（微生物学专业论文）几丁质酶产生菌的筛选、发酵条件与酶法制备几丁寡糖的研究.pdf

摘要 几丁寡糖是指n 乙酰葡萄糖胺以b 1 ，4 键连接的2 l o 聚合度的几丁低聚糖。 几丁寡糖具有许多独特的功能性质，如水溶性、保湿性、抗菌性、抗肿瘤和免疫促 进性等。尤其是在医药、保健食品和化妆品方面显示其特异功能。其中几丁六糖活 性最明显，其次是五糖、四糖、三糖和二糖，因此对几丁质进行降解制备几丁寡糖 的研究具有重大的意义。 本研究以海南、福建两省沿海虾蟹养殖场采集的土样为供试材料，采用平板透 明圈法筛选出8 株具有明显水解几丁质能力的菌株。通过d n s 法测定酶活，复筛得 到s g 0 5 ，s g 0 7 ，s g l 2 ，s g l 9 四株菌株，酶活较高而且稳定。通过薄层色谱与高 效液相色谱分析，发现s g 0 5 菌株能降解几丁质为3 5 聚合度不等的几丁寡糖。 对s g 0 5 菌株的发酵条件进行优化，确定产几丁质酶发酵培养基的最佳组成是： k 2 h p 0 4o 0 7 ，k h 2 p 0 4o 0 3 m g s 0 4 7 h 2 0o 0 5 f e s 0 4 7 h 2 00 0 0 2 胶体几 丁质0 2 ( 干重) ，n a c lo 3 ，酵母膏o 2 ，p h 6 5 。最佳的发酵条件为：8 0 m l 忽5 0 n 正 三角瓶中接种培养2 4 h 的种子液5 ，在3 0 ，1 8 0 印m 发酵4 8 h 后酶活力可达 o 8 5 u m l 。该几丁质酶是一种诱导型的胞外酶。 对s g 0 5 菌株几丁质酶粗酶液的性质进行了研究。其最适温度为3 6 ，最适p h 为6 o ，酶在4 8 以上易失活，但在p h 5 o 7 o 的环境中比较稳定。 经1 6 sr d n a 序列分析、形态和生理生化鉴定，初步确定s g 0 5 菌株为召臼c f ，淞 s p 4 关键词：几丁寡糖，几丁质酶，筛选，发酵 a b s t r a c t 8b a c 矧2 l ls t r a i n s 丽t l lk 曲c t l i t i n a s ea c t i v 畸w e r ei s o l a t e d 丘o ms o i l s 锄p l e s c o l l e c t e d 舶ms h r i m pn u r s e r i e si i lh a i l l a n 觚df q i a n p r 0 v i n c e s b yt l a y e rc h r o m a t o 伊印h 锄dh 谫p e 怕肌a i l c el i q u i dc h r o m a t o 鲫h y 锄a l y s e s ，m es 缸ns g 0 5w a sf o u n dt 0h y d r o l y z ec h i t i nt oc m t o o l i g o s a c c h 撕d e ss u c h 嬲 c t l i t o 仃i s a c c h 撕d e ，c 1 1 i t o t e 臼的s a c c h a r i d e ，c l l i t o p e m o s a c c h 撕d e t h eo p t i m a lm e d i u mf o rt l l ec 1 1 i t i n 勰ea c t i v i t ) ro fs 仃 妇s g 0 5w a s 嬲f o l l o w s ：2 ( w ，y ) c o l l o i d a l c l l i t 氓o 2 y e a s te x 饥哦，0 0 7 k 2 h p 0 4 ，0 0 3 k h 2 p 0 4 ， o 0 5 m g s 0 4 7 h 2 0 ，0 0 0 1 f e s 0 4 。7 h 2 0 ，0 3 n a c l ，p h6 5 5 ( v v ) o ft l l es e e d 、懈 i n o c u l a t e di i l2 5 0 m ln a s kc o m a i l l i n g8 0 m lb r o t l l ，a 1 1 di n c u b a t e df o r4 8 h o u r sa t3 0 ， 18 0 r r l l i n ，a 1 1 dt 1 1 ec l l i t i n 嬲ea c t i v i t ) ro ff e r m e n t e db r o mc o u l dr e a c h0 8 5u 】疆1 1 t kc l l i t i l l a s e 舶ms g 0 5 、) l ，嬲觚i n d u c i b l e ，e x t r a c e l l u he n z y m e ，锄dw 勰s t a b l ei n 也ep h 姗g eo f5 0 7 0a n d 呻r a t u r eu 1 1 d e r4 8 i t so p t i m a lt e m p e r a 饥a n dp hf o r c l l i t i nh ) 怕l y s i sw e r e3 6 肌d 6 0 ，r c s p e c t i