（病原生物学专业论文）肺炎支原体多抗原表位表达载体的构建与鉴定.pdf

目录 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要4 二、英文缩略语7 三、论文 前言，8 刚舌” 材料与方法9 实验结果1 6 讨论2 3 结论2 5 四、本研究创新性的自我评价2 6 五、参考文献2 7 六、附录 综述2 8 在学期间科研成绩3 8 致谢3 9 个人简介4 0 中文论著摘要 肺炎支原体多抗原表位表达载体的构建与鉴定 刖再 i i , g ：支原体( m y c o p l a s m ap n e u m o n i a e ，m p ) 是人类原发性非典型肺炎的病原体， 无细胞壁，其引起感染的治疗与其它细菌和病毒感染有所不同，因此，m p 感染诊 断意义重大。m p 细胞表面的粘附蛋白( 如p 1 ，p 1 1 6 等) 能与宿主细胞受体结合， 为m p 致病的重要因素，也是引起机体免疫反应的主要免疫原，应用重组蛋白抗原 检测临床标本，有较高的特异性和敏感性。国内外已有人成功构建了m pp 1 蛋白 的表达载体。为了增加重组蛋白的抗原表位，提高诊断的敏感性，本研究经p c r 点突变技( t g a - - - ，t g g ) 获取m p1 1 6 蛋白目的基因，构建克隆载体，并与原实验室 构建的p g e x 6 p 1 p 1 表达载体重组，构建肺炎支原体多抗原表位表达载体，从 克隆株中提取纯化重组蛋白，经w e s t e r nb l o t t i n g 鉴定融合蛋白的免疫反应性，为 研制更有效的肺炎支原体基因工程诊断试剂奠定基础。 方法 1 、m pd n a 的制备 按本实验室常规方法进行。 2 、p c r 点突变扩增m p1 1 6 目的基因 根据g e n b a n k 提供的m p1 1 6 蛋白基因( 2 4 6 卜3 0 5 1 ) 序列，通过引物分析软 件p r i m e r 5 0 和o l i g 0 6 设计引物，上游引物序列：5 - t t t t g g a t c c t t c a a a g 触隗a c 朋r c c a a g t g 3 ( b a m l ) ，下游引物序列：5 a t a t g a 筒盯c t t t g a a g c c c a t g t c a g t a a a g 3 ( e c o r i ) ，突变引物片：列：5 g a c c t t t g g t t g t r l a a g a ”陌g g c c w 姨g t t c 3 。p c r 扩增突变片段，加2 0 9 m 的突变引物和下游引物以 及1 0 0 n g 模板，反应总体积5 0 9 l ，9 5 。c5 m i n x l ；9 5 c3 0 s ，5 5 c3 0 s ，7 2 。c4 0 s x 3 0 ： 7 2 c l o m i n x l 。回收突变片段，以此做引物扩增目的基因，加入2 0 9 m 上游引物 和1 0 0 n g 模板，9 5 。c5 m i n x l ；9 5 cl m i n ，6 5 。cl m i n ，7 2 0 cl m i n x 3 2 ；7 2 c1 0 m i n x l 。 1 0 琼脂糖凝胶电泳鉴定。 3 、m p 克隆载体p m d t - 1 1 6 的构建与鉴定 将回收的目的基因和p m d t 载体连接，转入e e o l ij m l0 9 。通过氨苄青霉素 平板筛选阳性克隆株。质粒提取试剂盒抽提阳性克隆株的重组质粒，p c r 扩增及 酶切后电泳鉴定。插入的基因序列由南京金思特科技公司测定，并与g e n b a n k 提 供的f h 株肺炎支原体p 1 1 6 核苷酸序列进行同源性比较。 4 、m p 多抗原表位表达载体p 1 p 1 1 6 的构建与鉴定 从克隆株中提取纯化重组质粒，b a m h i 、e c o r i 双酶切后进行琼脂糖凝胶电 泳，回收目的片段，与b a m h i 、e c o r i 双酶切的p g e x 6 p 1 p 1 表达载体( p 1 表 达载体为e c o r i 、x h o i 双酶切构建) 连接，转入e c o l ij m l 0 9 。氨苄青霉素平板 筛选转化子，提取纯化重组质粒，质粒酶切图谱和p c r 扩增鉴定。 5 、重组蛋白基因表达的检测与鉴定 重组质粒p 1 p 1 1 6 转入e c o l ib l 2 1 中，将阳性克隆株培养菌液接种于含氨苄 青霉素( 1 0 0 9 9 m 1 ) 的l b 液体培养基中，3 7 。c 振荡培养过夜。离心收集菌体沉淀， 转接至2 0 0 m l a m p l b 中，3 7 。c 振荡培养3 0r a i n ，加入i p t g 至终浓度0 5 m m o l l ， 诱导表达2 h 。离心收集菌体沉淀。冰裕超声破碎，离心后取上清用g l u t a t h i o n e s e p h a r o s e4 b 纯化g s t - p 1 p 11 6 融合蛋白。