（植物学专业论文）玉米脱水素基因zmdhn2b和rab17的分离与功能分析.pdf

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g l u c u r o n i d a s e p 一葡糖醛酸酶 i p t g i s o p r o p y l t h i o p d g a l a c t o s i d e异丙基一p - d 硫代半乳糖苷 j aj a s m o n a t e 茉莉酸 k m k a n a m y c i n卡那霉素 l bl u r i a b e r t a n im e d i u m l b 培养基 m d a m a l o n d i a l d e h y d e 丙二醛 m o p s 3 ( n - m o r p h p l i n o ) p r o p a n e s u l f o n i c3 - n 吗啉代丙磺酸 m i 己n a m e s s a g er n a信使r n a m s m u r a s h i g ea n ds k o o gm e d i am s 培养基 n a 3 p 0 4 s o d i u mp h o s p h a t e 磷酸钠 n a a cs o d i u ma c e t a t e醋酸钠 n o s n o p a l i n es y n t h a s e胭脂碱合成酶 n p t i i n e o m y c i np h o s p h o t r a n d f e r a s e i i新霉素磷酸转移酶1 1 0 2 s u p e r o x i d er a d i c a l 超氧阴离子自由基 p a g e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 p b s p h o s p h a t eb u f f e r磷酸缓冲液 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应 p e g p o l y e t h y l e n e聚乙二醇 p nn e t p h o t o s y n t h e t i cr a t e 净光合速率 p o dp e r o x i d a s e过氧化物酶 p r op r o l i n e脯氨酸 p si i p h o t o s y s t e mi i 光系统i i 英文缩写英文名称 中文名称 p v p p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e 聚乙烯吡咯烷酮 r i f r i f a m p i c i n 利福平 r n a s e ar i b o n u c l e a s ea核糖核酸酶a 印m r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e转分钟 i u p c r r e v e r s e t r a n s c r i p t a t i v ep c r 反转录p c r s a s a l i c y l i ca c i d 水杨酸 s d s s o d i u md o d e c y ls u l f a t e十二烷基硫酸钠 s d s p a g e s d s p o l y - a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 s o d s u p e r o x i d ed i s m u t a s e 超氧化物歧化酶 s s d n a s a l m o ns p e r md n a鲑精d n a t e ir i s h c i ，e d t ab u f f e r i r i s h c l 、e d t a 缓冲液 t e m e d n ，n ，n ，n - t e t r a m e t h y le t h y l e n e d i a m i n e n ，n ，n ，n 四甲基乙二胺 确s t t r i s h y d r y x y m e t h yl a m i n o m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 u vu l t r a v i o l e t ： 紫外线 w tw i l dt y p e野生型 5 - 溴- 4 - 氯一3 一吲哚d d - 半 x g a l5 - b r o m o - 4 - c h l o r o 一3 i n d o l y l 佃- g a l a c t o s i d e 乳糖苷 c t n a a q - n a p t h a l e n ea c e t i ca c i d q 萘乙酸 y e p y e a s te x t r a c ta n dp e p t o n em e d i u my e p 培养基 目录 中文摘要1 a b s t r a c t 3 l 引言6 1 1 逆境胁迫与植物应答6 1 2 胚胎发育晚期丰富蛋白8 1 3 脱水素1 2 1 4 本研究的目的及意义2 8 2 材料与方法。2 9 2 1 实验材料2 9 2 2 实验方法3 3 2 2 1 植物材料总r n a 的提取3 3 2 2 2e d n a 第一条链的合成3 4 2 2 3c d n a 纯化3 5 2 2 4 玉米脱水素z m d h n 2 b 、r a b l7 基因全长的分离3 5 2 2 5o v e r 。