v e l y b yl6 sr 【) n as e q u e n c e 锄m y s i sc o m b i n e dw i t hm o 印h o l o 西c a l 趾dp h y s i o l o g i c a l _ b i o c h e i i l i c a l 觚a l y s e s ，m es 仃a j l ls ( 沁5w 嬲i d e n t i f i e da s 砌c 脚淞互p k e yw o r d s ：c h i t o o l i g o s a c c l l a r i d e s ，c m t i n a s e ，i s o l a t i o 玛f e 咖c n t a t i o n 海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所星交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究【作所取得的成 果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品或 成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结 果由本人承担。 论文作者签名：旁尹争 日期咖穷年占月l 日 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家 有势部门或机构送交论文的复印件和电子版。允许论文被查阅和借阅。本人授权海南大学可以将 本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复捌手段 保存和汇编本学位论文。本人在导师指导下完成的论文成果，知识产权归属海南大学。 保密论文在解密后遵守此规定。 、 ：苏乡牟 一名：膨人久 日期：加夕年香月f 7 日日期：弘智年占月f f 日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的学位论文提 交“c a l i s 高校学位诊文全文数据库一中全文发布，并可按搿章程”中规定享受相关权益凰塞 迨塞堡銮亘澄厦；酸生i 旦= 玺i 旦三生苤巍 论文作者签名： 苏户李 日期：锣多年6 月f ，日 导师签 日期： 恢旧 l 前言( i n t r o d u c t i o n ) 1 。1 本研究的目的及重要意义 几丁质( c l l i t i n ) 又名甲壳素，聚乙酰氨基葡萄糖等，于1 8 1 1 年由法国学者 h b r a c 0 衄o t ( 布拉克诺) 从蘑菇中首先发现，估计自然界年生物合成的量有近1 0 0 亿吨 之多，仅次于纤维素【n ，同时几丁质也是自然界除蛋白质之外数量最大的含氮天然有 机化合物【2 1 。壳聚糖( c 1 l i t o s 锄) 则是几丁质脱去c 2 乙酰基的产物，又名脱乙酰几丁质， 可溶性几丁质，聚葡萄糖胺等，壳聚糖含有游离氨基，是天然多糖中唯一的碱性多糖。 然而由于它们分子量大，且多聚糖分子链的强烈的包裹作用和结晶区内较强o h o 型和o h - n 型氢键的作用，所以其理化性质非常稳定，溶解性也差，因此限制了它 的应用。为此，我们需要把大分子的几丁质，壳聚糖降解为水溶性好易于吸收的短链 几丁寡糖，壳寡糖，并且其更具有多种生理功能，如抗癌活性、抗真菌活性、免疫调 节和植物生长调节等作用【3 巧】。尤其是壳寡糖在人体吸收率近1 0 0 ，其功能是壳聚糖 的数十倍。这些重要的功能使几丁寡糖，壳寡糖在农业、医药和食品工业等方面具有 更广阔的应用前景和经济价值，因此，几丁低聚糖的研究尤其引起国内外的重视。研 究制备聚合度2 1 0 的几丁寡糖、壳寡糖具有意义。 1 2 几丁低聚糖的性质 几丁低聚糖( c l l i t o o l i g o s a c c h a r i d e s ) 是由几丁质和壳聚糖经降解产生的一类低聚合 度的糖类化合物。从广义上来讲，是指分子量低于1 0 ，0 0 0 的、水溶性好的低分子量 的几丁质或壳聚糖；就狭义上而言，是指聚合度为1 1 0 的寡糖。对于几丁低聚糖的 名称目前尚未统一标准化，有文献认为低聚几丁质可叫几丁寡糖 ( c k t i n 0 1 i g o s a c c h a r i d e s ) ，低聚壳聚糖可叫壳寡糖( c 硫o s a n o l i g o s a c c h a r i d e s ) ，几丁寡糖 和壳寡糖的总称为几丁低聚糖( c l l i t o o l i g o s a c c h a r i d e s ) 。 几丁低聚糖具有较高的溶解度，所以很容易被吸收利用。作为一种性能优良的可 生物降解的高分子材料，几丁低聚糖有着广阔的应用前景，同几丁质和壳聚糖这种生 物大分子相比，几丁低聚糖具有许多独特的功能性质，如水溶性、保湿性、抗菌性、 抗肿瘤和免疫促进性等。尤其是在医药、保健食品和化妆品方面显示其特异功能。其 中几丁六糖活性最明显，其次是五，四，三和二糖，氨基葡萄糖单体只有轻微的抑菌 作用【6 1 ，因此对壳聚糖进行降解制备低聚糖的研究具有重大的意义。