s d s p a g e 分析表达产物的相对分子 量，免疫印迹实验鉴定其免疫反应性。一抗为兔抗m p 全茵抗体，二抗为羊抗兔 i g g h r p 。 结果 1 、p l l 6 目的基因片段的扩增与鉴定 p c r 扩增的突变引物片段为1 7 6 b p ，扩增的目的基因片段为5 9 7 b p ，经1 o 琼脂糖凝胶电泳鉴定，扩增产物与理论值大小基本相符。 2 、p m d t - 11 6 重组质粒鉴定 以p m d i - 1 1 6 为模板，p c r 扩增出单一条带，长度与预期一致，p m d 1 - 1 1 6 用b a m h i 、e e o r i 双酶切，产生2 7 k b 和0 6 k b 两个片段。插入基因片段与已知的 p 1 1 6 核苷酸序列进行比较，除突变碱基外，其余完全一致。 2 3 、m p 表达载体的构建与鉴定 以重组质粒为模板，p c r 扩增出单一条带，长度与预期一致。重组质粒用 b a m h i 、e c o r i 双酶切产生0 6 k b 和5 8 k b 两个片段，用e c o r i 、x h o i 双酶切产生 0 9 k b 和5 5 k b 两个片段，用b a m h i 、x h o i 双酶切产生1 5 k b 和4 9 k b 两个片段。 4 、重组蛋白抗原性检测 经诱导后表达相对分子质量( m r ) 为8 1k d a 的融合蛋白，与预期的m r 大小一 致。w e s t e r nb l o t t i n g 结果显示，兔多价抗血清与纯化的融合蛋白在8 1 k d a 处形成 了一条特异的抗原一抗体反应条带。 结论 1 、本实验经p c r 点突变( t g a t g g ) 获取m p1 1 6 蛋白目的基因片段。 2 、构建了p 1 p 1 1 6 双蛋白多抗原表位的表达载体，转入大肠杆菌内，可稳定 地表达融合蛋白。 3 、w e s t e r nb l o t t i n g 证明表达的8 1 k d a 的融合蛋白具有免疫反应性。 关键词 肺炎支原体；蛋白抗原；基因克隆；p 1 1 6 3 英文论著摘要 t h ec o n s t r u c t i o na n di d e n t i f i c a t i o no f m u l t i e p i t o p e e x p r e s s i o nv e c t o ro fm y c o p l a s m ap n e u m o n i a e - i n t r o d u t i o n m y c o p l a s m ap n e u m o n i a e ( m p ) i s t h ep a t h o g e no fh u m a np r i m a r y a t y p i c a l p n e u m o n i a i t st h e r a p yi sd i f f e r e n tf r o mo t h e rb a c t e r i u ma n dv i r u sb e c a u s ei th a s n tc e l l w a l l t h e r e f o r e ，i ti sv e r yi m p o r t a n ta b o u tt h ed i a g n o s eo fm r t h ea t t a c h m e n tp r o t e i n s o nt h es u r f a c eo fm p ( e g p1 、pll6 ) c a nc o m b i n ew i t ha c c e p t o ro fh o s tc e l ls ot 1 1 e ya r e i m p o r t a n tf a c t o ro fp a t h o p o i e s i sa n dm a j o ri m m u n o g e n i th a sh i g h e rs p e c i f i c i t ya n d s e n s i b i l i t yt h a tu s i n gr e c o m b i n a t i o np r o t e i nt od e t e c tc l i n i c a ls a m p l e s t h ee x p r e s s i o n v e c t o r so fm pp1p r o t e i nw e r ec o n s t r u c t e d f o rr a i s i n ge p i t o p e so ft h er e c o m b i n a t i o n p r o t e i na n d t h es e n s i b i l i t yo ft h ed i a g n o s eo fm p , i nt h i sr e p o r tw et a k ed e s t i n a t i o ng e n e o fm p116p r o t e i nw i t h