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第四章 天然酶的纯化与制备,天然酶制备的基本步骤,天然酶的制备一般包括三个基本步骤： 酶的提取 酶的分离纯化 酶的结晶或制剂,第一节 天然酶的一般制备方法,酶的分离纯化是酶学研究的基础。 研究酶的性质、作用、反应动力学、结构与功能关系、阐明代谢途径，作为工具酶等都需要高度纯化的酶制剂。 如基因工程中所使用的各种工具酶都有高纯度的要求，内切酶中不能含有外切酶，反之一样，否则结果无法判断。,一、酶的提取,酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。也称作酶的抽提。,一、酶的提取,酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。大多数酶能溶解于水，可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液提取；有些酶与脂质结合或含较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中，要注意控制好温度、pH值等各种条件。,酶提取的主要方法,根据酶提取时所采用的溶剂或溶液的不同，酶的提取方法主要有盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取等。,二、酶的分离纯化方法,酶的化学本质是蛋白质，所以用于蛋白质的分离纯化方法一般适用于酶的分离纯化。此外酶是具有催化功能的蛋白质，因此根据酶与底物、底物结构类似物、辅助因子、抑制剂等的特异亲和力可发展酶独特的亲和层析技术。所有的分离纯化方法，都是根据被分离物质间的物理、化学和生物学性质的差异而设计出来的。,盐析法,一般蛋白质在低离子强度介质中表现为盐溶(salted in)、而在高离子强度介质中表现为盐析(salted out)，但不同的蛋白质盐析所需的离子强度不同。盐析法就是建立在此原理的种简便有效的分离方法。,盐析法,硫酸铵是最常用的盐，因其在水中溶解度大，且受温度影响小，对酶不仅无害处。而且还起稳定作用分级效果较好且价廉易得。可采用：a加固体粉末盐；b加饱和盐溶液；c. 对浓盐溶液进行透析等方式。一般对于大体积样品采用a，对于小体积样品采用b或c。通常层析洗脱液蛋白质浓度低，采用c方式沉淀蛋白质很方便。,有机溶剂沉淀法,随着有机溶剂的加入，介质的介电常数下降，使蛋白质分子间静电作用力增强；同时有机溶剂还可降低蛋白质分子表面的水合程度，从而导致蛋白质溶解度下降直至最后沉淀下来。,有机溶剂沉淀法,最常使用的有机溶剂是乙醇、丙酮等。由于有机溶剂能使酶变性，一般应在低温下操作。同时宜加入适量中性盐，可增加蛋白质溶解度降低变性作用，并提高分级效果。使用有机溶剂沉淀酶有两种方式：其一，如上所述，用乙醇或丙酮分级沉淀目的酶。其二，若目的酶在有机溶剂中稳定性强，可采用变性杂蛋白方式，使酶得到初步纯化。,等电点沉淀法,当介质的pH值与某蛋白质的等电点(pI)相等该蛋白质分子间的排斥力最小其溶解度亦最小，易于沉淀。因此可通过调节介质pH值把目的酶与杂蛋白分开。此种沉淀法亦受介质离子强度等因素的影响。由于蛋白质在pI附近一定范围的pH值下都可发生沉淀，只是沉淀的程度很不一样，再者相当多的蛋白质pI点很靠近，所以该法的分级效果和回收率均不理想一般只用在酶的粗分离阶段。,凝胶过滤层析,它又称凝胶过滤、分子筛层析、凝胶渗透层析、排阻层析。它是依据分子筛效应，按分子的大小和形状来分离样品。因此它也可用于蛋白质分子量的测定。此法具有条件温和，操作简便，层析柱可反复使用无需再生处理等优点。