几丁寡糖与壳寡 糖的区别也在于脱乙酰度的不同，它们的分子结构见图l 。 p h 卅硼c h 舢 h 醛l 矾西h n 弛小珏b 内h t 图1 几丁寡糖壳寡糖 f i 9 1c h i t i n o l i g o s a c c h a r i d e sc h i t o s a n o n g o s a c c h a r i d e s 1 3 几丁低聚糖的应用 1 3 1 医药领域 几丁质、壳聚糖和几丁低聚糖的化学结构中含有活性自由氨基，溶于酸后糖链上 的胺基与矿结合形成强大的正电荷离子团，有利于改善酸性体质，强化人体免疫功 能，排除体内有害物质等，维持机体正常p h 值。由于低聚糖具有抗感染、抗癌症的 效果，特别是乙酰基壳己糖( 六糖) 具有最强的活性，在抗癌新药的开发方面有较大 的前途【7 1 。另外几丁质、壳聚糖可被溶菌酶降解。溶菌酶存在于人的血、尿中。当有 某种疾患时病人则显示出高于正常值，利用这一特性，使低聚糖衍生物应用于溶菌酶 活性的临床诊断或医药、食品的质量检验部门。 1 3 2 食品领域 在食品领域的应用已开发了三种低聚糖混合物，即n 乙酰壳寡糖m 2 1 h ，n 乙 酰壳寡糖m 2 1 ，n 乙酰壳寡糖m 2 2 。几丁低聚糖具有非常爽口的甜味，可作为食品 添加剂，提高食品的保水性及水份活性。保健食品领域中壳寡糖作为自然界中唯一的 碱性多糖，生物活性高，无毒、无副作用，可被人体快速吸收。以壳寡糖为主要原料 生产的保健食品能够提高机体的免疫力，活化细胞，促进肠道双歧杆菌等有益菌的增 生，并抑制有毒菌的生成。目前壳寡糖的主要消费地在日、韩、美、法、俄等国家。 1 3 3 农业领域 在目前研究应用的植物抗病诱导子中，寡糖以其来源广泛、诱抗活性高并能调节 植物生长发育等优势，逐渐成为国内外关注热点。作为生物农药，寡糖在防病和抗病 方面有着多种机制【羽，除了作为活性信号分子，迅速激发植物的防卫反应，启动防御 系统，使植物产生酚类化合物、木质素、植保素病程相关蛋白等抗病物质，并提高与 抗病代谢相关的防御酶和活性氧清除酶系统的活性，寡糖对植物病原菌直接的抑制作 用也是其抗病的必要组成部分睁1 0 1 。低聚糖今后可以作为植物生理活性的天然新型生 物农药在农业部门获得应用。另外几丁寡糖也可以作为绿色饲料添加剂，能增强动物 2 的抗病能力，而且无毒，无副作用，避免了药物残留对畜产品品质的影响【l l 】。 1 3 4 化妆品 有较高聚合度的低聚糖具有美容、防皱、抗菌、消炎、吸湿、保湿功能，并对冻 疮、青春痘有特殊疗效，作为天然的无任何副作用的化妆品将会得到更广泛应用。 1 3 5 其他 低聚糖可作为亲和色谱法的配位体用于壳多糖酶、溶菌酶等酶类或凝集素的精 制。也可作为高速液相色谱、气相色谱等分析的标准物质或生理活性物质的合成材料。 最近又有一重要发现【1 2 1 ，利用长链烷基的酰氯将低聚糖中的羟基和伯氨基完全酰基化 所得的衍生物，可应用于新型液晶。 1 4 6 几丁低聚糖的制备 1 4 1 化学制备法 1 4 1 1 酸解法 酸对壳聚糖的解聚是一种最基本和最简单的方法。它是利用壳聚糖分子中存在众 多的游离氨基能够与溶液中氢离子结合的特点，引起壳聚糖分子间与分子内部的氢键 断裂，使分子结构舒展，而长链部分易发生糖苷键断裂，形成许多聚合度不等的分子 片段。 酸解法一般用浓盐酸水解，上世纪5 0 6 0 年代就有人【1 3 】研究过盐酸水解壳聚糖。 此法虽然工艺简单易行，但是较难控制，所得到的寡糖主要为单糖和双糖，4 糖以上 的寡糖含量非常低。此外，该方法对环境的污染也相当严重，故不够理想。1 9 9 9 年， l e e m 0 0 y e a l 等【1 4 】通过控制反应温度及反应时间来控制反应进程，以制得聚合度在 5 7 的壳寡糖。用这种方法降解壳聚糖，对环境的污染大大减少。然而，降解以后 的产品聚合物却比较高，寡糖含量很少，且产品的相对分子质量分布宽，均一性差。 产物分离纯化困难，大量应用化学试剂容易造成设备腐蚀及严重的环境污染。 而利用醋酸法制备的壳寡糖产品具有可以长期保存的优点，特别适用于食品及化 妆品寡糖的生产。此外，还可采用浓硫酸、硝酸、磷酸、氢氟酸、三氧乙酸和甲酸等 无机酸和有机酸降解几丁质制备低聚糖。 1 4 1 2 氧化降解法 氧化降解法是目前国内外研究较多的方法，其中过氧化氢( h 2 0 2 ) 氧化法更有大量 3 文献报道，h 2 0 2 氧化降解因成本低、降解速度相对较快、产品分子量低且分布窄， 对环境友好、易实现工业化而倍受国内外学者的关注。其它氧化降解方法有紫外线辐 射州) i 2 0 2 ，n a c l o h 2 0 2 ，n 出0 3 等方法。 通过在酸性、中性、碱性条件下过氧化氢对壳聚糖的氧化降解反应结果表明，采 用过氧化氢溶液，在不同反应温度、p h ，反应时间下，产品大部分为水溶性低聚糖。 邵健等在中性条件下采用过氧化氢溶液对壳聚糖进行氧化降解，制备了分子量为 1 0 0 0 左右的药用壳寡糖，讨论了不同的过氧化氢浓度、配比、温度和反应时间对降 解反应的影响【1 5 1 。李邦良等【1 6 】直接用过氧化氢溶液对高分子量，高脱乙酰化度的壳 聚糖进行非均相降解，制备了水溶性几丁低聚糖产品，进行了红外光谱结构表征，并 用高效毛细管电泳测定了寡糖的聚合度。