（微生物学专业论文）肺炎链球菌23f中cdp2甘油合成途径的鉴定.pdf

j i i i i i iiii111 1 11 11 1 1i i ! i ii i i i i y 17 9 816 3 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论支作者签名：镭篓伟 2 p p 彦年f 月2 易日 摘要 摘要 肺炎链球菌是引起肺炎等上呼吸道感染性疾病和侵入性疾病的主要致病 菌，其毒性与其细胞壁外存在的荚膜抗原紧密相关。荚膜抗原的组成成分为荚 膜多糖( c p s ) ，由寡糖重复单元组成，在自然选择压力下形成了自然界中最为突 出的生物多样性之一。组成这些寡糖重复单元的单糖的生物合成为c p s 的形成 提供原料。对c p s 中单糖生物合成路径的研究有助于揭示细菌的致病机理，亦 可为疫苗和抗生素等的研究和生产提供依据，从而抑制肺炎链球菌的高发病率 和致死率。 国内外的文献报道预测了肺炎链球菌2 3 f 中c d p 2 甘油单糖合成途径，是 从甘油醛出发的涉及三个酶参与的途径。本实验旨在通过生物化学的方法体外 鉴定文献中预测的肺炎链球菌2 3 f 中c d p 2 甘油单糖合成途径。首先利用 p e t - 2 8 a ( + ) 载体克隆途径中的三个基因g t p l 、g t p 2 和g t p 3 ，进行融合蛋白的表达 和纯化。用紫外分光光度仪、毛细管电泳仪、高效液相色谱仪、质谱仪和核磁 共振仪等对g t p l 、g t p 2 和g t p 3 的体外酶促生化反应产物进行分析和鉴定，探 索三个酶的生物学功能。 本实验在前期背景研究的基础上，通过生物化学的方法确定了g t p l 、g t p 2 和g t p 3 三个酶的功能及g t p 2 的酶促动力学参数，首次确定了肺炎链球菌2 3 f 中c d p 2 甘油的生物合成途径。 关键词：肺炎链球菌2 3 f ；c p s ；c d p 2 甘油；g t p l ，g t p 2 ，g t p 3 a b a t r a c t a b s t r a c t s t r e p t o c o c c u sp n e u m o n i a ei s am a j o rp a t h o g e no fu p p e rr e s p i r a t o r yt r a c t i n f e c t i o n sa n di n v a s i v ed i s e a s e ss u c ha sp n e u m o n i a i t sv i r u l e n c ed e p e n d sm a i n l yo n i t sc a p s u l e ，w h i c hl o c a t e so nt h eo u t s i d eo fi t sc e l lw a l l c a p s u l ec o n s i s t so fc a p s u l a r p o l y s a c c h a r i d e s ( c p s s ) ，w h i c ha r ec o m p o s e do fr e p e a t - u n i tp o l y s a c c h a r i d e u n d e r t h en a t u r a ls e l e c t i v ep r e s s u r e ，r e p e a t u n i tp o l y s a c c h a r i d eh a sf o r m e dt h em o s t o u t s t a n d i n gb i o d i v e r s i t y m o n o s a c c h a r i d e sf o r m i n gt h er e p e a t u n i tp o l y s a c c h a r i d e p r o v i d e c p s 谢t l lm a t e r i a l st oc o n s t r u c ti t s s t r u c t u r e t h u s ，s t u d y i n g o f m o n o s a c c h a r i d e sb i o s y n t h e s i sp a t h w a y sc a l lg i v ec l u et om e c h a n i s mo fb a c t e r i a l v i r u l e n c e ，a n dt h e nb eh e l p f u lt ov a c c i n