l a pp c r 扩增m r a b l7 、d r a b l7 片段3 7 2 2 6 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化3 8 2 2 7 碱法小量提取质粒d n a 3 8 2 2 8 质粒d n a 的酶切鉴定3 9 2 2 9d n a 序列测定3 9 2 2 10n o r t h e m 杂交分析4 0 2 2 1 l 农杆菌介导的遗传转化4 3 2 2 1 2 农杆菌介导的烟草转化4 6 2 2 13 转基因植株的p c r 检测4 6 2 2 1 4z m d h n 2 b 、r a b l 7 的原核表达及抗体制备4 8 2 2 1 5w e s t e r nb l o t 检测蛋白表达5 1 2 2 1 6 洋葱表皮亚细胞定位_ 5 3 2 2 1 7 烟草种子萌发实验5 3 2 2 1 8 低温、高盐、干旱处理下烟草幼苗生长实验5 4 2 2 1 9 大肠杆菌存活率实验5 4 2 2 2 0 转基因烟草植株生理指标测定5 4 3 结果与分析5 6 3 1 玉米叶片脱水素z m d h n 2 b 基因的分离与序列分析5 6 3 1 1z m d h n 2 b 片段的分离5 6 3 1 2z m d h n 2 b 基因编码蛋白序列分析5 6 3 1 3z r n d h n 2 b 与其它物种的s k 3 型脱水素比较5 7 3 1 4z m d h n 2 b 的亲水性和跨膜结构分析5 8 3 2z m d 肋坨b 的染色体定位预测5 9 3 3z m d h n 2 b 的原核表达载体构建6 0 3 4z m 姗b 的原核表达及重组蛋白纯化6 1 3 5 目的蛋白的免疫及效价测定6 2 3 6 锄d 朋忱6 在玉米不同器官中的表达分析6 2 3 7 玉米z m d h n 2 b 在蛋白水平对低温和渗透胁迫的响应6 4 3 8 胁迫条件下过表达z m d h n 2 b 对大肠杆菌存活率的影响6 4 3 9 表达载体构建与转基因烟草的转化6 7 3 1 0 转锄d 删2 6 基因烟草的鉴定6 7 3 1 1 过表达锄删6 增强了转基因烟草种子对低温的抗性6 8 3 1 2 过表达历删6 未增强转基因烟草幼苗对干旱和高盐的抗性6 9 3 1 3 过表达锄删6 提高了转基因烟草幼苗对低温的抗性7 0 3 1 3 1 过表达z m d h n 2 b 提高了转基因烟草幼苗对1 5 温度的抗性7 0 3 1 3 2 过表达z m d h n 2 b 提高了转基因烟草幼苗对4 。c 低温的抗性7 1 3 1 4 过表达劢删6 提高了转基因烟草壮苗对低温的抗性7 1 3 1 4 1z m d h n 2 b 在转基因烟草中的蛋白表达模式分析7 1 3 1 4 2 低温处理下转基因和野生型烟草的电解质外渗的变化7 l 3 1 4 3 低温处理下转基因和野生型烟草m d a 含量的变化7 2 3 1 4 4 低温处理下转基因和野生型烟草超氧阴离子自由基的变化7 3 3 1 4 5 低温处理下转基因和野生型烟草可溶性糖含量和脯氨酸含量的变化7 3 3 15z m d h n 2 b g f p 融合蛋白的亚细胞定位7 4 3 1 6 玉米脱水素r a b l 7 基因的分离与序列分析7 5 3 1 6 1r a b l 7 基因的分离7 5 3 1 6 2r a b l 7 、厕胱6 编码蛋白的进化树分析7 6 3 1 6 3r a b l 7 的亲水性及跨膜结构分析7 7 3 1 7r a b l 7 的原核表达载体构建7 7 3 1 8m r a b l 7 突变片段、掀动7 缺失片段的获得7 8 3 1 9r a b l 7 、d r a b l 7 、m r a b l 7 的原核表达、蛋自纯化及抗体制备7 9 3 2 0r a b l7 、搬如j7 、m r a b l7 的烟草转化及鉴定8 0 3 2 0 1 载体构建与转基因烟草的p c r 鉴定8 0 3 2 0 2 转基因烟草的w e s t e r nb l o t 鉴定81 3 2 l 转r a b l 7 、d r a b l 7 、m r a b l 7 基因烟草种子对干旱胁迫的响应8 2 3 2 2 转r a b l7 、积动f7 、m r a b l7 基因烟草种子对盐胁迫的响应8 3 3 2 3 逆境胁迫下过表达r a b l 7 、d r a b l 7 、m r a b l 7 对转基因烟草幼苗的保护作用8 4 3 2 3 1 渗透胁迫下过表达r a b l7 、d r a b l7 、m r a b l 7 对转基因烟草幼苗的保护作 用8 4 3 2 3 2 盐胁迫下过表达r a b l7 、d r a b l7 、m r a b l7 对转基因烟草幼苗的保护作用 8 5 3 2 3 3 冷胁迫下过表达r a b l 7 、d r a b l 7 、m r a b l 7 对转基因烟草幼苗的保护作用 8 1 ； 3 2 4 渗透胁迫下过表达r a b l 7 , d g a b l 7 、m r a b l 7 对转基因烟草壮苗的保护作用8 7 3 2 4 1 渗透胁迫下过表达r a b l 7 、d r a b l 7 、m r a b l 7 对转基因烟草叶片的电解质 外渗和m d a 含量的影响8 7 3 2 4 2 渗透胁迫下过表达r a b l7 、d r a b l7 、m r a b l7 对转基因烟草净光合速率的 影响。8 8 4 讨论。