结果表明，水解温度8 0 9 0 ，过氧化氢 浓度8 1 0 ，水解时间0 5 1 0 h 时，水溶性产品的得率为4 0 4 5 ，聚合度为 3 7 的寡糖占水解产物的3 6 5 0 ，该法制备壳寡糖是可行的，有望进行工业化 生产。 1 4 1 3 硼酸钠降解法 此法制备过程简单，所得的壳寡糖不仅溶于水，而且在二甲乙酰胺和二甲亚 砜等有机溶剂中有很好的溶解性。 1 4 1 4 化学合成法 化学合成法可以通过精心设计基质合成特殊结构的低聚糖。随着近几年糖化学的 兴起，壳寡糖的合成也日益受到研究者的关注。加内et 0 t t m a n l l 等利用几丁质酶制 备了壳聚糖和壳聚糖的杂环衍生物，而且还具有生物活性。f r i d i i l 锄m i c h a 等运用 一锅煮的方法制备了壳寡糖三糖和四糖，产率在5 1 8 0 之间。这种方法的优点 就是可以根据自己的需要来设计寡糖。但合成过程涉及基团保护和基团脱去等过程， 步骤较为复杂，主要是建立在酶反应基础上，利用低聚合度寡糖在酶参与作用下，延 长糖链成为较高聚合度的寡糖。 1 4 2 物理制备法 1 4 2 1 超声波法和微波法 在上世纪8 0 年代，我国学者王伟等【1 9 】将几丁质脱乙酰化后，溶于乙酸溶液中， 在6 0 条件下用超声波处理，发现壳聚糖溶液黏度明显下降，而同时降解过程中对 氨基的含量没有影响。微波辐射法近年来也引起了人们的研究兴趣。) ( i n g ，等【2 0 】用微 4 波辐射法来水解几丁质，改变水解时间和微波强度可以得到不同分子量的产物，在反 应液中加入少量无机盐，如n a c i ，可以有效促进水解的速度，而且产物的分子量比 不加要低，盐离子的强度变化不影响分子量，两者无相关性。 1 4 2 2 丫射线照射下辐射降解 辐射降解是在放射性射线照射下，使壳聚糖分子产生电离或激发等物理效应，进 而导致分子链断裂。李治，等【2 1 】用辐射法进行研究，用放射性钴照射相对分子质量为 2 7 4 1 0 5 的壳聚糖，当c 射线达到一定剂量时，壳聚糖分子量可降至2 万左右，而且 未破坏氨基含量，但对产物组分无明确分析结果。 1 4 3 酶降解法 酶法与其它降解方法相比具有反应条件温和、整个降解过程中无其他反应试剂加 入、不至于发生其它副反应、降解过程及降解产物相对分子质量分布易于控制、制备 的低聚糖生物活性高、产物不用除盐，不造成环境污染等优点，是较为理想的降解方 法。酶降解法有专一性酶降解法和非专一性酶降解法。迄今为止已发现有3 7 种各类 水解酶，如蛋白酶、脂肪酶、糖苷酶等，对几丁质，壳聚糖均有降解效果。现在已经 在酶的种类，酶活，酶作用机制，作用条件及效果方面进行了全面细致的研究，并利 用基因工程技术，在微生物中进行酶的克隆生产，形成了从基因序列分析到产酶菌的 发酵表达，酶蛋白的转运分泌，再到酶蛋白对底物的降解及产物收取的一系列完整过 程，逐步将酶的生产与几丁质的降解耦联起来。 1 4 3 1 专一性酶降解法 专一性水解酶是利用以壳聚糖为专一性底物的壳聚糖酶，可以高选择性地切断壳 聚糖的p ( 1 ，4 ) 糖苷键水解壳聚糖，主要包括几丁质酶、壳聚糖酶和溶菌酶。该反应 条件温和且无须大量试剂，为大规模生产壳寡糖提供了可能，是一种较为理想的制备 方法。 几丁质酶( c h i t i i 郴e ，e c 3 2 1 1 4 ) ：能特异性水解线性结构的乙酰氨基葡萄糖糖苷 键，降解几丁质，在自然界许多微生物，昆虫，植物及动物组织中都有几丁质酶的表 达，对于含有几丁质成分的组织来说，几丁质酶有重要意义，海洋环境中，几丁质酶 促进了碳和氮的物质循环，发挥重要的代谢作用，不同种属的几丁质酶具有不同的性 质，与其环境不同有关。几丁质酶是底物诱导型，产酶菌在营养充分的培养基上生长， 几丁质酶的分泌被抑制，而在补充有几丁质的基本培养基上时，大量的酶被诱导分泌。 5 壳聚糖酶( c m t o s 锄a s e ，e c 3 2 1 9 9 ) ：目前，壳聚糖酶的研究主要是在自然界中继 续筛选产酶活性较高的微生物菌种及酶最佳反应条件研究。此外，运用基因工程手段， 通过对产壳聚糖酶的基因分析，运用分子方法克隆并高效表达所选菌株的壳聚糖酶基 因，以实现重组菌的壳聚糖酶高效表达也是目前研究的重点。具体技术路线如下：根 据所选菌株壳聚糖酶基因序列或参照其他菌株的壳聚糖酶基因序列 _ p c r ( p 0 1 y m e 删s ec h a i nr e a c t i o n ，聚合酶链式反应) 引物设计，引物合成_ 提取所选菌 株总d n a - p c r 扩增获得目的基因_ 构建原核表达载体_ 壳聚糖酶高效表达。 溶菌酶：溶菌酶能降解一些微生物的细胞壁、几丁质和部分n 乙酰化壳聚糖。 溶菌酶对n 乙酰化壳聚糖的水解能力随着d a 的增加而提高，但不能催化水解9 5 d d 的壳聚糖。在大多数的哺乳动物中，几丁质的降解主要是由溶菌酶引起的。在人 乳和人体血清中也含有丰富的溶菌酶。在体内溶菌酶对壳聚糖的催化水解速度随着脱 乙酰化度的升高而降低，脱乙酰化度达到1 0 0 的壳聚糖则难于在体内被溶菌酶催化 水解。