碱裂解法从Ecoli中制备质粒DNA.ppt

质粒DNA制备,一、质粒简介,质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNA分子 其大小范围从lkb至200kb以上不等。 已经在形形色色的细菌类群中发现质粒. 这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。,质粒通过细菌间的接合作用，从雄性体转移到雌性体，是细菌有性繁殖的性因子 1946年， Lederburg和Fatum发现的F因子是最早发现的质粒，F因子与高等生物细胞质中的染色体外遗传单位极为相似。 1952年，由Lederburg正式命名为质粒。,确切地说，质粒是细菌内的共生型遗传因子，它能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞表型，是比病毒更简单的原始生命。,质粒依赖于宿主编码的酶和蛋白质来进行复制和转录。通常，质粒含有编码某些酶的基因，这些酶事实上在一定的环境下对细菌宿主有利。 由质粒产生的表型包括对抗生素的抗性、产抗生素、降解复杂有机化合物，以及产生大肠杆菌素、肠毒素及限制酶与修饰酶等等。,质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术,二、质粒特性,1. 分子相对小,在5kb左右，质粒较小，比较稳定，不易受物理因素的损伤，此外，较小的质粒一般有较高的拷贝数。,2. 含有高效的自主复制成分,质粒的复制与宿主细胞的繁殖不相关，在抑制细菌蛋白质合成时，细菌染色体DNA停止复制，但这种质粒可继续利用细菌原有的酶系进行复制,质粒含有复制起始点，此起始点及顺式作用调控元件组成一个复制子(replicon)，能利用细菌染色体DNA复制所用的同一套酶系统，在细菌细胞中独立地进行自我复制及转录。,根据所含复制起始区的不同，有些质粒的复制与宿主细胞染色体的复制同步，每个细胞只含有一个或几个拷贝的质粒，即处于“严密控制”。,有些质粒则处于“松弛控制”，每个细胞可含达15-20乃至数百拷贝的质粒。这类质粒在宿主细胞蛋白质停止合成(加入氯霉素)、染色体DNA停止复制的条件下，拷贝数继续增加至数千。,3.不相容性,利用同一复制系统的不同质粒不能稳定地和平共处，可称之为不相容质粒，当两个上述质粒被导入同一细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争。,由于质粒分子是从细胞内的质粒库中随机选取出来进行复制的，所以两个不同的质粒在一个单细胞中的拷贝数并不总能保持相同。最初在随机过程中产生的微小差异，将很快导致两种质粒在拷贝数上更严重地失衡。,在一些细胞中，一种质粒处于优势，而在另一些细胞中，与之不相容的另一种质粒却占尽上风。细菌生长几代之后，占少数的质粒将会丧失殆尽，在原始细胞的后代中可含有两种质粒中的任意一种，但不会兼而有之。,通过检查不同质粒在同一细胞中共存的能力，可以把它们分为若干不相容组。带有相同复制子的质粒属于同一不相容组，而带有不可互换成分的复制子的质粒则属于不同的不相容组。现已发现30多个这样的不相容组。,4. 转移性,在自然条件下，很多质粒都可以通过一种称为细菌接合的作用转移到新宿主内。,5. 选择的标记,质粒应带有一个或几个可供选择的标记，便于对转化株的筛选。,常用来作为标记的有氨苄青霉素抗性(ampicillin resistance，ampr)基因，此基因编码内酰胺酶，该酶能水解氨苄青霉素的内酰胺环使之失效，从而赋予细菌抗药性。,另一常用的抗药性基因为四环素抗性(tetracycline resistance，tetr)基因，该基因编码一种含399氨基酸残基的膜相关蛋白质，能阻止四环素进入细胞。 ampr基因或tetr基因若被外源基因插入，便失去相应的抗药性，便于分子克隆的筛选。,大肠杆菌的lac Z基因也常被用作为选择的标记，此基因编码半乳糖苷酶，能分解一种有色基因(x)与半乳糖以糖苷键连结成的化合物x-gal。 半乳糖苷酶 X-gal X + gal 无色 蓝色产物 半乳糖,若在含有X-gal的培养剂中，在乳糖操纵子(lac operon)诱导物异丙硫半乳糖苷(isopropylthiogalactoside，IPTG)的作用下，细菌合成半乳糖苷酶，分解Xgal，此菌落成为蓝色。 若lacZ基因被外源DNA片断插入而破坏，则不能制造半乳糖苷酶，菌落为白斑。,6. 限制性内切酶单一切口,在质粒复制子以外的部位具有一种或多种限制性内切酶的单一切口，便于外源基因的插入。 若这种单一的限制性内切酶位点处于选择标记基因的内部，外源基因片断插入后会导致该基因失活便于筛选。,三、常用质粒载体,1. pBR322,pBR322是一种使用最广泛的质粒，全长为4 363bp，由3种野生型质粒成分组成，ampr基因来自pRSF2124，tetr来自pSCl01，复制起始点来自pM9。核苷酸的序次号，以EcoRI序列GAATTC的第一个T为第一个核苷酸。,2. pUC系统,如pUCl8和pUCI9，由pBR322的ampr基因和复制子，以及大肠杆菌部分1acZ基因和一个多种限制性内切酶单一位点的接头构成，全长2 666bp，pUCl8和pUCl9所含多位点接头的方向正好相反。,3表达载体,载体含有tac启动子、Lac操纵基因、SD序列、Lac I阻遏蛋白基因等。