g e n em u t a t i o no fp c rt o c o n s t r u c tc l o n i n gv e c t o r , a n d r e c o m b i n a t ei tw i t he x p r e s s i o nv e c t o rp g e x - 6 p 一1 一p1w i t c hw a sc o n s t r u c t e db yf a c i l i t y t oc o n s t r u c tm p m u l t i - e p i t o p ee x p r e s s i o nv e c t o r t h er e c o m b i n a t i o np r o t e i ni se x t r a c t e d a n dp u r i f i e da n di d e n t i f i e db yw e s t e r nb l o t t i n g i tc o u l de s t a b l i s hb a s i so fm p d i a g n o s i s r e a g e n t m e t h o d s 1 p r e p a r a t i o no fa m p l i f i c a t i o nt e m p l a t e i ta c c o r dt ot h em e t h o dd e s c r i b ep r e v i o u s l yb yu s 2 a m p l i f i c a t i o no fd e s t i n a t i o ng e n eo f 咿1 16p r o t e i nw i t hg e n e m u t a t i o no fp c r 1 1 1 ep r i m e r sa r ed e s i g n e db yp r i m e r 5 0a n do l i g 0 6a c c o r d i n gt o116g e n e s e q u e n c e s ( 2 4 6 7 3 0 51 ) i ng e n b a n k p r i m e ro fu p s t r e a m ：5 - t t t t g g a t c c t t c a a ag a t a a c a t c c a a g t g - 3 ( b a m i ) p r i m e ro fd o w n s t r e a m ：5 - a r a t g a a t t c t t t g a a g c c c a t g t c a g t aa a g 一3 ( e c o r i ) p r i m e ro fm u t a t i o n ：5 - g a c c t t t g g t t g t t t a a g a r t t g g c c t a a g t t c - 3 m u t a t i o nf r a g m e n t sp c rw a sp e r f o r m e di na5 0 9 l r e a c t i o nm i x t u r ec o n t a i n i n g2 0 9 m p r i m e ra n dlo o n gd n at e m p l a t e p c ra m p l i f i c a t i o n 4 w a sd o n eu n d e rt h ef o l l o w i n gc o n d i t i o n s ：d e n a t u r a t i o na t9 5 c5 m i n xl ，9 5 c3 0 s ，5 5 。c 3 0 s ，7 2 4 0 s x 3 0 ，7 2 lo m i n x 1 m u t a t i o nf r a g m e n tw a sr e c l a i m e da so t h e rp r e m e r d e s t i n a t i o ng e n e sp c rw a sp e r f o r m e di na5 0 9 lr e a c t i o nm i x t u r ec o n t a i n i n g2 0 p m p r i m e ra n d10 0 n gd n at e m p l a t e p c ra m p l i f i c a t i o nw a sd o n eu n d e rt h ef o l l o w i n g c o n d i t i o n s ：d e n a t u r a t i o na t9 5 5 m i n x l ，9 5 l m i n ，6 5 l m i n , 7 2 l m i n x 3 2 ，7 2 lo m i n x1 t h ea m p l i c o nw a si d e n t i f i e db y1 o a g a r o s eg e l 3 