e s a n da n t i b o d i e s d e v e l o p m e n t , 晰t l lt h e u l t i m a t eg o a lo fc o n t r o l l i n gt h eh i 曲m o r b i d a n dm o r t a l c a u s e db ys t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e i th a sb e e nr e p o r t e dt h a tt h ep u t a t i v eb i o s y n t h e s i sp a t h w a yo fs t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e2 3 fc d p - 2 g l y c e r o l c o n s i s t so ft h r e ee n z y m e ss t a r t i n gf r o mt h e s u b s t r a t eo fg l y c e r a l d e h y d e s t h i sw o r ki st oc o n f i r mt h i sp u t a t i v eb i o s y n t h e s i s p a t h w a yo fc d p - 2 - g l y c e r o l i n s t r e p t o c o c c u sp n e u m o n i a e 2 3 fb y nv i t r o b i o c h e m i c a lr e a c t i o n s t h i sp r o j e c tw a ss t a r t e db yc o n s t r u c t i o no ft h et h r e eg e n e so f g t p l ，g t p 2a n dg t p 3 c l o n e si n t op e t - 2 8 a ( ”v e c t o r , f o l l o w e db ye x p r e s s i o na n d p u r i f i c a t i o no ft h ef u s i o np r o t e i n s u v - s p e c t r o m e t e r , c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) ， h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) ，m a s ss p e c t r u m ( m s ) a n d n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e ( n m r ) w e r eu s e dt oa n a l y z ea n di d e n t i f yt h ep r o d u c t s o f r e a c t i o n so f g t p l ，g t p 2a n dg t p 3r e s p e c t i v e l y , t om a k ec l e a ro f t h e i rf u n c t i o n s b a s e do np r e v i o u sr e s e a r c hr e s u l t s ，t h i sw o r ks u c c e s s f u l l yi d e n t i f i e df u n c t i o n so f g t pl ，g t p 2a n dg t p 3 i na d d i t i o n , t h ep a r a m e t e r so fg t p 2w e r ea l s om e a s u r e d t oo u r k n o w l e d g e ，t h i si st h ef i r s tt i m et h a tt h eb i o s y n t h e s i sp a t h w a yo fc d p 一2 一g l y c e r o lh a s b e e ni d e n t i f i e d k e yw o r d s ：s t r e p t o c o c c u sp n e u m o n i a e2 3 f , c p s ，c d p 一2 - g l y c e r o l ，g t p l ，g t p 2 ， g t p 3 i i 目录 目录 第一章引言i 第一节研究背景简介。