,四、质粒DNA的提取和纯化,（一）、质粒提取的主要步骤,1细菌的培养：,先分离单个菌落， 接种到含少量适当抗生素的培养基中扩增，随着细菌的生长，质粒DNA也在自主复制。,对于松弛型质粒，由于它的复制在一定程度上受到宿主细胞的控制，故在细菌对数生长后期，加入氯霉素抑制宿主蛋白质的合成和染色体DNA的复制。质粒DNA的复制不受影响而大量扩增。,对于新一代的质粒如pUC系列等，由于宿主对这些松弛型质粒的复制控制不严，利用氯霉素对质粒DNA的选择性扩增并不十分必要。,长时间在氯霉素存在下，质粒DNA合成过程中，复制链中会掺入核糖核苷酸，对碱性条件敏感，将会导致大量的缺口环状DNA和线性质粒的产生,但有些人仍然偏爱用氯霉素选择性扩增质粒，其理由是在中等体积培养物中能获取与大量培养物等同的质粒产量。而且细菌量的减少，使得裂解物的复杂性和粘稠度降低，操作更方便、有效，对煮沸法更是如此。所以使用氯霉素的主要目的，是在不减低质粒产量的前提下，减少细菌的培养体积和细菌的数量,有时质粒在细菌中的扩增状况很差，常是由于质粒携带外源基因或质粒分子量过大所致。 这种低效率扩增，可利用高营养培养基促进生长，一般可增加质粒产量4-6倍。,2细菌的收集与裂解,细胞生长过程中，排出大量代谢产物，为了提高质粒DNA的纯度，离心弃上清，细菌沉淀最好用STE或生理盐水悬浮，漂洗l-2次，离心管壁上的液体也应该仔细去除干净。,细胞的裂解方法很多，如去污剂法，沸水热裂法、碱变性法，有机溶剂法和溶菌酶法等。 不同方法各有利弊，一般要根据质粒性质、宿主菌的特性及后继的纯化方法等多种因素综合后加以选择。,3质粒DNA纯化,质粒从细菌中分离出来以后，为满足有些实验的要求还应进一步纯化。CsCl溴乙锭平衡超速离心法是纯化质粒的可靠经典方法。,但是由于此法费用昂贵及流程长，近年来，发展了几种不同的方法取代了超离法。如离子交换层析法或排阻层析法，分级聚乙二醇沉淀法等，也可获得较好质量的质粒DNA。,转基因动物，真核细胞转染及DNA外切酶酶切缺失等实验，对闭合环状双链DNA的要求较高，一般还是用超速离心法纯化质粒。,对于DNA片段酶切回收，内切酶图谱分析、细菌转化、亚克隆及探针放射性标记等实验，直接用小量或中量提取的DNA样品，并不需要超速离心纯化，一般可满足实验要求。,（二） 质粒DNA的制备,质粒DNA的小量制备 2-5ml 质粒DNA的大量制备 500ml 碱裂解法 煮沸法 SDS裂解法 Triton-溶菌酶法,（三）质粒DNA提取方法的选择,常用的煮沸法，碱法,SDS法均可获得较满意效果至于有人采用碱法提取小量细菌培养物的质粒， 用煮沸法或SDS法进行质粒DNA的大量分离， 只是各个实验室的习惯问题.,但是对于不同的菌株和不同大小的质粒DNA分子及以后进行的不同实验等具体情况，选择哪种方法制备质粒DNA，应考虑以下因素：,1菌株类型,大量提取HB101，TGl菌株中的质粒不提倡选择煮沸法，这类细菌富含糖类，在煮沸或去污剂裂解细菌时，大量释放出来。,若用CsCl-EB梯度平衡超速离心， 糖类的密度平衡区域与闭环共价质粒DNA带非常邻近，在抽取闭环质粒DNA时， 不可避免地污染有糖类，它们可抑制许多DNA限制性内切酶的活性。,另外，HB101及其它含有endA+基因型的菌株表达中的核酸内切酶A，在煮沸时不能完全失活， 在以后操作中，只要有Mg2+存在(如内切酶反应缓冲液)，核酸内切酶A就可将质粒DNA降解，而影响实验结果。,若一定要用煮沸法提取这类菌株的质粒DNA，不管是大量还是小量制备，必须用酚、氯仿反复抽提几次以去除该酶,2质粒的大小,大于15kb的质粒DNA易被强烈的物理或化学作用损坏，所以常选用操作过程较温和的SDS法。细菌悬浮液中含有10%蔗糖以提高溶液的渗透压，减轻细菌裂解时DNA泄漏过快产生的机械剪切力。,在溶菌酶消化细菌壁与膜后，再加SDS解聚蛋白质与DNA的结合。 整个操作中物理剪切力小， 适用于大分子量的质粒DNA的提取。,3细菌染色体DNA变性条件强弱的控制,碱法是目前实验室中最常用的质粒DNA提取方法。它对细菌的裂解，细菌染色体DNA及蛋白质变性充分，所以提取的质粒DNA产量高纯度好。,但是暴露在强碱性环境中时间过长， 共价闭合环状质粒DNA可发生不可逆的变性，导致内切酶切割困难，质粒DNA迁移速度降低1倍左右，EB染色效率低。,1966年Vinograd等人对这个问题作过报道，但目前，仍有些实验人员，对这一关键问题并没有足够的重视。如出现这种状况，在下次提取时，可以适当缩短碱变性时间，不必按某些书籍中规定的10分钟时间操作,在煮沸法中，过长时间，过高热度也会导致类似问题的出现，这种影响实验结果的操作细节应根据具体的菌株和质粒情况加以适当改进。,4细菌的培养与收集,细菌生长过程中的代谢废物和脱落的细胞壁成分，也会影响到质粒的质量和内切酶酶解效果。所以离心收集细菌时，上清液应去除干净，最好用STE或生理盐水再悬浮，漂洗菌体1-2次。,（四）碱裂解法原理：,在pHl2.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环(CC)质粒DNA仍为自然状态。,将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构。大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而CC质粒DNA仍然为可溶状态。,通过离心，