,离子交换层析,蛋白质是两性电解质。不同蛋白质出于其pI不同，在同一种pH值介质中电离状况会不同，分子所带电荷的种类和数量就不同与离于交换剂的静电吸附能力亦不同。通过上样吸附和改变离子强度或pH值解吸洗脱、可使蛋白质依据其静电吸附能力由弱到强的顺序而分离开来。这就是离子交换层析法。它是一个重要而广泛应用的方法。,亲和层析,亲和层析就是将配体共价连接到基质上，用此种基质填充成层析柱，利用配体与对应的生物大分子(目的物)的专一亲和力，将目的物与其它杂质分离开。这一方法不仅可用于分离生物大分子，也可用于分离诸如病毒、细胞器、细胞之类的超分子结构。其操作与离子交换层析类似。,吸附层析,吸附层析是以吸附剂为固定相以缓冲溶液或有机溶剂为流动相的一种层析方法。可用的吸附剂有羟基磷灰石、硅胶、高岭土、纤维素、活性炭等。这些都是蛋白质层析的经典材料。应选择吸咐选择性好、稳定性强、表面积大、颗粒均匀、成本低廉的吸附剂。,电泳法,电泳是带电物质在直流电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象 由于蛋白质分子表面电荷的差异，应用电泳方法可将不同的蛋白质分子分离开来。 电泳法不仅可用于酶的纯化工作，还常用于酶纯度鉴定及理化性质(如pI、亚基分子量等)测定。特别是在分离微克量蛋白质时。,离心法,利用离心机产生的离心力来分离不同物质的过程称为离心。,膜分离法,膜分离法不仅可分离分子量差异显著的蛋白质，还可用于样品的脱盐、浓缩。酶分离纯化工作中常使用各种不同材料制成的固体半透膜进行超滤或透析。 超滤 它是依据溶液中分子的大小和形状进行选择性过滤的方法,在外加压力下，驱动酶液中的溶剂分子和较小的溶质分子穿过膜，而截留分子量大的溶质分子。它常用于酶液的脱盐和浓缩。,三、酶的结晶,酶的结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。酶的结晶是酶分离纯化的一种手段，它不仅为酶学研究提供了适合的样品，而且为较高纯度的酶的获得和应用创造了条件。,酶的结晶,酶在结晶时，酶液应达到一定的浓度。浓度太低是无法析出结晶的。一般来说，酶的浓度越高，就越容易结晶。但浓度过大时，会形成很多小晶核，结晶小，不易长大。故此结晶时应控制好酶液浓度。,1. 盐析结晶法,在适宜的温度和pH值等条件下，缓慢增加酶液中盐的浓度，使酶的溶解度慢慢降低，进行酶的结晶。 盐析结晶所采习的中性盐是硫酸铵，也可采用硫酸钠等其他中性盐。,1. 盐析结晶法,盐析结晶时，一般是把饱和盐溶液慢慢滴加到浓酶液中，至呈现稍微浑浊为止。让其在一定温度下(一般在0一10的低温条件下)放置一段时间，慢慢析出结晶，再缓慢而均匀地补加少量饱和盐溶液，直至结晶完全。有时也可用固体硫酸铵粉末代替。,1. 盐析结晶法,盐析结晶还可以采用抽提法。即将酶液先经硫酸铵盐析得到的酶沉淀，用较高饱和度的冰冷的硫酸铵溶液抽提，使一部分酶溶解，分离后上清液在室温下放置，慢慢析出结晶，剩下的沉淀依次用冰冷的较低饱和度的硫酸铵溶液再行抽堤。由于低温时酶在硫酸铵溶液中的溶解度较高，温度升高时溶解度降低，所以当酶的抽提液在室温放置时，酶会慢慢析出结晶。抽提时所采用的硫酸铵溶液的饱和度应根据酶盐析沉淀的饱和度决定。,2. 有机溶剂结晶法,在经过浓缩和初步纯化的酶液中，调节pH值到酶稳定的pH值，用冰浴冷却至0 左右，边搅拌边慢慢加入有机溶剂，当酶液稍微出现浑浊时，在冰箱放置12h，离心去除沉淀，取上清液置于冰箱中让其慢慢析出结晶。,2. 有机溶剂结晶法,有机溶剂结晶的优点是含盐少，结晶时间较短。但操作要在低温下进行，以免引起酶变性失活。 有机溶剂结晶常用的溶剂有乙醇、丙酮等。,3. 