l 1 1 i 肺炎链球菌简介1 1 1 2 肺炎链球菌的分型2 1 1 3 肺炎链球菌的致病性2 1 1 4 肺炎链球菌的荚膜及荚膜多糖3 1 1 5 肺炎链球菌c p s 的生物合成途径3 1 1 6 单糖合成途径研究的意义和现状5 1 1 7 糖基转移酶6 1 i 8 肺炎链球菌2 3 f 血清型的c p s 基因簇和c p s 重复单元结构。7 1 1 9 肺炎链球菌2 3 f 血清型中的单糖c d p 2 - g l y c e r o l 的合成途径8 第二节分析仪器的应用一9 1 2 1 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 。9 1 2 2 高效液相色谱( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，h p l c 9 1 2 3 质谱( m a s ss p e c t r o m e t e r ，m s ) 10 第三节本项实验的研究目标、内容和创新性1 1 1 3 1 本项实验研究的目标和内容。l l 1 3 2 本项实验的创新性。l l 第二章实验材料与方法1 3 第一节实验材料1 3 2 1 1 菌株1 3 2 1 2 质粒：。l3 2 1 3 克隆用引物1 4 2 1 4 基因操作试剂。1 5 i i i 目录 2 1 5 蛋白质操作试剂。1 5 2 1 6 培养基1 7 2 1 7 酶促反应用到的主要试剂。1 7 第二节基因克隆方法1 8 2 2 1 细菌基因组d n a 的提取i8 2 2 2p c r 扩增18 2 2 3p c r 产物纯化。2 0 2 2 4 酶切。2 0 2 2 5 连接2 0 2 2 6 转化。2 0 2 2 7 质粒提取2 l 2 2 8 目的基因测序。2 2 2 2 9 序列拼接2 2 第三节目的蛋白质的表达和纯化2 3 2 3 1 小量诱导表达2 3 2 3 。2 大量诱导表达2 3 2 3 3 目的蛋白的纯化与鉴定_ 2 4 第四节酶活鉴定2 5 2 4 1 紫外分光光度仪检测g t p l 的反应辅因子2 5 2 4 2 毛细管电泳仪。2 6 2 4 3h p l c 和m s 分离检测产物2 6 2 4 4 酶学参数的确定。2 6 第三章实验结果2 7 第一节g t p 3 的克隆构建与目的蛋白的表达纯化2 7 3 1 1p c r 产物及纯化2 7 3 1 2 载体质粒的提取2 7 3 1 3 目的片段与载体片段的连接2 8 3 1 4 阳性克隆的酶切鉴定2 9 i v 目录 3 1 5 目的基因的测序和拼接2 9 3 1 6 目的蛋白g t p 3 的表达和纯化。2 9 第二节g t p l 的克隆构建与目的蛋白的表达纯化3 0 3 2 1p c r 产物及纯化3 0 3 2 2 目的片段与载体片段的连接3 l 3 2 3 阳性克隆的酶切鉴定3 l 3 2 4 目的基因的测序和拼接3 2 3 2 5 目的蛋白g t p l 的表达和纯化3 2 第三节g t p l 的克隆构建与目的蛋白的表达纯化3 3 3 3 1p c r 产物及纯化3 3 3 3 2 目的片段与载体片段的连接。3 3 3 3 3 阳性克隆的酶切鉴定。3 4 3 3 4 目的基因的测序和拼接3 5 3 3 5 目的蛋白g t p 2 的表达和纯化3 5 第四节体外酶活反应3 5 3 4 1 蛋白浓度的测定3 5 3 4 2g t p 2 的活性。3 7 3 4 3g t p 2 酶学参数测定3 8 3 4 4g t p 3 的活性4 5 3 4 5g 印l 的活性4 7 第五节质谱结果4 9 第六节核磁共振检测c d p 基团在甘油上的位置一5 0 第四章总结5 2 第一节基因克隆，蛋白表达和纯化5 2 第二节体外酶活检测确定反应路径5 2 第三节g t p 2 生化参数的测定5 3 第五章讨论5 5 v 目录 第一节肺炎链球菌2 3 f 中c d p 2 甘油合成途径的确定5 5 第二节g t p 3 酶定性方法的改进5 5 第三节o p 2 与已经鉴定过的c d p 转移酶的相似性分析5 6 第四节g t p l 催化的反应的可逆性5 6 参考文献5 7 致谢6 0 个人简历6 1 g i 第一章引言 第一章引言 糖链在细菌感染中的重要作用使得细菌表面多糖成为糖生物学研究的热点 之一。对于许多病原细菌，它们在哺乳动物组织细胞靶位上的黏附是感染的关键 步骤，大多数微生物在细胞表面的黏附都是由糖链介导的。