c o n s t r u c t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fm pc l o n i n gv e c t o rp m d t 1 16 d e s t i n a t i o ng e n ew a sc o n n e c t e d 、历mp m d tv e c t o ra n dt r a n s f o r mt oe c o l i j m10 9 t h e nm a s c u l i n ec l o n ew a sa s s a y e do nl u r i a b e r t a n i p l a t e sc o n t a i n i n g a m p i c i l l i na n de x t r a c t e db yk i t ，c o n f i r m e db yp c ra m p l i f i c a t i o na n dr e s t r i c t i o ne n z y m e a n a l y s i s j i ns it ec o m p a n yd e t e r m i n e dn u c l e o t i d es e q u e n c eo fr e c o m b i n a n t p l a s m i d i tc o m p a r e dh o m o l o g yw i 廿l p116 g e n eo fm pf hs t r a i na c c o r d i n g t o g e n b a n k 4 c o n s t r u c t i o no f 口m u l t i - e p i t o p ee x p r e s s i o nv e c t o rp1 一p1 16 e x t r a c t i n ga n dp u r i f y i n g r e c o m b i n a n t p l a s m i d r e c o m b i n a n tp l a s m i da n d e x p r e s s i o nv e c t o rp g e x - 6 p 一1 - p1 ( e c o r l 、x h o i ) w e r ed i g e s e db yb a m h 1 、e c o r la n d c a r r yo u ta g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i st or e c l a i md e s t i n a t i o nf r a g m e n t s t h e yc o n n e c t e d t o g e t h e ra n dt r a n s f o r mt oe c o l ij m 10 9 m a s c u l i n ec l o n ew a sa s s a y e do nl u r i a - b e r t a n i p l a t e sc o n t a i n i n ga m p i c i l l i n a n de x t r a c t e da n dp u r i f i e d ，c o n f i r m e db yp c r a m p l i f i c a t i o na n dr e s t r i c t i o ne n z y m ea n a l y s i s 5 d e t e c t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fr e c o m b i n a t i o np r o t e i n e x p r e s s i o nv e c t o rp 1 - p116w a st r a n s f o r m e dt oe c o l ib l 21 b a c t e r i af l u i do f m a s c u l i n ec l o n ew a sc u l t i v a t e di nl bm e d i u mc o n t a i n i n ga m p i c i l l i n ( 10 0 9 # m 1 ) u n d e r 3 7 o v e r n i g h t b a c t e r i ap r e c i p i t a t i o nw a sc o l l e c t e db yc e n t r i f u g ea n dt r a n s f o r mt o 2 0 0 m la m pl bt oc u l t i v a t eu n d e r37 。