透析平衡结晶法,将初步纯化的浓缩酶液装在透析袋中，在一定浓度的盐溶液或有机溶剂或一定pH的缓冲溶液中进行透析。经一段时间后，酶液渐渐达到过饱和状态而析出结晶。,4. 等电点结晶法,通过缓慢地改变酶液的pH值，使之逐步到达酶的等电点而使酶析出结晶。,第二节 胰酶的生产制备工艺,一、概述：,胰酶(Pancreatin)是从猪、牛、羊等动物胰脏中提取得到的一种混合酶制剂。主要成分为胰蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶，还有羧肽酶和核酸酶等。在动物胰脏中含有丰富的消化酶，这些酶都有为满足机体需要的天然比例和活性。提取的药用酶是否大致具有原胰脏中菌的天然比例和活性，与生产工艺有很大关系。,一、概述：,胰酶能溶于水及低浓度的乙醇，在乙醚和高浓度的乙醇中均不溶，不耐热，强酸和强碱均能使之破坏，但在中性和弱碱性的溶液中稳定，其最适温度40，最适pH为89。,一、概述：,胰腺经刨碎后,内、外肽酶、蛋白酶等以无活性的酶原形式释放于溶液,须经激活后才具有水解消化蛋白质、淀粉和脂肪的能力。而在胰腺激活提取过程中,当蛋白酶大量激活后,会随之水解破坏同一体系内的胰淀粉酶、胰脂肪酶等酶类物质,使活力下降,胰酶的收率降低。,二、胰酶的制备工艺流程,刨碎 激活 提取 预冷 胰腺 胰浆 胰乳 提取液 沉淀 压榨制粒 脱脂干燥 酶沉淀物 粗酶颗粒 粉碎 胰酶原粉,三、胰酶的活性测定,胰酶的活性测定按1977版中国药典采用酪蛋白测定方法；按1995版中国药典采用三酶活性测定；按出口标准主要测定胰酶中所含激肽释放酶活性。,四、胰酶的药理作用与临床应用,胰酶在临床上主要作为助消化药，主要用于消化不良、食欲不振及肝、胰腺疾病引起的消化障碍。我国大多数生化药厂生产的药用胰酶原粉主要用于制成多酶片、胰酶片等,或作为原料药出口到日本等国家,用于生产提取激肽释放酶等高附加值药品,而其中所含激肽释放酶活性是其检测的重要指标。,第三节 胃蛋白酶的生产制备 工艺,一、概述：,胃蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于胃粘膜中，经胃酸激活后才能成为有活性的胃蛋白酶。 H+ 胃蛋白酶原 胃蛋白酶+胃蛋白酶抑制剂其它肽 (分子量42500） （分子量34500) (分子量3100) 胃蛋白酶易溶于水，生成带乳光的溶液，难溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂；最适温度40，最适pH为1.52.0。,二、胃蛋白酶的制备工艺流程,激活提取 浓缩 去杂蛋白 胃粘膜 提取液 上清液 丙酮分级沉淀 胃膜素 脱脂真空干燥 粉碎 胃蛋白酶 胃蛋白酶原粉,三、胃蛋白酶的活性测定,胃蛋白酶的活性测定按1977版中国药典采用卵蛋白测定方法；按1995版中国药典采用血红蛋白活性测定；,四、胃蛋白酶的药理作用与临床应用,胃蛋白酶在临床上主要作为助消化药。用于制成多酶片、胃酶片等,主治消化不良,食欲不振以及有关老年性疾病。,第四节 细胞色素C的生产制备 工艺,一、概述：,细胞色素是包括多种能够传递电子的含铁蛋白质总称。它广泛存在于各种动物、植物组织和微生物中。细胞色素是呼吸链中极重要的电子传递体，细胞色素C只是细胞色素的一种。它主要存在于线粒体中，需氧最多的组织如心肌及酵母细胞中，细胞色素C含量丰富。,一、概述：,细胞色素C为含铁卟啉的蛋白质，分子量约为13000，蛋白质部分由104个左右的氨基酸残基组成。它溶于水，在酸性溶液中溶解度更大，故可自酸性水中提取，制品可分为氧化型和还原型两种，前者水溶液呈深红色，后者呈桃红色。细胞色素C对热、酸和碱都比较稳定，但三氯乙酸和乙酸可使之变性失活。