流式细胞仪原理.ppt

流式细胞仪 工作原理 EPICS XL/MCL FC500MCL/MPL,流式细胞术的原理,流式细胞术（FCM）是一种能对单个细胞、分子和生物颗粒（微生物）进行多参数快速检测的新型分析和分选技术。近几年随着多种单克隆抗体的成功制备和多种荧光素的应用。FCM逐步运用于对疾病诊断和治疗监测的临床检验常规工作。,基本原理,流路 流动室 鞘液SHEATH 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*1051*106个/ml 光路 光源 检测信号 光电倍增管PMT HV 电路 放大电路HV及GAIN 增益 A/D转换 统计：计算机,流 路,单细胞悬液 大多数仪器是在50-300 m 大小的孔径中,将细胞悬液注射进入鞘液中 这一过程,成为流体动力学聚焦,FLOW CELL,光 路,光源 检测信号 散射光信号 FS: 前向角散射光 SS: 侧向角散射光(90度散射光) 荧光信号 荧光染料 光学滤片 颜色补偿,电路-光电倍增管,光 路,光源 与通过的细胞聚焦在同一点上 激光 空冷 488nm blue, 633nm red, 325nm UV, 514nm green, 空冷/水冷 Enterprise II 水冷 Innova300系列 Innova70系列,检测信号,散射光信号前向散射光(FS),FS-Forward (Angel Light) Scatter 在激光束正前方的检测器, 为前向散射光检测器 FS的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形状及 optical homogeneity 有关 FS用于检测细胞或其他粒子的表面属性 如:大小,前向散射光,散射光信号 侧向散射光,SS-Side (Angel Light) Scatter 与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器, 也称为90度散射光检测器 SS的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形状及 optical homogeneity 有关 SS用于检测细胞内部结构 如:胞浆内颗粒多少, 核质比,侧向散射光,90 Degree Scatter,0,200,400,600,800,1000,8,15,20,30,40,50,100,200,1000,Lymphocytes,Monocytes,Neutrophils,Side Scatter Projection,Light Scatter Gating,Scale,光路-荧光信号,每种荧光染料均有特定的激发波长, 并激发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长. 利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些光学信号,荧光染料的特性,激发波长(EXCITING) 发射波长(EMISSION),常用荧光染料的特性,荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途 颜色 FITC 488 525 免疫荧光 绿色 PE(RD1) 488 575 免疫荧光 橙色 ECD 488 620 免疫荧光 橙红 PeCy5 488 675 免疫荧光 红 PI 488 620 DNA染色 橙红 PECy7 488 755 免疫荧光 深红 PerCP 488 670 APC 633 670,光路 - 滤片特性,当以 45o 角放置滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光 这种方式的滤片称为二向色性滤片( dichroic filter),Source light,Passed light,Certain colors absorbed,Absorbance filter,标准带通滤片 band pass,光源,通过的光谱,630/30 nm BP,615-645 nm light,Unique 4-Color Single Laser Design,PC7,Optics - Detectors,Photomultiplier tube (PMT) 将光学信号转变为电脉冲(数字数据)信号,不同的脉冲信号被转换成数字通道(CHANNEL)的过程,Single Parameter Histogram: Count vs MFI,颜色补偿,各荧光染料发射的荧光信号有重迭, 因此要进行色补偿以除去重迭部分,光谱重叠需进行色补偿,减法颜色补偿,减法补偿 去除叠加信号,在使用双色以上时会产生减得过多的错误 BD FACSCalibur 补偿试剂,全矩阵颜色补偿,全矩阵 在每个PMT上对于每一个荧光计算 “叠加荧光素” 的比率 通过矩阵去除或加上信号 EPICS XL Cytomics FC500,CD45-ECD,EPICS XL临床科研型流式细胞仪,EPICS XL,合理的光路设计 -单激光激发四色荧光标准模式 确保在同一个细胞上获得最多的信息,EPICS XL,直线光路设计，光损失少 可互换式光学滤片，方便新染料的应用,PC7,With Thanks to Dr. Frank Schnieders Gentherapie Gruppe Abteilung Molekulare Zellbiologie Institut fr Medizinische Biochemie und Molekularbiologie Universittsklinikum Hamburg-Eppendorf,EGFP, EYFP and 7-AAD With EPICS XLTM and EXPO32TM ADC-Software,HEK293 Human Embryonal Kidney Cells 293,Filter Set BP 510LAF21 BP 550LAF30 Dichroic Mirror 525DRLP,Cell Viability with 7-AAD,HEK293-cells with EYFP Transfection,HEK293-cells with EGFP Transfection,Mixture of EGFP- and EYFP-transfected HEK293-Cells EGFP . Enhanced Green Fluorescent Protein (Ex 488; Em 507 nm) EYFP . Enhanced Yellow Fluorescent Protein (Ex 513; Em 527 nm) 7-AAD .7-Aminoactinomycin (Viability Stain ; Ex 546; Em 647 nm),四色荧光中的补偿,传统补偿与ADC补偿,EPICS XL,采用最先进的通讯传输设计 -光纤通讯与数字信号传输,EPICS XL中的PRISM功能 -将多张直方图浓缩在一张上,Howard M. Shapiro, Practical Flow Cytometry, 3rd ed., page 355 “The XL is presently unique among production flow cytometer in its use of digital electronics for transformation between linear and logarithmic signals and of computer algorithm for fluorescence compensation. I have already praised this approach a few times (pp. 19, 166, 189), while also nothing that it probably represented the only practical way to implement another feature which presently distinguishes the EPICS XL from its competitors, i.e., 4-color fluorescence analysis. Both features will have the other manufacturers trying to play catch-up for a while.” “XL因為有全數字化的線性-數轉換及電腦軟體螢光補償而成為現今流式細胞分析儀系統中最獨特的產品.個人也多次表示欽佩(第19,166,189頁). EPICS XL(單一激光產生)的四個螢光分析性能,使其鶴立於其他競爭者之中.這些功能將會讓其他廠商花很長的時間來追趕”. 摘自”流式細胞分析儀系統實務第三版,1995.” 作者 Howard M. Shapiro, Practical Flow Cytometry, 3rd ed., page 355,专家评述,来自ISAC的报告,产品介绍,XL设计的所有优势： 单激光激发四色荧光 光纤通讯 数字化信号传递 可互换式光学滤片，无需调整光路 具有620nm的滤片,最适合DNA倍体分析 利用软件进行全矩阵优化（ADC)颜色补偿 PRISM 浓缩柱形图 快速调节电压 快速调整补偿 补偿向导 利用生物样本进行颜色补偿 WINDOWS界面操作软件,Cytomics FC500,MCL 进样 MCL 自动模式. MCL 直接( 或手动) 模式. 单管固定位置进样. 可以暂停 / 旋转以方便随时添加刺激剂等 条码识别 样本混匀,产品介绍：硬件,产品介绍：硬件,可选MPL (研究用) 24 孔 每孔样本体积0.5 2.5 ml 96 孔 最少体积200 ul 40 管 (12x75mm) 最少体积500 ul 固定样本体积 吸样25 ul 样本混匀功能,FC500特点,1根激光同时激发5色荧光 2根激光可选 3种进样方式 4种直方图分辨率 5色荧光同时检测,全球第一台单激光激发五色荧光的流式细胞仪 全球唯一一台获得Quality