因而医用植入材料的壳聚糖脱乙酰化度控制在7 0 左右。目前，商业化溶茵 酶的生产主要来自于蛋品加工厂，这种酶在酶法规模制备几丁低聚糖中应该具有潜在 的价值。 1 4 3 2 非专一性酶降解法 专一性酶主要来源于真菌细胞，因来源有限，目前还不能大批量获取，价格昂贵， 难以商品化，所以寻找用于降解壳聚糖的非专一性酶极为重要。目前已知能降解壳聚 糖的非专一性酶有3 0 多种，包括多糖酶、脂肪酶、蛋白酶等，其中纤维素酶、半纤 维素酶、果胶酶等多糖酶的作用效果较为显著。现在单一的水解酶对壳聚糖的降解程 度有限，而且增加酶量也难以提高水解程度，现在一般都用复合酶来降解。无锡轻工 大学多年来对壳聚糖的水解进行了深入的研究，发现应用多种非专一性酶组成的复合 酶( 糖酶、蛋白酶、脂肪酶等) 对壳聚糖水解的作用。其产物的平均分子量可达1 0 0 0 0 以下，这为壳寡糖的制备开辟了一条新的途径抗肿瘤活性。z l 啪g ，等【2 2 】用纤维素 酶，a 2 淀粉酶和蛋白酶复合降解2 4 乙酰化度的壳聚糖，并与膜分离耦合使用，得 到聚合度为3 1 0 的寡糖产物，黑曲霉素来源的一种果胶酶的同功酶，具有多聚半乳 糖醛酸酶活性，在p h 3 5 条件下降解壳聚糖，得到低分子量壳聚糖，2 6 聚合度的 寡糖和单体混合物，非专一性酶的降解底物具有多样性，相互之间具有协同作用，在 实验中往往是多种酶复合应用，不能明确判定这些水解活力是由哪种酶催化。即使是 同一种酶，来源不同，活性相差也很大，例如同样是纤维素酶，有些就没有活性或只 6 有轻微的水解作用。 1 5 几丁低聚糖的分离，分析方法 1 5 1 分离方法 1 5 1 1 色谱柱分离法 色谱柱分离法是采用一定的色谱填料作为固定相，当药品提取液通过色谱柱时， 不同的成分即可得到分离。该方法操作简单，适宜于工业生产。尤其是随着高分子产 品的出现和发展，色谱填料的种类越来越多，其中以离子交换树脂、大孔吸附树脂和 聚酰胺为主。 1 5 1 1 1 薄层色谱法仃l c ) 薄层色谱法是在纸层析法的基础上发展起来的，其分辨效率高，简便易行，可在 同一块薄板上同时分析多个样品。孟显丽、陈国华等通过对各种展开剂的实验，确定 壳寡糖的薄层色谱分析条件即最佳的展开剂是v ( 乙酸乙酯) ：v ( 乙醇) ：v ( 水) ：v ( 氨 水) = 5 ：4 ：4 ：0 3 。壳寡糖溶液上行展距为8 c m ，采用浸渍法显色【2 3 。2 7 】。 1 5 1 1 2 离子交换色谱法 离子交换色谱法是近年来应用较广泛的壳寡糖分离纯化方法。曾嘉【2 8 】采用离子交换色 谱柱对降解产物进行分离，得到了聚合度为2 9 的壳寡糖。该酶促反应符合米氏动 力学方程，米氏常数为2 6 0 l g l ，v m a x 值为3 5 7 9 1 0 2 9 m i n l 。1 5 1 1 3 凝胶渗透 色谱法( g p c ) 凝胶渗透色谱法是利用流动相与控制孔径分布的固定相接触从而使溶质按分子 体积大小分离的色谱方法。刘羿君【2 9 】等用凝胶渗透色谱法研究了特种纤维素酶催化水 解过程中的分子量及其分布，制备了不同低分子量的壳寡糖，详细研究了水解温度、 p h 值、时间和酶的用量等因素对酶催化水解产物的分子量及其分布的影响。制备壳 寡糖的反应条件为壳聚糖质量分数0 0 1 ，水解温度5 8 ，p h 5 3 ，特种纤维素酶质量 分数0 。1 0 ，反应时间3 h 。 1 5 1 1 4 石墨化碳柱的高压液相色谱 与糖类高压液相色谱分析中常用的正相、反相和阴离子交换柱的分离原理不同的 是，石墨化碳柱的保留机制不仅基于填充剂与样品的疏水相相互作用，而且还包括电 子受体一供体之间的相互作用，与瑚) a e c 相比石墨化碳柱的容量更大，非常适合于 寡糖的制备性操作，而且洗脱时只要用易于除去的水容性有机溶剂即可。再由于糖类 7 分子的强亲水性，通常用o d s 柱分离时寡糖分子需要衍生化，操作复杂；而g o c 柱对非衍生化的寡糖和带有少量氨基酸残基的糖肤都获得良好的分离效果【3 0 1 。 1 5 1 2 膜分离法 膜分离法是物质透过或被截留于膜的过程，近似于筛分过程，依据滤膜孔径的大 小而达到物质分离的目的。按照分离粒子或分子大小可将膜分离法分为：反渗透、透 析、电渗析、纳滤、超滤、微滤等几种，其中反渗透和纳膜过滤最有望用于分离纯化 功能性壳寡糖。 大连化物所天然产物与工程组在结合纳滤膜技术基础上，优化其反应分离条件， 并完成中试工艺放大，建立了质量控制标准，保证了壳寡糖产品的稳定性1 3 1 弓2 1 。膜分 离法具有聚合度可控性、产物活性高及生产过程无污染等优势。 1 5 1 3 酶法 酶法是利用酶制剂将低聚糖混合物中的某一或某些组分专一性地除去。如用葡萄 糖氧化酶和过氧化物酶将低聚糖混合物中的葡萄糖氧化为葡萄糖酸，然后以葡萄糖钙 沉淀法或离子交换树脂法都很容易地将葡萄糖酸除去。此法的优点是操作简单，设备 投资少。缺点是需要调节控制料液的p h 范围，以防止料液的p h 因酶氧化葡萄糖而 降低，使之偏离酶的最适p h 范围【3 3 1 。 1 5 1 4 高效毛细管电泳法 除了少数带有羧基和磺酸基的糖类化合物，绝大多数的糖类化合物不带电荷、极 性很大而且没有发色基团或荧光基团。