微生物中广泛存在 多种糖缀合物及糖链，如细菌细胞壁中有脂多糖、肽聚糖、胞壁周质糖链及荚 膜多糖，真菌细胞壁中有葡聚糖、几丁质、甘露聚糖等，病毒包膜中的蛋白也 是糖蛋白。病原微生物细胞表面这些糖链常在微生物与动植物的相互作用中起 至关重要的作用，往往也是感染的毒力因子。 细菌的荚膜多糖( c p s ，c a p s u l a rp o l y s a c c h a d d e ) 是某些细菌表面的主要抗原 成分，具有生物界最丰富的多样性，与细菌的致病性紧密相关，值得广泛深入 研究。因此，对c p s 组成和生物合成路径的研究有助于为生产疫苗和抗生素提 供依据。 肺炎链球菌2 3 f 是常见致病性肺炎链球菌之一，能够导致上呼吸道感染和 侵入性疾病。本章就肺炎链球菌2 3 f 荚膜多糖生物合成过程中的罕见单糖 c d p 2 。g l y c e r o l 的合成路径的研究背景进行综述。 第一节研究背景简介 主要介绍两个方面，一方面是肺炎链球菌( s t r e p t o c o c c u sp n e u m o n i a e ) 及其荚 膜多糖( c a p s u l a rp o l y s a c c h a r i d e ) ，另一方面是罕见单糖的合成路径及其与荚膜多 糖合成的关系。 1 1 1 肺炎链球菌简介 肺炎链球菌僻p n e u m o n i a e ) 是革兰氏阳性球菌，广泛分布于自然界，常生活 在正常成人( 5 1 0 ) 和正常儿童( 2 0 4 0 ) 的鼻腔中，一般不致病。然而， 在特定条件下，一些血清型的肺炎链球菌是能导致上呼吸道感染和侵入性疾病 的主要致病菌，常见的如肺炎、气管炎、脑膜炎、窦炎、败血症和急性中耳炎。 肺炎链球菌被公认为导致肺炎的主要细菌，有着很高的发病率和致死率】。 l 第一章引言 肺炎链球菌导致的疾病较其它疫苗预防性细菌导致的疾病有更高的致死率 1 4 - 5 】。在美国，每年有约4 0 0 0 0 人死于肺炎链球菌的感染【6 1 。肺炎在致死性疾病 中排在前l o 位。根据德国联邦统计局数字显示，2 0 0 4 年有1 8 3 9 5 人死于肺炎， 占全部死亡人数的2 2 t7 。 在我国，肺炎链球菌每年造成2 5 0 万人患肺炎球菌性肺炎，并导致1 2 5 万 人死亡( 多为5 0 岁以上的中老年人和1 岁以下婴儿) 。i 3 的婴幼儿化脓性中耳 炎患者皆为肺炎链球菌感染，且复发率高达4 0 ( 8 - 1 0 1 。 1 1 2 肺炎链球菌的分型 普遍采用的是血清分型。分型专用血清可以用来划分肺炎链球菌的血清型 和亚型，包括免疫血清型。这些血清是经过一系列多重交叉吸附过程生产的， 能够特异性区分不同肺炎链球菌c p s 间的免疫化学区别【1 1 1 。目前，通过与分型 专用血清反应将肺炎链球菌分成了9 0 种血清型1 2 1 。 1 1 3 肺炎链球菌的致病性 常见的致病性肺炎链球菌有2 3 个血清型，分别是1 、2 、3 、4 、5 、6 b 、7 f 、 8 、9 n 、9 v 、1 0 a 、1 1 a 、1 2 f 、1 4 、1 5 b 、1 7 f 、1 8 c 、1 9 a 、1 9 f 、2 0 、2 2 f 、2 3 f 和3 3 f 1 3 - 1 4 。在美国，针对肺炎链球菌的有效多价多糖疫苗有两种，一种是适用 于婴幼儿的，是2 0 0 0 年2 月通过许可的存在于蛋白载体上的7 价多糖疫苗( 4 、6 b 、 9 v 、1 4 、1 8 c 、1 9 f 和2 3 f ) ，另一种是适用于成人的2 3 价多糖疫苗( 1 、2 、3 、4 、 5 、6 b 、7 、8 、9 n 、9 v 、1 0 a 、l1 a 、1 2 f 、1 4 、1 5 b 、1 7 f 、1 8 c 、1 9 a 、1 9 f 、 2 0 、2 2 f 、2 3 f 和3 3 f ) 1 1 5 】。在这两种疫苗针对的肺炎链球菌血清型中，都包含2 3 f 血清型这种常见的致病性肺炎链球菌，可见2 3 f 血清型在研究肺炎链球菌致病性 工作中的重要作用。 在西班牙，最常见的成人感染的血清型为3 、6 、9 、1 4 、1 9 和2 3 ，儿童为 6 、1 4 、1 9 和2 3 。另外，具有青霉素抗性的血清型一般归为6 、9 、1 4 、1 9 和2 3 【l 6 。 2 0 0 0 年和2 0 0 1 年的冬季，6 4 8 名五岁以下巴西儿童( 含正常儿童和上呼吸 道感染及脑膜炎患j d ) 鼻咽中存在肺炎链球菌的比例为3 5 8 ，且最常见的血清 型为1 4 、6 b 、6 a 、1 9 f 、1 0 a 、2 3 f 和1 8 c 。这七种血清型的肺炎链球菌中，有 五种包含在7 价疫苗内1 1 7 j 。 