9 0 4 1 玉米脱水素基因历仍劢怩6 和r a b l7 9 0 4 2 玉米脱水素基因z m d h n 2 b 的表达调控9 0 4 3z m d h n 2 b 在玉米中的蛋白表达模式9 1 4 4z m d h n 2 b 的功能研究9 2 4 5r a b l 7 的功能研究9 4 5 结论9 5 i i i 参考文献9 7 墅谢11 6 攻读学位期间发表论文情况1 1 7 i v 山东农业大学博士学位论文 中文摘要 干旱、低温和盐渍等非生物胁迫是影响植物生长发育的重要因素，植物在受到这些 胁迫信号刺激后，会产生一系列响应蛋白来保护细胞代谢，而脱水素( d e h y d r i n s ) 属于 胚胎发育晚期丰富蛋白( 1 a t ee m b r y o g e n e s i sa b u n d a n tp r o t e i n s ，l e a ) 的第2 家族成员。 它具有高度无序结构，可在植物种子发育晚期或植物受到干旱、低温和盐渍或a b a 处理 时大量表达。脱水素具有广泛的生物学功能，如防止细胞脱水；结合到含有酸性磷脂的 膜脂囊泡上以稳定细胞膜；结合金属离子；清除羟基自由基；防止脂膜过氧化和保护冷 敏感性酶活性；直接参与植物的冷适应过程或作为分子伴侣等。 本研究从玉米叶片中分离到2 个脱水素基因z m d h n 2 b 和r a b l7 ，并通过o v e r l a pp c r 的方法获得了r a b l 7 突变及缺失片段。利用n o r t h e r nb l o t 和w e s t e r nb l o t 方法，研究了 在各种非生物胁迫条件下z m d h n 2 b 转录体与蛋白的表达情况。并对获得的t 2 代转基因 烟草纯合体，在逆境胁迫条件下进行种子萌发、根系伸长以及各种生理指标的测定。主 要结果如下： 1 通过r t - p c r 的方法从玉米叶片中分离到2 个脱水素基因z m d h n 2 b ( g e n b a n k 注册 号：f j 4 3 6 4 0 7 ) 和r a b l 7 ( g e n b a n k 注册号：d q 8 5 1 5 9 0 ) 。蛋白序列分析发现这2 种蛋 白具有高亲水性。同源序列比较发现，z m d h n 2 b 编码的蛋白序列与水稻、大麦、拟南 芥中的s k 3 型脱水素序列同源性最高；r a b l 7 与大麦中的多个y 2 s k 2 型脱水素具有较 高的同源性。 2 对玉米幼苗进行干旱、高盐、低温、h 2 0 2 及a b a 处理，提取叶片总r n a 进行n o r t h e m 杂交，结果表明，正常生长状态下z m d h n 2 b 仅有极少量表达；以上各种胁迫均能诱导 z m d h n 2 b 基因的表达。其中低温和高盐对玉米z m d h n 2 b 基因的表达影响最为明显，能 迅速诱导z m d h n 2 b 表达且在4 8 h 内有2 个表达高峰；在4 8 h 内z m d h n 2 b 基因的表达受 a b a 、干旱、h 2 0 2 诱导持续升高，h 2 0 2 诱导效果最弱。低温处理条件下，z m d h n 2 b 主 要在茎和叶中表达，根中表达量较低。 3 构建了原核表达载体p e t - z m d h n 2 b ，并在大肠杆菌b l 2 1 中表达融合蛋白，诱导纯化 后免疫小白鼠，制备抗体。过表达z m d h n 2 b 并没有提高大肠杆菌对各种胁迫的抗性。 w e s t e r n 杂交分析表明，z m d h n 2 b 蛋白在玉米幼苗叶片中受低温诱导，且检测到2 条特 异条带，可能存在翻译后修饰作用。 4 构建了表达载体p r o k i i z m d h n 2 b ，转化烟草( n c 8 9 ) 。分别在基因组、m r n a 和 玉米脱水素基因z m d h n 2 b 和r a b l 7 的分离与功能分析 蛋白质水平上鉴定了6 个株系的转基因烟草。以表达量高的t 2 6 、表达量中等的t 2 7 、 表达量低的t 2 1 4 株系作为后续研究对象。 5 低温条件下，过表达z m d h n 2 b 基因的转基因烟草种子比野生型烟草种子萌发率高； 干旱和高盐胁迫条件下，过表达z m d h n 2 b 基因的转基因烟草幼苗与野生型烟草幼苗长 势基本一致：低温条件下，过表达z m d h n 2 b 基因的转基因烟草幼苗比野生型烟草有更 好的长势( 主根长、叶片数多等) 。 6 低温条件下，转z m d h n 2 b 基因烟草的丙二醛含量，电解质外渗以及产生的超氧阴离 子自由基( 0 2 。) 比野生型烟草低，可溶性糖和脯氨酸含量比野生型烟草高，说明过表达 z m d h n 2 b 基因提高了转基因烟草对低温胁迫的抗性。 7 将p b i l 2 1 z m d h n 2 b g f p 融合蛋白在洋葱表皮细胞中瞬时表达。结果表明， z m d h n 2 b g f p 蛋白定位于整个细胞中，在细胞膜边界以及细胞质和细胞核中均有表达。 8 利用o v e r 1 a pp c r 方法定点突变r a b l 7 基因片段，使之翻译蛋白中的磷酸激酶结合位 点突变( m r a b l 7 ) 或y 片段缺失( d r a b l 7 ) ，测序结果表明，已经获得了3 种不同基因 型片段。将3 种基因片段分别转入烟草中，p c r 和w e s t e r nb l o t 结果表明3 种片段已经成 功转入烟草，且在蛋白水平能正确翻译各自蛋白。 9 正常m s 培养基上，转3 种片段( r a b l 7 、m r a b l 7 、积动j 7 ) 的转基因烟草种子与野 生型烟草种子发芽情况基本相同，但在含有甘露醇或氯化钠的m s 培养基上，转r a b l 7 或d r a b l 7 烟草种子比野生型烟草种子发芽时间明显推迟；转m r a b l 7 烟草种子比野生型 烟草种子发芽时间有所提前；转d r a b l 7 烟草种子与转r a b l 7 烟草种子发芽时间相同。 