,二、细胞色素C的制备工艺流程,绞碎 提取 中和 吸附 洗涤 洗脱 猪心 提取液 盐析 三氯乙酸沉淀 溶解 洗脱液 细胞色素C沉淀 透析 柱层析 去热原 制剂 细胞色素C粗品 成品,三、细胞色素C的活性测定,上述制备的细胞色素 C是还原型和氧化型的混合物，在测定时要加入联二亚硫酸钠，使氧化型变为还原型。还原型细胞色素C水溶液在520nm波长处有最大吸收值，根据这一特性可用细胞色素C标准品，画出浓度对吸收值的标准曲线，然后由标准曲线求出所测样品的含量。,四、细胞色素C的临床应用,细胞色素C是生物体内细胞呼吸的重要酶,是呼吸链中极重要的电子传递体，在临床上主要用于治疗脑出血、脑血管障碍、心肌梗死、一氧化碳中毒、安眠药中毒等症。,第五节 激肽释放酶的生产 制备工艺,一、概述：,激肽释放酶(kallikrein，下简称K酶)属丝氨酸蛋白酶。广泛存在于血浆、胰、肾、颌下腺、肠、胰液、尿及蛇毒中。药用K酶又称血管舒缓素，主要来自颌下腺或胰腺。 K酶是一种含有唾液酸的糖蛋白，在腺体中以酶原的形式存在。 K酶由二条多肽链组成，分子量为28600。,三、激肽释放酶的活性测定,国内现行标准是根据猪颌下腺K酶制定的。部颁标准规定：注射用血管舒缓素效价每1mg不得少于10单位，口服用每1mg不得少于5个单位。 测定原理：K酶可催化水解底物BAEE生成Na苯甲酰L精氨酸和乙醇在253nm波长处，光吸收的增值与K酶在一定范围内呈线性关系。酶促反应时的底物浓度采用0.510-3molL，。,四、激肽释放酶的药理作用 与临床应用,K酶在机体内系由组织蛋白水解酶催化K酶原转变而成。形成的K酶可作用激肽原使之变成激肽。而激肽能使血管舒张与毛细血管通透性增强，从而使心血管病缓解。激肽还能增加肾皮质血流，增加肾小管毛细血管压力，抑制肾小管对钠的吸收，产生利尿作用，从而也能引起血压下降。,四、激肽释放酶的药理作用 与临床应用,1) 主要用于增加冠状动脉、脑、视网膜等处的血流量，可治疗高血压、冠状动脉及脑动脉血管硬化，心绞痛、初老期循环障碍等症。对由血液循环障碍引起的组织营养不良、血管痉挛、肢端感觉异常及麻木等症也有明显疗效。 2) 本品能溶解血纤维蛋白，因此对由于血纤维蛋白在小血管中堵塞所致的血栓及炎症有治疗作用，也可外用于治疗冻疮，对血管闭塞性脉管炎也有一定疗效。 3) 用于治疗微循环障碍疾病，如夜间异常臂痛、小腿麻木疼痛等病。 4) 其他 有报道用K酶治疗男性不育症，用药后精子数显著增加。还可治疗圆形脱毛症。该酶还是优良的皮肤保护剂，也可作为老年人的保健药物和抗衰老药物应用。,第六节 超氧化物歧化酶的生产 制备工艺,一、概述：,超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase）简称SOD，广泛存在于生物体内，按所含金属离子的不同，分为三种：铜锌超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）、锰锌超氧化物歧化酶 (MnZn-SOD)、铁超氧化物歧化酶（Fe-SOD）。SOD催化如下反应：O2-+O2-+2H+H2O2+O2 在生物体内，它是一种重要的自由基清除剂。,二、超氧化物歧化酶的制备工艺流程,离心 洗涤 溶血 去血红蛋白 牛血 红细胞 溶血液 K2HPO4分液 丙酮沉淀 溶解 粗提液 上清液 沉淀 透析 DE-32柱层析 G-50柱层析 SOD精品,三、超氧化物歧化酶的活性测定,采用邻苯三酚自氧化法。邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物。反应开始后，反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间产物不断氧化的结果。