2 第一章引言 1 1 4 肺炎链球菌的荚膜及荚膜多糖 荚膜( c a p s u l a r ) 是某些细菌细胞壁外存在着一层厚度不定、粘性极大的透明 胶质状物质，其主要成分随菌种不同而不同，大多数为多糖、多肽或蛋白质， 尤以多糖居多。肺炎链球菌能否致病与其荚膜( c a p s u l e ) 有密切关系，因为其荚膜 能抵抗人体内吞噬细胞的吞噬作用而大量繁殖，引起疾病。肺炎链球菌的毒力 大小与荚膜中的多糖结构及含量有关。当有荚膜的光滑( s ) 型菌失去荚膜成为粗 糙( r ) 型时，其毒力减低或消失。 构成荚膜的多糖即荚膜多糖，由寡糖重复单元组成，构成这些寡糖重复单 元的单糖包括多种单糖、糖衍生物和糖类似物等，其中包括由常见单糖经过多 酶作用后产生的罕见单糖，例如鼠李糖，阿拉伯糖和甘露糖等，这些糖都是生 物大分子的组成部分。 荚膜多糖是高相对分子量的抗原，m r 为1 0 5 至1 0 6 ，由几百个寡糖重复单位 组成，重复单位一般含1 - - 6 个单糖残基。细菌能装配出数百种完全不同的线形 和分支形荚膜多糖结构。结构中常有不常见的单糖残基和非糖取代基，如乙酸 酯或磷酸酯和丙酮酸缩酮。最简单的荚膜多糖是同多糖，例如脑膜炎奈瑟氏菌 ( n m e n i n g i t i d i s ) 组型a 、b 和c 的抗原；其中b 和c 的抗原是糖苷键连接的 唾液酸( 位d - n e u n a c ) 同聚物，即多聚唾液酸( p o l y s i a l i ca c i d ) ，它们在结构上 的差别只是残基的连接位置不同，组型b 是2 8 位连接，组型c 是2 9 位连 接；但它们在免疫学上是两个不同的抗原。多数荚膜多糖是杂多糖，例如胸膜 肺炎双球菌( d i p l o c o c c u sp n e u m o n i a e ) i i i 型的荚膜多糖含重复单位， 一 4 ) 一b d g l c u a 一( 1 _ 4 ) 一b o - - g l c - - ( 1 n 一，m r 高达1 4 0 0 0 0 。由于荚膜容易接近 并且有重复的表位结构( e p i t o p es t r u c t u r e ) ，因而使荚膜能够产生显著的抗体响 应。例如胸膜肺炎双球菌的情况估计单个细菌细胞上表达的荚膜抗原决定簇能 与4 x 1 0 6 个抗体分子结合。荚膜多糖使病原菌具有毒性的重要原因，也是使病原 菌免遭宿主细胞吞噬的保护层1 1 8 1 。 1 1 5 肺炎链球菌c p s 的生物合成途径 9 0 种血清型的肺炎链球菌都具有各自独特的c p s 结构。除了3 和3 7 血清 型是经过合成酶途径合成外【1 9 之3 1 ，其它血清型的c p s 合成都需要经过一个复杂 的途径，即w z x w z y 依赖的合成途径( 图1 1 ) 。首先是单糖组分的合成，然后 3 u 第一章引言 将以核苷二磷酸形式存在的单糖转移到与膜结合的脂类载体上，再将其它糖基 按顺序转移从而形成重复单元。这种重复单元经由翻转酶或转运酶转移到细胞 膜外表面，再聚合形成与磷脂结合的成熟的c p s ，最后连接到肽聚糖上 2 4 j 。经 由此合成路径合成的c p s 相对应的基因簇在基因组中处于相同的位置，即d e x b 和a l i a 基因之间【2 5 讲l 。这个c p s 基因簇主要编码用来合成重复单元的基因，包 括单糖合成酶、第一个糖基转移酶、形成其它糖苷键的糖基转移酶、重复单元 的翻转酶和聚合酶1 2 引。 图1 1 以肺炎链球菌9 a 血清型为例表示w z x w z y 依赖的c p s 生物合成途径【2 4 1 图注：图中显示的是基于实验结果和推测假设出的肺炎链球菌c p s 生物合成路径的模型。 ( 1 ) 非持家核苷单糖的生物合成。 ( 2 ) 第一个糖基转移酶( 这里是w c h a ) 将第一个磷酸化的单糖( g l c p ) 转移到与膜结合 的脂类载体( 普遍认为是u n d p ) 上。 4 第一章引言 ( 3 ) 其它的糖基转移酶将其它单糖按顺序转移形成重复单元。 ( 4 ) w z x 翻转酶将重复单元翻转到细胞膜外表面上。 ( 5 ) w z y 聚合酶将单个的重复单元连接到一起形成与磷脂结合的c p s 。 ( 6 ) w z d w z e 将成熟的c p s 转移到细胞表面，并可能是负责与肽聚糖的结合。 1 1 6 单糖合成途径研究的意义和现状 从肺炎链球菌c p s 的生物合成途径可以看出，c p s 合成的第一步就是非持 家核苷单糖的合成。这些罕见单糖的合成为肺炎链球菌c p s 的合成提供了基本 原料。