所以用一般的高效毛细管电泳系统无法得到分 离和检测。为了使糖类化合物能产生电迁移而得以相互分离，可采用的方法有：( 1 ) 衍生化使之带上发色、荧光基团或电荷；( 2 ) 与硼酸盐等络合；( 3 ) 与缓冲溶液中的添 加剂形成包合配合物；( 4 ) 高p h 缓冲条件下使之电离；( 5 ) 加人表面活性剂使形成胶束， 检测则可用：a 直接紫外或荧光法：b 间接紫外或荧光法：c 示差检测法；d 电流检测 法：e 质谱法。分离与检测方法的确定则由糖的性质、所存在的介质以及所使用的仪 器来决定【3 4 1 。 1 5 2 分析方法 1 5 2 1 高效液相色谱法( 1 i p l c ) 高效液相色谱法是定量分析低聚糖类及其他糖类最常用的方法，它具有快速、方 便、分辨率高、分离效果好、重现性好和不破坏样品等优点。冯国宁、钟振声等采用 8 z o r b a x 氨基柱( 2 5 0 m m 4 6 r i i i ) ，示差检测器，流动相为乙腈：水= 7 0 ：3 0 ，流速 l m l m i n ，柱温3 0 ，进料量2 0 “l 。对离子交换分离后的各个待测样品，分别取1 0 0 1 1 1 l 经浓缩样品，加双蒸水8 m l 离心后进行质量百分含量测定【3 5 】。 色谱法既可以单独使用，也可以与其它的仪器，如质谱、红外光谱、核磁共振、 脉冲安培检测器等结合，使得其对糖分析检测更加方便、精确。如高效阴离子交换色 谱一脉冲安培检测( h p a e c p a d ) 联合使用，对糖类化合物的分析检测不需要预先衍生 就能分析几乎所有的单糖和大部分的寡糖及低聚糖，这不仅节约了大量的时间和金 钱，而且避免了一些有毒的衍生试剂的使用，减少了环境污染，在组成结构大小上非 常相近的单糖也可得到很好的分离，且灵敏度很高，检测限量可达到几十个p g l 水 亚【3 6 】 -o 1 5 2 2 质谱分析( m s ) 质谱分析是分析糖结构的常用方法。邵健等在中性条件下采用过氧化氢溶液对壳 聚糖进行氧化降解，制备了分子量为1 0 0 0 左右的药用壳寡糖，并用傅立叶变换质谱 仪分析表征了产物的结构【1 5 】。 1 5 2 3 核磁共振州m r ) 核磁共振技术对寡糖及其糖链结构研究工作具有举足轻重的作用。尽管糖链中氢 谱重叠十分严重，但5 0 0 或6 0 0 m h z 的高分辨核磁共振仪能准确测定结构表征基团的 化学位移和峰宽，精度可达0 0 0 1 。糖链的各种结构特征，均可由这些结构表征基团 的微小位移变化出来。 1 5 2 4 红外和激光拉曼光谱 糖类的红外光谱很复杂，在糖链结构的分析中，虽然红外光谱能提供的结构信息 不多，但它能提供一些糖环上取代基及异头碳为a - 或b 异头构型的信息。如糖环上的 硫酸基团，在8 2 0 8 5 5 c m 处及1 2 3 0 c m 附近有特征吸收。激光拉曼光谱的波数范围 与红外光谱的波数范围相似，但前者的灵敏度和分辨率比红外光谱高，近来的研究有 一定的进展，但还不能提供比红外光谱更多有规律性的结果。 1 6 微生物几丁质酶的研究概况 1 6 1 产几丁质酶的微生物来源 1 9 0 5 年，b e n e c k e 首次分离到能够利用几丁质作为营养物质的微生物，定名为溶 几丁质芽孢杆菌( b a c i l l u sc l l i t i n o v i r o u s ) 。1 9 2 1 年，f o l p m e 瑙发现分解几丁质的细菌和 9 放线菌，证明水溶性几丁质酶的存在，o 然后，人们相继又发现了许多产几丁质酶的微 生物种类，包括细菌、放线菌、真菌等，其中对s e m t i 锄a r c e s c e n s 、s t r 印t o - m y c e s p l i c 舭 及v i b r i o 【l i l i f i c u s 【3 7 4 1 1 的研究较多。包括酶的理化性质、作用机理及纯化方法等方面 都做了大量工作。 表1 目前研究较多的产几丁质酶的微生物 t h b l e1s o m em i c r o o r g a n i s mo fp r o d u c i n gc h i t i n a s e 种群 细菌： 沙霭氏菌属岱e 盯o t i 由s m 翻e s c e 船，s 1 i q t l 咖c i e 船 芽孢杆菌属忸a c n h 砖b 1 i c h e n 咖r m i s ，b c i r c t l l 锨s ，b s n 幢g a 气e m m ，b s l l b n l ， b a l v e i 交替单胞菌属“抛聊d 坍傩) 彳够s 肌砌一7 假单胞菌属( p s e u d o m o n 硒) p 船州g 栩傩口， z 肌口的砷诫口，只曲咖计f 肠杆菌属( e n t e r o b a c t e r ) e 砸0 9 z d 坍p 聊拈，层，f g 材咖c 妇珊，e 互p g j 气单胞菌属研e r o m o 玎傩) 丘砂蚴玎f c l ， 彳c 口v f c 陀， 彳麟缈西d p 矗妇 弧菌属( 矽砀阳) 砌d 叼西，形1 ，l 砌乏7 铅埘，弧朋细甜 梭茵属 l o s t r i d t 埘nc 1 p a 唧l l r 妤c t 辨，c 1 p e 咖i n g e 凇， c 1 t h e r m o c e h 姗t 小球菌属( c d c c 翮d 玉如s ) c 砌m i 黄单胞菌属a 砌加肌册傩) x 置印 紫色杆菌属刀历加d 6 口c 五已腑册) z 伽触堋 金龟子绿僵菌洲匆砌忱z 如彻眦，d 加p ) 放线菌 链霉菌属岱缸e p t o 玳) c e d 。