ci n3 0 m i n t h e na d d i n gi f t gt o0 5 m m o l l ， i n d u c t i n g2 h b a c t e r i ap r e c i p i t a t i o n w a sc o l l e c t e db yc e n t r i f u g ea n db r e a k e db y s u p e r s o u n di ni c e f u s i o np r o t e i nw a sp u r i f i e db yg l u t a t h i o n es e p h a r o s e4 b r e l a t i v e m o l e c u l a rw e i g h ta n di m m u n i t yw e r ei d e n t i f i e db yw e s t e r nb l o t t h ef i r s ta n t i b o d yi s s e r u mo fr a b b i tw h i c hw a si m m u n i z e db ym e t h es e c o n da n t i b o d yi si g g - h r pw h i c h i sa i m e da tt h ef i r s ta n t i b o d y 5 r e s u l t s 1 a m p l i f i c a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no f 116d e s t i n a t i o ng e n e t h ep c rp r o d u c to fm u t a t i o nf r a g m e n ti s17 6 b p t h ep c rp r o d u c to f116 d e s t i n a t i o ng e n ei s5 9 7 b p t h e ya r ec o r r e s p o n d 、析t 1 1r e f e r e n c ev a l u e 2 i d e n t i f i c a t i o no fp m d t - 116c l o n i n gv e c t o r t h ec l o n i n gv e c t o rc o n t a i n i n gt h eo b j e c tg e n ef r a g m e n tw a su s e da st h et e m p l a t et o p c r a m p l i f i c a t i o n w eo b t a i n e dab a n do ft h es a m em o l e c u l a rw e i g h ta st h ei n s e r tg e n e f r a g m e n t c l o n i n gv e c t o rw a sd i g e s t e dw i t hb a m h l 、e c o r le n z y m ea n dg e n e r a t e d t w o2 7 k ba n d0 6 k bb a n d s t h eo b j e c t g e n ef r a g m e n t i ss a l t l e 谢t ha m i n oa c i d s e q u e n c e so fm pp 116e x c e p tm u t a t i o nb a s i cr a d i c a l 3 c o n s t r u c t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fm p e x p r e s s i o nv e c t o r t h ee x p r e s s i o nv e c t o r c o n t a i n i n gt h eo b j e c tg e n ef r a g m e mw a su s e da s t h e t e m p l a t et op c ra m p l i f i c a t i o n w eo b t a i n e dab a n do ft h es a m em o l e c u l a rw e i g h ta s t h ei n s e r tg e n ef r a g m e n t e x p r e s s i o nv e c t o rw a sd i g e s t e dw i t hb a m h l 、e c o r le n z y m e a n dg e n e r a t e dt w oo 6 b pa n d5 8 k bb a n d s ，d i g e s t e d 晰t l le c o r l 、x h o ie n z y m ea n d g e n e r a t e dt w o0 9 b pa n d5 5 k bb a n d s ，d i g e s t e d 嘶t l lb a m h 1 、x h o ie n z y m ea n d g e n