这些罕见单糖在人与动物体内并不存在，因此，要研究肺炎链球菌的致 病机理，进而生产高效的特异性疫苗和抗生素，可以先从认清这些罕见单糖的 生物合成途径开始。罕见单糖的生物合成途径是一系列的酶促反应，在特定的 糖合成酶催化下从细胞体内常见的小分子或糖类转化得到产物。通过研究荚膜 多糖中的罕见单糖合成酶，认清这些酶的特性，进而生产疫苗阻遏这些合成酶 基因的表达或酶的活性，达到免疫的作用。或者通过鉴定罕见单糖生物合成途 径，人工合成得到这些罕见单糖，对其进行结构基团的认知，弄清罕见单糖以 及糖链在细菌致病性中的作用，亦可为疫苗和抗生素等的研究提供依据 2 9 3 0 】， 在制药领域有很重要的应用价值，对肺炎链球菌引起的疾病进行预防和治疗。 国外许多研究机构都在进行着此类罕见单糖生物合成途径的研究，在目前 己知结构的罕见单糖中，有2 0 多个合成基因已经被认知、体外鉴定和使用。2 0 0 1 年p a u lm e s s n e r 研究小组对革兰氏阳性嗜热菌a n e u r i n i b a c i l l u st h e r m o a e r o p h i l u s l 4 2 0 9 1 i 。中g d p d r h a m n o s e 生物合成路径进行了研究，证明了从 g d p d r n a n n o s e 经4 ，6 位脱水酶和4 位还原酶催化反应生成g d p d r h a l i l n o s e 的罕见单糖合成路径1 3 l 】。2 0 0 2 年p a u lm e s s n e r 等人又研究了革兰氏阳性嗜热菌 a n e u r i n i b a c i l l u st h e r m o a e r o p h i l u sd s m1 0 15 5 中d t d p l r h a m n o s e 的合成路径， 体外证明了从d t l l p 和1 一磷酸葡萄糖出发，经由r m l a 、r m l b 、r m l c 和r m l d 的催化生成终产物d t d p l r h a m n o s e 的反应，并对途径中四个酶的参数进行了 测定f 3 2 1 。2 0 0 3 年，r m i c h a e lg a r a v i t o 小组研究得到了g d p d g h a l l l n o s e 合成路 径中4 ，6 位脱水酶的结构参数，解析了蛋白的底物结合位点、辅因子结合位点 和催化机理等，并与已知蛋白的结构进行了比较1 3 3 1 。2 0 0 3 年，加拿大g u e l p h 大 5 第一章引言 学微生物学实验室j o s e p hs l a m 等人阐释了n - a c e t y l l f u c o s a m i n e 在 p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a0 1 1 和革兰氏阳性菌s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s5 型菌株中的 合成路径。n - a c e t y l l f u c o s a m i n e 在这两种菌株中的合成路径极其相似，都是由 三个糖合成酶( p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a0 1 1 中是w b j b 、w d j c 和w b j d ； s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s5 型中是c a p 5 e 、c a p 5 f 和c a p 5 g ) 催化的五步反应。这五 步反应从u d p - n - a c e t y l d g l u c o s a m i n e 出发分别为4 ，6 位脱水、3 位异构、5 位 异构、4 位还原和2 位异构反应得到终产物n - a c e t y l l f u c o s a m i n e p 训。但是，具 体每个酶的功能当时仍未有具体实验结果认定。2 0 0 5 年，他们采用了基于离子 交换方法的快速蛋白液相色谱，并改进了n m r 检测的灵敏度，证实了合成途径 三个酶催化的反应【3 引。 虽然罕见单糖的合成途径被广泛的研究并成果显著，但是不同菌种中的罕 见单糖性质不同，生物学功能也不同，生物合成路径也各有特色，我们还仍有 许多罕见单糖的合成路径没有弄清，对罕见单糖的研究还要做很多有意义的工 作。 1 1 7 糖基转移酶 糖基转移酶( g l y c o s y lt m n s f e r a s e ) 是自然界中存在的最为多样性的一大类酶。 