s i o l i v a c e o v i r i a i s s 1 p l i c a l 凇s 1 1 i v i d a 凇s | 1 口、，e n d m 口e s i g r i s e 凇 & c o e l e s c e n s 1 c o e l c o l o 瓦s 1 t h e r m d v i o l a c e 懈s t s p 3 迅4 s 1 p r a s i n o p i l o s t l s 1 c e l l l 如露鳓岱 s 1 1 6 e 孙d h l 真菌 曲霉属似印p 恻l l u s t 踟a r i o 卸矗硼仃，彳够口，) 黝p ，彳踢刀砘f 锄 白僵菌属( 6 眩口z n ，已，妇6 z s i c z ，l 口) 木霉属( 弦而砌d 如，册口加幅蛔l l 册) 死j l 口栩砌z 朋 根霉属哪) 足d 玩聊娜 酵母属( 鼢矗口m 7 ，l 胂砷融c 翻忉裔妇，黝q 加西姗册 假丝酵母属( q 珊磙如) c 棚缸 病毒 p b c ，1tc p g y ，h q s n p y l o 1 。6 2 产几丁质酶微生物的筛选方法 传统的筛选方法主要有两种，一是在胶体几丁质琼脂培养基上看透明圈的大小及 清晰程度；二是水解几丁质荧光类似物的方法。这两种方法的优点是快速直观，缺点 是透明圈法选得的是那些能分泌并扩散至周围环境中的几丁质酶，对胞内酶产生菌不 能被检出：而水解类似物法只简单地反映了降解小分子寡聚物的能力，至于这些酶是 否能水解大分子几丁质却不得而知。最近一些几丁质酶的基因测序工作已完成【4 2 “3 1 ， c o t 吮1 1 根据其保守序列，用p c r 方法从不可培养的海洋微生物中筛选到了一批几丁 质酬4 4 1 ，从而拓宽了筛选方法和筛选渠道。另外，筛选方案也多种多样，应根据实验 的目的来确定，若目的是利用几丁质酶来生产几丁寡糖，则可用胶状几丁质作唯一碳 源进行筛选，若目的是为了筛选能抑制真菌生长的几丁质酶，则最好用真菌的细胞壁 来直接进行诱导筛选，因为真菌细胞壁上的自然多聚物与高度纯化的胶状几丁质显著 不同，它不是无定型的，而是共价连接于其它细胞壁物质上的【4 5 1 。 1 6 3 微生物几丁质酶的性质 微生物几丁质酶与其它来源的几丁质酶一样，也可分为外切几丁质酶和内切几丁 质酶，内切几丁质酶的水解产物是几丁寡糖和几丁二糖，而且酶与底物的亲和力随底 物聚合度的提高而增大。外切酶是从链的非还原性末端依次切下单糖【4 6 】，微生物几丁 质酶可产生胞内和胞外几丁质酶，其中大部分微生物能产生胞外酶，是目前研究和应 用较多的几丁质酶。微生物几丁质酶是酸性蛋白，通常在p h 3 1 0 范围内较稳定， 而当p h 4 7 ，温度在4 0 5 0 时酶活性最高。室温下酶活性比较稳定，2 0 贮存二 年以上仍有活性。微生物几丁质酶的分子量差异很大，一般为1 0 1 0 0 l 【4 7 1 。许多 金属离子尤其是重金属离子如a 矿、f e 3 + 、c u 2 + 、z n 2 + 、h 矿+ 、s n 2 + 、c 0 2 + 等，对微 生物产几丁质酶活力都有不同程度的影响。微生物几丁质酶基因的表达是受受体诱 导物系统所控制，一般以几丁质或其降解产物作为诱导物，葡萄糖能抑制几乎所有微 生物产生几丁质酶，也说明微生物几丁质酶基因的调控可能涉及分解代谢物阻遏机 制。 1 6 4 微生物几丁质酶的纯化与分离 目前常用于分离纯化几丁质酶的方法有凝胶色谱法、亲和色谱法、离子交换色谱 法、银染色聚乙酰胺凝胶电泳法等。由黄杆菌分泌的几丁质酶，通过( n h 4 ) 2 s 0 4 沉淀， d e a e 纤维素柱层析，从培养基上清液中分离纯化几丁质酶，经s d s 聚丙烯酰胺凝 胶电泳分析表明，几丁质酶达到均一的程度。利用这些分离纯化手段可以分离得到专 一性酶，以便深入研究各底物类似物、抑制剂与酶的相互作用方式。 1 6 5 微生物几丁质酶的研究热点及应用前景 微生物几丁质酶的研究一直是很活跃的领域。目前，科学家们正在从生物学角度 研究几丁质、壳聚糖这类生物资源的开发，以拓宽应用微生物学领域，并取得了显著 成绩，尤其是采用几丁质酶基因克隆技术，获得高酶活菌株，已经成功地构建了大肠 杆菌、链霉菌以及酵母菌等等许多工程菌，不但丰富了几丁质酶的应用理论，也为成 功而大量地利用水生无脊椎动物和真菌发酵工业产生的废弃物资源开辟了途径。 1 2 2 材料和方法( m a t e r i a l sa n dm e t h o d s ) 2 1 材料 2 1 1 土壤样品 6 组土壤样品( 见表2 ) 分别采至海南福建两省沿海几个虾蟹养殖场和红树林区 域，皆按五点法采样，采样深度5 2 0 c m ，混匀放入无菌纸袋中，编号注明，送回实 验室后保存于4 冰箱，分离工作在2 d 7 d 内全部完成。 