1 0 两类烟草幼苗在甘露醇、氯化钠和低温胁迫下生长均受到抑制，但野生型烟草受抑 制程度最大，过表达3 种基因片段( r a b l 7 、m r a b l 7 、d r a b l 7 ) 的转基因烟草幼苗均减 轻了胁迫对它们的伤害，且3 种基因片段在保护幼苗的贡献上无明显差异。 1 1 渗透胁迫条件下，过表达3 种基因片段( r a b l 7 、m r a b l 7 、出动j 7 ) 的转基因烟草 壮苗的丙二醛含量、电导率均低于野生型烟草，光合速率和蒸腾速率均明显高于野生型 烟草，说明过表达3 种基因片段( r a b l 7 、m r a b l 7 、搬动j 7 ) 的转基因烟草增强了对渗 透胁迫的抗性，且3 种基因片段在保护烟草壮苗的贡献上也无明显差异。 关键词：玉米；脱水素；功能分析；转基因烟草；逆境胁迫 2 山东农业大学博士学位论文 i s o l a t i o na n df u n c t i o n a la n a l y s i so fd e h y d r i ng e n e s ，z m d h n 2 b a n dr a b l 7i nz e am a y s a b s t r a c t a b i o t i cs t r e s s e ss u c ha sd r o u g h t ，l o wt e m p e r a t u r ea n dh i g hs a l i n i t ya r ei m p o r t a n tf a c t o r st o i n f l u e n c ep l a n tg r o w t ha n dd e v e l o p m e n t t h e s es t r e s ss i g n a l sc a ns t i m u l a t ep l a n tt op r o d u c ea s e r i e so fr e s p o n s e dp r o t e i nt op r o t e c tc e l lm e t a b o l i s m d e h y d r i n s ( d u n s ) ，as u b f a m i l yo f g r o u p 2l e a ( 1 a t ee m b r y o g e n e s i sa b u n d a n t ) p r o t e i n s ，a r eaf a m i l yo fi n t r i n s i c a l l y u n s t r u c t u r e dp l a n tp r o t e i n st h a ta c c u m u l a t ei nt h el a t es t a g e so fs e e dd e v e l o p m e n ta n di n v e g e t a t i v e t i s s u e ss u b j e c t e dt ow a t e rd e f i c i t ，s a l i n i t y , l o wt e m p e r a t u r e ，o ra b s c i s i c a c i d t r e a t m e n t d e h y d r i n sp l a ym u l t i p l er o l e si np l a n t s ，s u c ha s ，p r e v e n t i n gc e l ld e h y d r a t i o n ， b i n d i n gt ol i p i dv e s i c l e st h a tc o n t a i na c i d i cp h o s p h o l i p i d st os t a b i l i z et h em e m b r a n e ，b i n d i n g m e t a li r o n s ，s c a v e n g i n gh y d r o x y lr a d i c a l s ，p r o t e c t i n gl i p i dm e m b r a n e sa g a i n s tp e r o x i d a t i o no r d i s p l a y i n gc r y o p r o t e c t i v ea c t i v i t yt o w a r d sf r e e z i n g s e n s r i v ee n z y m e s ，d i r e c t l yi n v o l v e di n c o l da c c l i m a t i o no ra c t i n ga sm o l e c u l a rc h a p e r o n e s i nt h i sr e s e a r c h ，w ei s o l a t e dt w od e h y d r i ng e n e s ，z m d h n 2 ba n dr a b l7 , f r o ml e a v e so f m a i z e ，a n dg a i n e dm u t a n t e da n dd e l e t e dv e r s i o no fr a b l7b yo v e r - l a pp c r z m d h n 2 bg e n e e x p r e s s i o na n dp r o t e i na c c u m u l a t i o nw e r ea l s oi n v e s t i g a t e db yn o r t h e mb l o ta n d w e s t e mb l o t ， r e s p e c t i v e l y w e a l s o g a i n e dh o m o z y g o t et 2g e n e r a t i o n o ft r a n s g e n i ct o b a c c o s e e d e r m i n a t i o n a n do t h e r ) h y s i o l o g i c a ) a r a m e t e r s 。