e r a t e dt w o1 5 k ba n d4 9 k bb a n d s 4 d e t e c t i o no f a n t i g e n i c i t yo f r e c o m b i n a t i o n p r o t e i n t h et h e o r e t i c a lm o l e c u l a rm a s so ft h ep r o t e i nw a sc a l c u l a t e dt ob e81k d ab y s d s - p a g e i ti si d e n t i c a lt ot h et h e o r yv a l u e w e s t e r nb l o t t i n gs h o w st h a ta n t i m p p o l y c l o n a la n t i b o d i e sr e a c t e dt oam a j o rb a n d 、析t ham o l e c u l a rm a s so f81k d a c o n c l u t i o n i t h i sd e s t i n a t i o n g e n e o fm p116 p r o t e i n w a st a k e n b yg e n e m u t a t i o n ( t g a t g g ) o fp c r 2 d o u b l ep r o t e i nm u l t i - e p i t o p ee x p r e s s i o nv e c t o rp1 - - p116w a sc o n t r u c t e da n d s h i r e di ne c o l it oe x p r e s s e ds t e a d i l yf u s i o n p r o t e i n 3 w e s t e r nb l o t t i n gc o n f o r m e dt h a t81k d ae x p r e s s i o np r o t e i no fr e c o m b i n a n t c l o n er e a c t e dt oa n t i m pp o l y c l o n a la n t i b o d i e s k e vw o r d s m y c o p l a s m ap n e u m o n i a e ；e p i t o p e ；g e n ec l o n i n g ；p 116 6 英文缩略语 7 论文 肺炎支原体多抗原表位表达载体的构建与鉴定 刖昌 肺炎支原体( m y c o p l a s m ap n e u m o n i a e ，m p ) 是人类原发性非典型肺炎的病原 体，还可引起及其他呼吸道感染性疾病甚至机体其它组织疾病【l 】。由于m p 无细 胞壁，故其引起感染的治疗与其它细菌和病毒感染在治疗方法上有所不同，因此， m p 感染的病源学诊断对于疾病的及时正确治疗有重要意义。 目前检测肺炎支原体的方法虽然很多，但仍缺乏更为快速简易可靠的方法。 血清学检测以检测不同种类的抗体为基础，是目前m p 感染诊断应用较为广泛的 一种方法。但是常规血清学诊断方法所用抗原系由完整的支原体成分制备，而支 原体难以大量培养，抗原制备困难，而且m p 细胞膜上的糖脂抗原与其它微生物 及机体组织存在非特异交叉反应，血清学检测易出现假阳性【2 】。为解决m p 感染 血清学诊断抗原的问题，应用基因工程的方法克隆m p 蛋白抗原基因，从克隆株 中提取纯化蛋白作抗原，用于m p 感染的诊断，可以提高敏感性和特异性【3 】。m p 细胞表面的p 1 、p 1 1 6 粘附蛋白是肺炎支原体与宿主细胞受体结合的主要粘附蛋白， 为m p 致病的重要因剥3 1 ，也是刺激机体产生免疫反应的主要免疫原。1 7 0 k d a 的 p 1 蛋白含有多个抗原决定簇，可在肺炎病人中引起强烈的免疫反应1 4 ，是m p 免 疫诊断的优选抗原。目前国内外已有人成功构建了m p p l 蛋白的表达载体1 5 , 6 】，用 其检测临床标本，与全茵抗原相比，有较高的特异性和敏感性。但是p 1 粘附因子 和生殖支原体1 4 0 k d a 蛋白之间有共同抗原，与真核生物结构蛋白也有一定同源 性，所以用完整的肺炎支原体菌体成分或完整的p 1 蛋白作抗原易出现非特异性交 叉反应，而且p 1 黏附蛋白的羧基端仅含有三个预测抗原表位，相对于全菌抗原来 说抗原表位仍少。p 1 1 6 蛋白为含有1 0 3 0 个氨基酸的m p 表面蛋白，也具有黏附 特性和免疫反应性，其与生殖支原体之间的免疫交叉反应低【_ 7 1 。选取p 1 1 6 蛋白特 异抗原表位区作为目的基因，与含有p 1 蛋白抗原表位的表达载体重组，将会增加 重组蛋白的特异抗原表位，用于临床研究，有望提高诊断的敏感性和特异性。 