这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留3045s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内。中间物在420nm波长处有强烈光吸收，当有SOD存在时，由于它能催化O2-和H结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间物的积累，因此，通过计算就可求出SOD的酶活性。,四、超氧化物歧化酶的临床应用,SOD不仅在生物体内对抗氧化、解毒等起重要作用,而且也有抗辐射、抗肿瘤及抗衰老等功能。超氧化物歧化酶能清除生物体内的超氧阴离子自由基,在炎症、自身免疫性疾病、肿瘤及辐射损伤、衰老等疾病防治方面起着十分重要的作用，,第七节 尿激酶的生产制备工艺,一、概述：,1861年发现尿中有溶解蛋白的活性物质，随后于1885年报道了此活性物质有溶解纤维蛋白凝块的功能，1952年将人尿中纤维蛋白溶酶原的激酶命名为尿激酶(urokinase，UK)。UK是由肾细胞产生的一种碱性蛋白酶，为纤维蛋白溶酶原激活剂。uK主要存在于人及哺乳动物尿中，人尿平均含量约56IUml。天然UK的分子量为54000，丝氨酸和组氨酸是UK活性中心的必需氨基酸。,二、尿激酶的制备工艺流程,药用UK主要从新鲜人尿中提取，目前主要有三种方法。其一是发泡法，即高速搅拌使尿液发泡，然后泡沫液化，加入硫酸铵，使UK沉淀得粗品；其二是沉淀法，于尿液中加入沉淀剂(常用鞣酸、苯甲酸、重金属离子等)使UK沉淀，其三是最常用的吸附剂法，即选择适当的吸附剂有选择性地吸附UK，然后分离纯化。吸附剂种类较多，如硅胶、硅藻土、734树脂、活性炭等。,三、尿激酶的活性测定,中国药典规定：本品系从新鲜人尿中提取的一种能激活纤维蛋白溶酶原的酶。它是由高分子量54000和低分子量33000组成的混合物，HUK含量不得小于90，每1mg蛋白中UK活力不得少于100000单位。,UK的效价测定方法有气泡上升法、小球下落法、纤维素平板法、底物合成法和HPLC法等。现行药典标准采用气泡上升法和氮测定法检测比活力。,四、尿激酶的药理作用与临床应用,UK属蛋白分解酶，在体内可作为酶原激活剂，活化血纤溶酶原成为血纤溶酶。UK对血纤维蛋白，血纤维蛋白原，凝血因子V、等均有溶解作用，因而具有溶血栓、抗凝血的功能，故是一种高效的溶血栓剂。此外，动物实验还发现UK有明显降低血压的作用。,四、尿激酶的药理作用与临床应用,目前，临床上已将UK用于治疗各种血栓的形成、血栓梗塞性疾病，如脑血栓、中央视网膜血管闭塞症、急性心肌梗死、肺栓塞、四肢及周围动脉血栓症等，还用于动静脉交支血栓以及风湿性关节炎等。,第八节 微生物酶的开发,应用微生物来开发酶的优点：,(1)微生物生长繁殖快，生活周期短。因此，用微生物来生产酶产品，生产能力（发酵）几乎可以不受限制地扩大，能够满足迅速扩张的市场需求。 (2)微生物种类繁多，它们散布于整个地球的各个角落，而且在不同的环境下生存的微生物都有其完全不同的代谢方式，能分解利用不同的底物。 (3)这一特征就为微生物酶品种的多样性提供了物质基础。 (4)特别是当基因工程介入时，动植物细胞中存在的酶，几乎都能够利用微生物细胞获得。,微生物酶的开发,因此，有计划和仔细地筛选微生物菌种，通常可以获得能够生产几乎任何一种酶的适当细胞。,微生物酶开发的一般程序,(一) 样品的采集 采样的目的、采样地点、采样方法及采样的数量。,微生物酶开发的一般程序,(二) 菌种的分离 培养基的确定、培养条件的确定。