t h et r a n st o b a c c ow eregermination r o o tg r o w t ha n do t t a e rp l a y s l o l o g l c a lp a r a m e t e r so tm et r a n s g e m c ， t e s t e du n d e rs t r e s sc o n d i t i o n s t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 w ei s o l a t e dt h ed e h y d r i ng e n e s ，z m d h n 2 b ( g e n b a n kn u m b e r ：f j 4 3 6 4 0 7 ) a n dr a b l7 ( g e n b a n kn u m b e r ：d q 8 5 15 9 0 ) f r o ml e a v e so fm a i z eb yr t - p c r p r o t e i ns e q u e n c e a n a l y s i ss h o w e dt h et w op r o t e i n sa r eh i g hh y d r o p h i l i c h o m o l o g o u sc o m p a r i s o nr e v e a l e d z m d h n 2 bs h o w e dh i g hh o m o l o g o u sw i t ht h es k 3 - t y p ed e h y d r i n so fo r y z as a t i v a 、 h o r d e u mv u l g a r ea n da r a b i d o p s i st h a l i a n a t h er a bl7s h o w e dh i g hh o m o l o g o u sw i t hs o m e y 2 s k 2 - t y p ed e h y d r i n so fh o r d e u mv u l g a r e 2 t h ey o u n gs e e d l i n g so fm a i z ew e r et r e a t e dw i t hd r o u g h t ，s a l t ，l o wt e m p e r a t u r e ，h 2 0 2a n d a b a t o t a lr n a sw e r ee x t r a c t e da n dn o r t h e r nb l o tw a sc a r r i e do u t 1 1 1 er e s u l t ss h o w e d t h a tz m d h n 2 be x p r e s s i o nw a sv e r yl o wu n d e rn o r m a lc o n d i t i o nb u tw a si n d u c e du n d e r s t r e s st r e a t m e n t s t h ei n d u c t i o ne f f e c t so fl o wt e m p e r a t u r ea n dn a c lw e r em o s to b v i o u s a n dt h e r ew e r et w oe x p r e s s i o np e a k sd u r i n g4 8 h a b a ，d r o u g h ta n dh 2 0 2a l s oi n d u c et h e e x p r e s s i o no fz m d h n 2 ba n d t h et r a n s c r i p t si n c r e a s e dc o n t i n u o u s l yd u r i n g4 8 h ，t h ee f f e c t o fh 2 0 2w a sw e a k e s t u n d e rl o wt e m p e r a t u r e ，z m d h n 2 bm a i n l ye x p r e s s e di nm a i z e s t e m sa n dl e a v e sa n dw e a k l ye x p r e s s e di nr o o t s r e c o m b i n a n tp e t ，z m d h n 2 bv e c t o rw a sc o n s t r u c t e df o rp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o na n d e x p r e s s e di ne c o l i b l 21 t h ef u s i o np r o t e i nw e r ep u r i f i e da n du s e dt oi m m u