糖基转移酶负责将活性供体( 通常是n d p 糖) 的单糖部分转移至糖、蛋白质、 脂类、核酸以及另外一些小分子，完成糖基化反应。糖基转移酶在所有生命体 中都扮演着重要的生物学角色，逐渐引起人们的重视【3 刀。 糖基转移酶的一个重要的生产应用在于糖类药物的生物合成，即通过糖基 转移酶的作用在体外将二个甚至多个单糖连接成需要的糖链。糖类药物在治疗 炎症、用作肿瘤疫苗和抗病毒等方面有独特的治疗功效。现在普遍使用的糖类 合成方法有两种：化学法和酶促合成。酶法合成寡糖有着化学合成法无可取代 的优势，化学合成法很难选择二个糖之间的键的形成，而糖基转移酶只对二糖 之间所有可能的键中的一种有特异性，在反应中几乎没有副产物的产生【3 硒9 1 。 随着人们对寡糖和多糖需求量的增加，有着不同供体、受体和连接价键特 异性的糖基转移酶需要被克隆、表达和鉴定。细菌本身是一个很好的糖基转移 酶源，含有大量的种类繁多的糖基转移酶。我们通过遗传改造，更能适宜大规 模合成寡糖或糖复合物。 6 第一章引言 同时，对糖基转移酶的研究还能够为细菌致病性提供依据。同单糖合成酶 一样，糖基转移酶在形成细菌表面多糖如荚膜多糖的过程中起着不可或缺的作 用，可以作为抗生素和疫苗的靶点。而且，单糖合成酶的研究是糖基转移酶研 究的基础，为糖基转移酶提供底物材料。因此，为了弄清糖基转移酶的生物学 功能及作用机理，首先要通过研究单糖合成酶合成活性供体，即n d p 糖。 1 1 8 肺炎链球菌2 3 f 血清型的c p s 基因簇和c p s 重复单元结构 肺炎链球菌2 3 f 的c p s 基因簇c p s 2 3 f 在1 9 9 9 年被破译p o j 。该基因簇全长 2 2 3 3 0b p s 2 4 1 ，位于其基因组的d e x b 和a l i a 基因之间，共含有1 8 个功能基因m 1 ， 如图1 2 。 9 爹爹爹寥 笋梦矿寥霉露枣萨枣p 爹毋萨 量翟! 苎苎：孟= 三翟翌罂i 坠三= 竺竺竺! 竺! 毯翟篓量翟篓翟兰警翌! ，脯 图1 2 肺炎链球菌2 3 f 的c p s 基因簇【2 4 1 这个基因簇中的基因负责合成肺炎链球菌2 3 f 的c p s ，该c p s 中的重复单 元结构如图1 3 。 - - 一h 6 - a - 仇v ( t 叫玲。鼢姒l 嘶势哟吲i 一 32 t a - l - 怼垮 图1 3 肺炎链球菌2 3 f 血清型c p s 的重复单元结构h 1 1 从图3 可以看出，肺炎链球菌2 3 f 血清型的c p s 由五糖重复单元组成。构 成这个五糖重复单元的单糖共有4 种，分别为鼠李糖、半乳糖、葡萄糖和甘油。 在这四种单糖中，半乳糖和葡萄糖为两种最常见的单糖，在其它细菌表面抗原 的组成中也有存在。鼠李糖虽为罕见单糖，但是鼠李糖在革兰氏阴性菌和部分 革兰氏阳性菌中的生物合成途径已经被研究得到【3 。至于甘油，则只有在肺炎 链球菌1 5 a 的多糖重复单元结构中存在【2 4 】，在其它细菌的多糖成分中未见报道。 然而，甘油的单糖合成路径未曾有过鉴定。因此，甘油的生物合成途径成为生 物领域有价值的研究之一。 7 第一章引言 1 1 9 肺炎链球菌2 3 f 血清型中的单糖c d p 2 g l y c e r o l 的合成途径 在肺炎链球菌2 3 f 的c p s 基因簇破译后，通过生物信息学的方法分析预测 得到三个糖合成酶负责c d p 一2 一g l y c e r o l 的生物合成。这三个糖合成酶分别命名 为c p s 2 3 f x 、c p s 2 3 f y 和c p s 2 3 f z ，途径预测结果如图1 4 所示。 c 淤2 徘d g 坼的妇科峥 图1 4 预测的c d p 2 g l y c e r o l 的生物合成途径【柏j 该预测途径中，起始物质为甘油醛，首先经过c p s 2 3 f z ( 磷酸化酶) 的催化在 2 位碳上转移一个磷酸基团生成2 一磷酸甘油醛，再经过c p s 2 3 f x ( 氧化还原酶) 的催化生成2 一磷酸甘油，最后由c p s 2 3 f y ( c d p 转移酶) 催化获得c d p 基团生成 终产物c d p 2 g l y c e r o l 。然而，该推测只基于同已知功能蛋白的生物信息学比较 得到，并未经实验证实。 在2 0 0 6 年发表的文献中，9 0 种血清型肺炎链球菌的c p s 基因簇均被破译完成 并规范命名，同时总结了部分c p s 的重复单元的结构。c p s 2 3 t x 、c p s 2 3 f y 和 c p s 2 3 t z 更名为g t p l 、g t p 2 和g t p 3 ，并再次预测了c d p - 2 g l y c e r o l 的生物合成 路径【2 4 1 ，如下。 