒量的检测。 1 3 5 分子生物学诊断 随着分子生物学技术的飞速发展，以及对研究的不断深入，已经建立 起检测d h v 的分子生物学方法。杨奎利等( 1 9 9 6 ) 用构建的文库制备了 e d n a 探针用于检测d h v ，其敏感性比d o t e l i s a 高2 0 0 倍，探针能与 不同毒株的核酸杂交，检出量达l p g 水平。a n e h u nc 等( 2 0 0 8 ) 根据获 得的i 型鸭病毒性肝炎病毒r n a 聚合酶基因序列，应用而p r e m i e r5 0 软 件设计了一对引物，建立了检测d h v - i 的r t - p c r 方法。该法能从 d i - i v - i 中扩增到4 4 0 b p 的条带，而对正常鸭胚尿囊液、健康鸭肝、鸭瘟 1 2 山东农业大学硕士学位论文 病毒、番鸭细小病毒、鹅细小病毒、雏鹅新型病毒性肠炎病毒、禽流感病 毒( h 5 n 2 亚型) 、鸭病毒性肿头出血症病毒、鸭源多杀性巴氏杆菌的扩增 结果均为阴性。该法最低可检测到3 0 p g 的d h v - i 核酸模板，是一种具 有广泛应用前景