8 本研究在原实验室的研究工作基础之上，经p c r 点突变技术( t g a - - * t g g ) 获 取m p1 1 6 蛋白目的基因，构建了m pp 1 p 1 1 6 双蛋白多抗原表位表达载体，这种 双蛋白多表位重组体的成功表达，将会为研制特异、敏感的肺炎支原体诊断试剂 奠定基础。 材料和方法 一、实验材料 l 、质粒和菌株 m pf h 株、大肠杆菌由实验室保存，表达载体p g e x 6 p 1 p 1 由原实验室制 各。 2 、主要试剂 t a qp c r 试剂盒、b a m h i 酶、e c o r i 酶、t 4 d n a 连接酶、d n a 凝胶回收试 剂盒、质粒提取试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司；g l u t a t h i o n es e p h a r o s e4 b ； 羊抗兔i g g h r p 。 3 、引物 根据g e n b a n k 提供的m p l l 6 蛋白基因序列，通过引物分析软件p r i m e r 5 ，0 和 o l i g 0 6 设计3 条引物。 4 、主要仪器 p c r 扩增仪，低温高速离心机，垂直及水平凝胶电泳设备，超声粉碎仪，l g1 5 一w 型高速台式离心机，振荡混合仪，g d s 8 0 0 0 型凝胶成像仪，h h w 2 1 c u 6 0 0 型电热恒温水温仪，超净工作台，冰箱，3 7 c 培养箱。 二、实验方法 ( 一) 目的基因的制备 1 、d n a 模板的制备 将m pf h 菌株接种于7 0 m lh a y f l i c k s 培养基，3 7 c 培养7 2 h ，判断生长良 好后，吹打瓶壁混匀培养物，4 。c1 0 ，0 0 0 r p m 离心2 0 m i n ，弃上清。用p b sb u f f e r 洗涤沉淀3 次，离心，弃上清后，沉淀用2 7 m lp b sb u f f e r 悬起。加入0 3 m l1 0 s d s 和1 0 0 9 9r n a s e ，3 7 。c 孵育3 0 m i n 。用平衡酚抽提3 次，再用氯仿一异戊 9 醇抽提1 次，吸取上清，沉淀自然干燥，用1 0 0 1 a l t e b u f f e r 溶解d n a 。取5 “l 电 泳，检测提取的d n a 浓度，- - 2 0 冻存备用。 2 、p c r 点突变获取目的基因 ( 1 ) p c r 扩增p 1 1 63 端突变片段 p c r 反应条件为：9 5 5 m i n x l ；9 5 3 0 s ，5 5 3 0 s ，7 2 4 0 s x 3 0 ； 7 2 1 0 m i n x l 。反应体积为5 0 1 x l ( 如表1 所示) 。 1 琼脂糖凝胶电泳鉴定：称取0 3 9 a g a r o s eg e l ，加入3 0 m l1 t a eb u f f e r ， 加热溶解。铺板，在溶解好的凝胶中加入终浓度为0 5 1 a g m l 的溴化乙锭水溶液， 待胶凝固后，将凝胶放入盛有电泳液的槽中。取5 l 扩增产物与载体缓冲液混合 并加入凹孔中。以d n a m a r k e r d l 2 0 0 0 作分子量对照，8 0 v 电泳3 0 m i n 后，分析 p c r 扩增情况。 回收p c r 产物： 吸取p c r 反应液4 0 i - t l ，加6 0 i t ld h 2 0 ； 加入5 0 1 a l 平衡酚，5 0 _ t l 氯仿，10 ，0 0 0 r p m ，5 m i n ，离心； 吸取上层水相10 0 i - t l ； 加入1 0 i - t l3 mn a c l ，混匀，再加2 0 0 p 1 冷无水乙醇，混匀，1 2 ，0 0 0 r p m ， 1 0 m i n ，离心，弃上清，干燥； 沉淀溶于2 0 1 a ld h 2 0 中。 ( 2 ) p c r 扩增m p1 1 6 目的基因片段 p c r 反应条件为：9 5 5 m i n l ；9 5 1 m i n ，6 5 1 m i n ，7 2 l m i n x 3 2 ；7 2 1 0 m i n x l 。反应体积为5 0 i t l ( 如表2 所示) 。 1 琼脂糖凝胶电泳鉴定：称取0 3 9a g a r o s eg e l ，加入3 0 m llx t a eb u f f e r ， 加热溶解。铺板，在溶解好的凝胶中加入终浓度为o 5 咖l 的溴化乙锭水溶液， 待胶凝固后，将凝胶放入盛有电泳液的槽中。取2 0 t l 扩增产物与载体缓冲液混合 并加入凹孔中。以d n a m a r k e r d l 2 0 0 0 作分子量对照，1 0 0 v 电泳4 0 m i n 后，分 析p c r 扩增情况。并割下含有目的基因片段的凝胶条，用d n a 凝胶回收试剂盒 进行目的片段的回收，具体操作参照d n a 凝胶回收试剂盒附带的说明书。 