表2 土壤的样品列表 t a b l e2s a m p i e si i s t 2 1 2 药品 表3 主要生化试剂及来源 t a b i e3s o m eb i o c h e m i c a i 心a g e n ta n d s o u r c e 名 称来源 乙酰氨基葡萄糖( n a g ) 薄层层析用硅胶g r n a 酶、蛋白酶k 、十二烷基硫酸钠( s d s ) 购于f l u l ( a 公司 青岛海洋化工有限公司 s i 舯a 公司生产， 北京拜尔迪公司分装 1 姻酶、榭 材珊d a nm a r k c r 、d l 2 ，0 0 0d n a m 砌商m i k 承a 公司分装 三羟甲基氨基甲烷( t r i s )c 觚a d a 生产，华美公司分装 1 6 sr 】d n a p c r 引物：2 7 f ：5 t 0 3 ：a g a g t t t g a t c m t g g c t c a g ； 上海生物工程有限公司 1 4 9 2 r ：5 t o3 ：g g t1 t a c ( 玎tg r ra c ga c tt 1 3 2 1 3 仪器 表4 试验仪器 t h b i e4s o m ea p p a r a t u s e s 2 2 培养基 2 2 1 富集培养基 k 2 瑚0 4o 7 9 ，k h 2 p 0 40 3 9 ，m g s 0 4 。7 h 2 00 5 9 ，f e s 0 4 7 h 2 0o 0 2 9 ，蛋白胨2 9 ， 胶体几丁质2 9 ( 干重) ， 细粉几丁质2 9 ，5 0 陈海水定容至l ，o o o n 儿，p h 6 5 。 1 4 2 2 2 分离培养基 k 2 h p 0 4o 7 9 ，k h 2 p 0 40 3 9 ，m g s 0 4 7 h 2 00 5 9 ，f e s 0 4 7 h 2 00 0 2 9 ，蛋白胨2 9 ， 胶体几丁质2 9 ( 干重) ，琼脂l8 9 ，5 0 陈海水定容这至1 ，o o o i i 儿，p h 6 5 。 2 2 3 菌株保存培养基 细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基斜面，放线菌高氏1 号培养基斜面，真菌为p d a 培 养基斜面。 2 2 4 种子培养基 k 2 h p 0 4o 7 9 ，k h 2 p 0 4o 3 9 ，m g s 0 4 。7 h 2 0o 5 9 ，f e s 0 4 7 h 2 0o 0 2 9 ，蛋白胨2 9 ， 胶体几丁质2 9 ( 干重) ，n a c l3 9 ，葡萄糖1 9 ，细粉几丁质4 9 ，5 0 陈海水1 ，0 0 0 m l 。 p h 6 5 。 2 2 5 发酵培养基 k 2 h p 0 4o 7 9 ，k h 2 p 0 40 3 9 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 5 9 ，f e s 0 4 7 h 2 0o 0 2 9 ，胶体几丁 质2 9 ( 干重) ，n a c l3 9 ，酵母膏2 9 ，5 0 陈海水定容至1 ，0 0 0 m l 。 木以上液体培养基，一般配制好后在o 1 p a ，1 2 1 下灭菌3 0 分钟，冰箱保存备 用。 以上固体培养基，一般配制好后在0 1 p a ，1 2 1 下灭菌3 0 分钟，冷却至6 0 左右，倒平板，置于实验台上过夜，若无染菌现象则冰箱保存备用。 2 3 试剂配制 2 3 1 胶体几丁质 在1 0 下将细粉几丁质1 0 9 放入研体中，加入丙酮4 0 m l ，研磨1 0 耐n ，边研磨 边缓缓加入冷浓盐酸4 0 0 m l ，充分研磨使其成糊状，于4 下放置2 4 h ，之后用玻璃 棉过滤，将滤液缓缓加入到盛有2 ，0 0 0 m l 体积分数5 0 乙醇的烧杯中，边加边剧烈 搅拌，然后静置，待胶体几丁质析出后去除清液，收集胶体几丁质，用蒸馏水冲洗胶 体几丁质至p h 6 5 ，以蒸馏水定容至1 ，0 0 0 m l ，灭菌冷藏备用【5 4 1 。 2 3 2d n s 试剂 甲液：溶解6 9 9 结晶酚于1 5 2 i i 儿1 0 氢氧化钠溶液中，并用蒸馏水稀释至6 9 m l ， 在此溶液中加6 9 9 亚硫酸钠；乙液：称取2 5 5 9 酒石酸钾钠加到3 0 0 i n ll o 氢氧化钠 1 5 溶液中，再加入8 8 0 m l1 3 ，5 二硝基水杨酸溶液。将甲乙溶液相混合即得黄色试 剂，贮于棕色瓶中备用，在室温置7 l o d 后使用。 2 3 3n a g 标准溶液 乙酰氨基葡萄糖在6 0 下烘干至恒重后，配制1 岬。妇正标准乙酰氨基葡萄糖溶 液，稀释不同倍数待用； 2 3 4m c i l v a i n e 缓冲液 o 2 m o l ln a 2 h p 0 4 与o 1 n l o 儿柠檬酸缓冲液，两者按不同比例混合配成不同p h 值的缓冲液。 2 3 5t r i s h c i 缓冲液 4 0 n 珊o l l 三羟甲基氨基甲烷( 瞄s ) 和4 0 i 砌o l