n i z ew h i t e m i c et oo b t a i na n t i s e r u m e x p r e s s i o no fp e t z m d h n 2 bi nec o l id i dn o te n h a n c ei t s t o l e r a n c et oe n v i r o n m e n t a ls t r e s s w e s t e r nh y b r i d i z a t i o nr e v e a l e dt w op o s i t i v ep r o t e i n b a n d sc o r r e s p o n d i n gt oz m d h n 2 bi nm a i z el e a v e sw h e ne x p o s e dt ol o wt e m p e r a t u r e ， w h i c hm a yb ed u et ot h em o d i f i c a t i o no fz m d h n 2 bp r o t e i n t h ef u l l 1 e n g t hz m d h n 2 be d n aw a sc l o n e di n t ot h ee x p r e s s i o nv e c t o rp r o k i ia n d t r a n s f o r m e di n t ot o b a c c o ( n c 8 9 ) t h es i xl i n e so fz m d h n 2 b - o v e r e x p r e s s i n gt o b a c c o w e r ev e r i f i e da tt h el e v e lo fg e n o m e ，m r n aa n dp r o t e i n h i g h - a c c u m u l a t i o nl i n et 2 - 6 ， i i m e d i a t e a c c u m u l a t i o nl i n et 2 7a n dl o w - a c c u m u l a t i o nl i n et 2 - 1 4w e r es e l e c t e df o r f u r t h e ru s e 5 c o m p a r e dt o t h ew i l d - t y p et o b a c c o ，z m d h n 2 b - o v e r e x p r e s s i n gs e e d sh a v eah i g h e r g e r m i n a t i o nr a t ea tl o wt e m p e r a t u r e t h e r ew e r en od i f f e r e n c e s i ng r o w t hb e t w e e nt h e t r a n s g e n i cs e e d l i n g s a n d w i l d t y p es e e d l i n g s u n d e rd r o u g h ta n dn a c ls t r e s s e s z m d h n 2 b o v e r e x p r e s s i n gs e e d l i n g sg r o w nv i g o r o u s l y ( i nm a i n - r o o t l e n g t ha n dt h e n u m b e ro fl e a v e s ) t h a nt h ew i l dt y p es e e d l i n g sa tl o wt e m p e r a t u r e 6 u n d e rl o wt e m p e r a t u r e ，z m d h n 2 b o v e r e x p r e s s i n gt o b a c c os h o w e dl o w e rm d a c o n t e n t ， e l e c t r o l y t el e a k a g ea n ds u p e r o x i d er a d i c a l ( 0 2 - ) h o w e v e r ，t h es o l u b l es u g a r sa n dp r o l i n e c o n t e n t si nz m d h n 2 b o v e r e x p r e s s i n gt o b a c c ow e r eh i g h e rt h a nt h a ti nw i l d 。t y p e t h e s e r e s u l t si n d i c a t e do v e r e x p r e s s i o no fz m d h n 2 bi nt o b a c c oc o u l de n h a n c et h ea b i l i t yt o e n d u r el o wt e m p e r a t u r e 7 t h ef u s i o np r o t e i np b i121 一z m d h n 2 b - g f pw a se x p r e s s e dt r a n s i e n t l yi no n i o ne p i d e r m i s t h er e s u l ts h o w e dz m d h n 2 bl o c a l i z e di nt h ew h o l ec e l l ，c l