1 0 表1 ，p c r 扩增p 1 1 63 端突变片段反应体系 m p d n a 2 9 l 10 x p c rb u f f e r 5 9 l d n t p $ 4 u l 引物2 ( 3 端引物，6 8 1 u n o l o )3 p l 引物3 ( 突变引物，6 8 r t m o l 1 )3 p l d i - 1 2 0 3 2 5 9 l t a q 酶0 5 9 l t o t a l 5 0 9 l 表2 ，p c r 扩增m p1 1 6 目的基因片段反应体系 口d n a 1 0 x p c rb u 艉r d n t p s 引物1 ( 5 端引物，6 8 9 m o l 1 ) 回收p c r 产物 d h 2 0 t a q 酶 t o t a l 表3 ，p c r 反应引物 2 9 l 5 9 l 4 9 l 8 9 l 2 0 i _ t l l o g l l “l 5 0 9 l 引物序列p c r 产物大小 下游引物5 a t a t g a a t t c t t t g a a g c c c a t g t c a g t a a a g - 3 ( e c o r i ) 突变引物5 g a c c t t t g g t t g t r t a a g a m g g c c t f 认g t t c 3 上游引物5 肼g g a t c c t t c a a a g a t a a c a t c c a a g t g - 3 ( b a m i ) 大引物回收突变片段 1 7 6 b p 5 9 7 b p ( 二) m p1 1 6 克隆载体的构建与鉴定 l 、e c o l ij m l 0 9 感受态菌的制备 将e e o l ij m l 0 9 菌株接种于5 m l l b 液体培养基中，3 7 。c 过夜培养，按1 接 种于2 0 m ll b 培养基中，3 7 c 振荡培养3 h 。4 0 0 0 r p m ，离心1 0 m i n ，弃上清。菌 体沉淀加入1 0 m l4 。c 预冷的7 5 m m o l lc a c l 2 溶液，轻柔吹打菌悬液，冰浴3 0 m i n 。 4 0 0 0 r p m ，离心1 0 m i n ，弃上清。菌体沉淀加入2 6 7m l4 。c 预冷的7 5 m m o l lc a c l 2 溶液，冰浴4 h 。4 保存。 2 、克隆载体的构建 l m le p 管中加入：p m d t v e c t o rl g l ，目的片段回收产物8 9 l ，s o l u t i o n 9 1 x l 1 6 4 5 m i n ； 加入1 0 0 9 l 感受态菌，冰浴3 0 m i r a 4 2 水浴4 5 s ，冰浴l m i m 加入5 0 0 9 ll b ，3 7 。c 震荡培养6 0m i n ，涂四块a m pl b 琼脂平板，3 7 。c 过 夜培养。 挑取平板上单个菌落，接种于5 m l 含氨苄青霉素的l b 液体培养基( 1 0 0 9 9 r r d ) 中，3 7 。c 培养过夜，用质粒提取试剂盒提取重组质粒，具体操作参照质粒提取 试剂盒附带的说明书。 3 、克隆载体鉴定 ( 1 ) 酶切指纹图谱鉴定 将提取的p m d t - 1 1 6 重组质粒和p u c l 9 载体进行酶切，如表4 加样： 表4 ，克隆载体酶切鉴定 3 7 水浴l h ，6 5 。c 水浴1 0 m i n ，4 。c 8 m i n 终止反应。l 琼脂糖凝胶电泳检测。 ( 2 ) p c r 扩增鉴定 以提取的p m d t - 1 1 6 重组质粒为模板，p c r 扩增插入片段。 1 2 p c r 反应条件为：9 5 5 m i n x l ；9 5 l m i n ，6 5 l m i n ，7 2 l m i n x 3 2 ：7 2 1 0 m i n x l 。反应体系为5 0 9 l ，如表5 所示。l 琼脂糖凝胶电泳鉴定。 表5 ，p m d t - 1 1 6p c r 扩增： p m d - t - 11 6 1 0 p l 1 0 x p c rb u f f e r 5 1 a l d n t p s 4 9 l 引物1 ( 6 8 t t m o l l ) 8 9 l 引物2 ( 6 8 1 u n o l l ) 8 9 l d h 2 01 4 9 l taq酶lg l t o t a l 5 0 9 l 4 、重组质粒d n a 测序鉴定 南京金思特科技公司测定p m d t - 1 1 6 重组质粒的核苷酸序列，与g e n b a n k 提 供的f h 株肺炎支原体p 1 1 6 基因序列进行同源性比较。 ( 三) m p 多抗原表位表达载体的构建与鉴定 l 、p 1 p 1 1 6 的构建 ( 1 ) 酶切，如表6 加样。 表6 ，p 1 p 1 1 6 构建 3 7 。c 水浴l h ，6 5 。c 水浴1 0 m i n ，4 。c 8 m i n 终止反应。1 琼脂糖凝胶电泳检 测，用d n a 凝胶回收试剂盒回收p m d t - 1 1 6 重组质粒酶切片段( 即目的基因片 段，电泳中5 9 7 b p 片段) 和p g e x