,微生物酶开发的一般程序,(三) 菌种的初筛 (1)用简单的定性反应进行初筛； (2)在最初分离阶段就给予特殊的培养基或培养条件，进而让目的菌株得以繁殖，尽可能地把只成为目的菌的菌株或只将其最适菌株的一株纯化分离。,微生物酶开发的一般程序,(四) 菌种的复筛 初筛之后，还要进行复筛。复筛的目的是在初筛的基础上，筛选产酶量高、性能更符合生产要求的菌种。 酶活的测定方法的建立尤其重要。,微生物酶开发的一般程序,(五) 对复筛获得菌株的要求 (1)不是致病菌； (2)菌株不易变化和退化； (3)不易感染噬菌体； (4)微生物产酶量高； (5)酶的性质符合应用的需要，而且最好是胞外酶； (6)产生的酶便于分离和提取，得率高； (7)微生物培养营养要求低。,微生物酶开发的一般程序,(六) 最佳产酶条件的初步确定 (1)培养方式的确定； (2)最佳培养条件组合； (3)微生物产酶的特性(胞内酶、胞外酶)； (4)微生物酶收集的时间顺序；,微生物酶开发的一般程序,(七) 微生物产酶性能的进一步提高 (1)获得高产菌种的突变体； (2)利用代谢工程和代谢调节机理来提高微生物的酶产量； (3)运用遗传工程、基因工程的手段将原有菌株中的目的基因转移到另外一些对生产环境更适应性的微生物细胞之内，使其高效表达；,微生物酶开发的一般程序,(八) 微生物酶的提取方法 (1)酶的粗提； (2)酶的精制。,微生物酶开发的一般程序,(九) 微生物产酶菌种的保藏 (1)斜面； (2)沙土管； (3)冷冻。,第五章 酶的人工模拟,第一节 模拟酶的理论基础和策略,一、模拟酶的概念 模拟酶又称人工酶或酶模型，它是生物有机化学的一个分支。 模拟酶是在分子水平上模拟酶活性部位的形状、大小及其微环境等结构特征，以及酶的作用机理和立体化学等特性的一门科学。 可见，模拟酶是从分子水平上模拟生物功能的一门边缘科学。,二、模拟酶的理论基础,1模拟酶的酶学基础 酶的催化机制：酶先与底物结合，进而选择性稳定某一特定反应的过渡态，降低反应的活化能从而加快反应速度。 设计模拟酶一方面要基于酶的作用机制，另一方面则基于对简化的人工体系中识别、结合和催化的研究。要想得到一个真正有效的模拟酶，这两方面就必须统一结合。 在设计模拟酶时除具备催化基团之外还要考虑到与底物定向结合的能力。,二、模拟酶的理论基础,2. 超分子化学 （1）“主客体”化学 Cram把主体与客体通过配位键或其他次级镁形成稳定复合物的化学领域称为“主客体”化学，主客体化学的基本意义来源于酶和底物的相互作用，体现为主体和客体在结合部位的空间及电子排列的互补，这种主客体互补与酶和它所识别的底物结合情况近似。,（2）超分子化学 超分子的形成源于底物和受体的结合，这种结合基于非共价键相互作用，如静电作用、氢键和范德华力等。当接受体与络合离子或分子结合成稳定的，具有稳定结构和性质的实体，即形成了“超分子”，它兼具分子识别、催化和选择性输出的功能。,主客体化学和超分子化学已成为酶人工模拟的重要理论基础，是人工模拟酶研究的重要理论武器。,在设计模拟酶之前应当对酶的结构和酶学性质有深入的了解； 酶活性中心底物复合物的结构； 酶的专一性及其同底物结合的方式与能力； 反应的动力学及各中间物的知识。,设计人工酶模型应考虑如下因素： （1）非共价键相互作用； （2）反应定向发生； （3）模型应具有足够的水溶性，并在接近生理条件下保持其催化活性。,第二节 模拟酶的分类,根据Kirby分类法，模拟酶可分为： 单纯酶模型，即以化学方法通过天然酶活性的模拟来重建和改造酶活性； 机理酶模型，即通过对酶作用机制诸如识别、结合和过渡态稳定化的认识，来指导酶模型的设计和合成； 单纯合成的酶样化合物，即一些化学合成的具有酶样催化活性的简单分子。