g t p l ，g t p 2 , g t p 3 7 9 l y c e r a l d h y d e 7 - - - - g l y c e r o l - 2 - n d p g t p l 、g t p2 和g t p3 基因不仅存在于肺炎链球菌2 3 f 血清型中，还存在于1 5 f 、 1 5 a 、1 5 b 、1 5 c 、2 3 a ( 结构未知) 、2 3 b ( 结构未知) 和2 8 f ( 结构未知) 中。在得到 8 狰 惜 百丁 第一章引言 结构的肺炎链球菌血清型中，1 5 a 的多糖重复单元结构与2 3 f 完全相同，1 5 f 、 1 5 b 和1 5 c 的重复单元与2 3 f 的仅差一个单糖，就是在甘油位置处用胆碱取代 了甘油 2 4 1 。1 5 b 和2 3 f 血清型的肺炎链球菌都是常见致病性肺炎链球菌，但1 5 a 、 1 5 f 和1 5 c 却很少有报道致病。因此，g t p l 、g t p2 和g t p3 基因功能的研究很有 助于弄清这些血清型的肺炎链球菌荚膜多糖重复单元合成的机理，找到它们荚 膜多糖重复单元结构差异的原因，以及荚膜多糖结构与肺炎链球菌致病性的关 系。 第二节分析仪器的应用1 4 2 4 3 l 1 2 1 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 毛细管电泳是溶质( 离子或荷电粒子) 在充满电解质( 缓冲溶液) 的毛细 管中，在高压电场作用下，按淌度或分配系数的差别而实现高效、快速分离分 析的新型电泳技术，作为- - 1 新型的生物大分子分离技术，它越来越受到生物 学家的重视。由于它除了具有传统的凝胶电泳的高分辨率外，还具有像高效液 相层析一样的分析速度和高灵敏度、高分辨率、高重复性等许多优点。因此， 在蛋白质、抗体、多态、核酸的分离分析、蛋白质序列、d n a 序列测定及活细 胞的分离等方面有很大的发展潜力。 根据分离模式的不同，可将毛细管电泳分为毛细管胶束电动色谱、毛细管 筛分电泳、毛细管等电聚焦电泳和本实验用到的毛细管区带电泳( c a p i l l a r yz o n e e l e c t r o p h o r e s i s ，c z e ) 。这种毛细管电泳的毛细管内只充满缓冲液，溶质分子由 于质荷比而以不同的速度在分离的区带内进行迁移而被分离。由于是以具有塞 式平流特性的电渗流作为c z e 的液体驱动力，溶质区带在毛细管内几乎不被扩 散，因此c z e 具有高柱效。在c z e 中通过缓冲液的组成、有机添加剂、p h 值 及电场强度等操作参数的选择可以控制电渗流，实现高效分离。 1 2 2 高效液相色谱( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，h p l c 按分离原理h p l c 被分为以下几种： l 、液固色谱( 吸附色谱) ：色谱柱内填充固体吸附剂，利用吸附剂表面活 9 第一章引言 性中心进行吸附，样品分子不进入固定相内部，其分离原理是基于样品中各分 子吸附力的差别，从而达到混合物的分离。 2 、液液色谱( 分配色谱) ：固定相是将固定液涂在化学惰性的小颗粒载体 上，呈一层薄而均匀的膜，流动相与固定液不相混溶，而且二者的极性相差很 大。当固定相为强极性而流动相是非极性的分离方法时，称为正相液液分配色 谱法。反之，固定相为非极性而流动相为极性溶剂时，称为反相液。液分配色谱 法。 液液色谱分离的基本原理是样品随流动相进入色谱柱，样品中各分子在流 动相和固定相中扩散速度不同，即溶解度不同，产生不同的分配系数，从而将 它们分离。这种液液色谱的填料由于在使用过程中固定液有流失的现象，导致 柱效下降。为避免此弊病，出现了目前广泛使用的键合相填料，即在惰性载体 上以化学法键合有活性的官能团如氰基、醚基、二甲胺基和烷基等。化学键合 的固定相稳定性好，在使用过程中无流失现象，目前最广泛使用的是十八烷基 硅烷( c 1 8 ) ，这种填料用于反相色谱，它按其疏水性对样品组分进行分离。不同 的分子极性各异，极性小的分子与固定相作用力大，后流出色谱柱，呈现高保 留值，本实验采用这种填料。 反相色谱填料广泛地使用于生物学领域，如氨基酸及其衍生物、肽类、碳 水化合物、核苷酸、核酸碱基、脂溶性及水溶性维生素、糖类、甾体激素、防 腐剂、抗氧化剂以及些药物等的分离、分析。 1 2 3 质谱( m a s ss p e c t r o m e t e r ，m s ) 质谱分析是先将物质离子化，按离子的质荷比分离，然后测量各种离子谱 峰得强度而实现分析目的的一种分析方法。质量是物