,按照模拟酶的属性，模拟酶可分为： 主客体酶模型，包括环糊精、冠醚、穴醚、杂环大环化合物和卟啉类等； 胶束酶模型； 肽酶； 抗体酶； 分子印迹酶模型； 半合成酶等； 近年来又出现了杂化酶和进化酶。,一、主客体酶模型,（一）环糊精酶模型： 环糊精(cyclodextrin，简称CD)是由多个D葡萄糖以1，4糖苷键结合而成的一类环状低聚糖，CD分子外侧是亲水的，其羟基可与多种客体形成氢键，其内侧是C3，C5上的氢原子和糖苷氧原子组成的空腔，故具有疏水性，因而能包结多种客体分子，很类似酶对底物的识别。,环糊精作为酶模型,利用环糊精为酶模型已对多种酶的催化作用进行了模拟。在水解酶、核糖核酸酶、转氨酶、氧化还原酶、碳酸酐酶、硫胺素酶和经羟醛缩合酶等方面都取得了很大的进展。,合成的主客体酶模型,(二) 合成的主客体酶模型 用合成的冠醚、穴醚、环番、环芳烃等大环多齿配体用来构筑酶模型。,二、胶束模拟酶,胶束在水溶液中提供了疏水微环境(类似于酶的结合部位)，可以对底物束缚。如果将催化基团如咪唑、硫醇、羟基和一些辅酶共价或非共价地连接或吸附在胶束上，就有可能提供“活性中心”部位，使胶束成为具有酶活力或部分酶活力的胶束模拟酶。,模拟水解酶的胶束酶模型：,组氨酸的咪唑基常常是水解酶的活性中心必需的催化基团。如将表面活性剂分子上连接上组氨酸残基或咪唑基团上，就有可能形成模拟水解酶的胶束。,单分子胶束酶模型,将表面活性剂利用化学反应偶联在一起，制备出单分子胶束酶模型，这种酶模型比一般胶束酶优越，它既具备酶的疏水特性，同时又可以使催化基团引人疏水空腔，催化效率提高了105倍。,三、肽酶,模拟天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。,四、半合成酶,半合成酶是以天然蛋白质或酶为母体，用化学或生物学方法引进适当的活性部位或催化基团，或改变其结构从而形成一种新的“人工酶”。 如将枯草杆菌蛋白酶活性部位的丝织酸(Ser)残基，经苯甲基磺酰氟特异性活化后，再用巯基化合物取代，将丝氨酸转化为半胱氨酸。虽然产生的巯基化枯草杆菌蛋白酶对肽或酯没有水解活力，但能水解高度活化的底物(如硝基苯酯等)。,第三节 印 迹 酶,一、分子印迹技术概述 如果以一种分子充当模板，其周围用聚合物交联，当模板分子除去后，此聚合物就留下了与此分子相匹配的空穴。如果构建合适，这种聚合物就橡“锁”一样对钥匙具有选择性识别作用，这种技术被称为分子印迹。,分子印迹技术,所谓分子印迹是制备对某一化合物具有选择性的聚合物的过程。这个化合物叫印迹分子，也叫做模板分子。 此技术包括如下内容： 选定印迹分子和功能单体，使二者发生互补反应； 在印迹分子单体复合物周围发生聚合反应；用抽提法从聚合物中除掉印迹分子。 结果，形成的聚合物内保留有与印迹分子的形状、大小完全一样的孔穴。该聚合物能以高选择性重新结合印迹分子。,分子印迹聚合物的制备方法：,分子印迹聚合物的制备方法： 选定印迹分子和单体，让他们之间充分作用； 在印迹分子周围发生聚合反应； 将印迹分子从聚合物中抽提出去。 于是，此聚合物就产生了恰似印迹分子的空间，并对印迹分子产生识别能力。,分子印迹分子,可用于分子印迹的分子很广泛(如药物、氨基酸、碳水化合物、核酸、激素、辅酶等)，它们均已成功地用于分子印迹的制备中。 分子印迹聚合中应用最广泛的聚合单体是羧酸类(如丙烯酸、甲基丙烯酸、乙烯基苯甲酸)、磺酸类以及杂环弱减类(如乙烯基吡啶、乙烯基咪唑)，其中最常用的体系为聚丙烯酸和聚丙烯酞胺体系。若要产生对金属的配合作用则应用氨基二乙酸衍生物。,二、分子印迹酶,通过分子印迹技术可以产生类似于酶的活性中心的空腔，对底物产生有效的结合作用，更重要的是利用此技术可以在结合部位的空腔内诱导产生催化基团并与底物定向排列。,1. 印迹底物及其类似物,如Mosbach等应用分子印迹法制备具有催化二肽合成能力的分子印迹酶。所合成的二肽为Z-L-天冬氨酸与L苯丙氨酸甲酯缩合产物，它们分别以底物混合物(ZL天冬氨酸与L苯丙氨酸为1：1混合)以及产物二肽为印迹分子，以甲基丙烯酸甲酯为聚合单体，二亚乙基甲基丙烯酸甲酯为交联剂，经聚合产生了具有催化二肽合成能力的二肽合成酶。研究表明以产物为印迹分子的印迹聚合物表现出最高的酶催化效率，在反应进行48h后，其二肽产率达到63而以反应物为印迹分子的印迹聚合物催化相同的反应时二肽产率却较低。,2印迹过渡态类似物,用过渡态类似物作印迹分子制备的印迹聚合物也能结合反应过渡态，降低反应活化能，从而加速反应。 如用对硝基苯乙酸酯水解反应的过渡态类似物对硝基苯甲基磷酸酯作印迹分子制备聚合物，制得的MIP证明能优先结合过渡态类似物，并能加速对硝基苯乙酸酯水解成对硝基酚和乙酸。,第四节 抗 体 酶,一、抗体酶概述： 催化抗体是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的属性，因此，催化抗体也叫抗体酶。,酶和抗体的本质差别在于：酶是能与反应过渡态选择结合的催化性物质而抗体是和基态分子结合的催化性物质。 抗体酶的发现不仅提供了研究生物催化过程的新途径，而且能为生物学、化学和医学提供具有高度特异性的人工生物催化剂，并可以根据需要使人们获得具有某些不能被酶催化或较难催化的化学反应催化剂。,二、抗体酶的制备方法,迄今，大多数抗体酶是通过理论设计合适的与反应过渡态类似的小分于作为半抗原，然后让动物免疫系统产生针对半抗原的抗体来获得的。由于以反应的过渡态类似物为半抗原诱导的抗体在几何形状和电学性质上与反应过渡态互补，因而稳定了过渡态，从而加速反应。,1稳定过渡态法：,以Pauling的稳定过渡态理论为指导，即利用反应的过渡态类似物作为半抗原产生抗体酶。 Shultz小组利用与底物扭曲构象相似的扭曲卟啉作半抗原制备的抗体可催化卟啉金属螯合反应。亚铁螯合酶是血红素生物合成途径中的末端酶，可催化亚铁离子插入原卟啉的生物合成。N甲基原卟啉由于内部甲基取代而呈扭曲结构，它是此酶的有效抑制剂，也与酶催化的卟啉金属螯合反应的过渡态类似。由于甲基卟啉的抗体可催化平面结构原卟啉的金属螯合，这就为该反应过渡态扭曲结构的作用提供了证据。,2抗体与半抗原互补法,抗体常含有与配体功能互补的特殊功能基。已经发现带正电的配体常能诱导出结合部位带负电残基的配体，反之亦然。抗体与半抗原之间的电荷互补对抗体所具有的高亲和力以及选择性识别能力起着关键作用。,Shokat等利用抗体与半抗原之间的电荷互补性，制备了针对带正电半抗原的抗体，结果在抗体结合部位上产生带负电的羧基，可作为一般碱基催化消除反应。,三、抗体酶的应用,1 抗体酶在有机合成中的应用: 各类精细化工产品和合成材料的工业生产需要具有精确底物专一性和立体专一性的催化剂，而这正是催化抗体的突出特点。特别是那些天然酶不能催化的反应，可通过设计定做抗体酶来弥补天然酶的不足。,2 . 用于阐明化学反应机制,3. 抗体在医疗上的应用: Landry等用可卡因降解的过渡态类似物磷酸单酯产生的单克隆抗体3B9催化可卡因降解，此抗体酶的催化活性比血液中分解可卡因的丁酰胆碱酯酶要高，水解后的可卡因片断失去了刺激功能，因此，用人工抗体酶的被动免疫也许能提供阻断可卡因上瘾的治疗从而达到戒毒的目的。,四、抗体酶的研究进展,1反应性免疫 2抗体酶的化学筛选 3. 抗体酶催化的化学转化,第六章 酶制剂的应用,第一节 概论,1.工业用酶制剂的市场和发展 2.我国酶制剂应用方面的现状和问题 3.工业酶制剂的来源与特点 4.选择使用酶制剂时应考虑的因素 5.酶制剂产品的开发热点,我国酶制剂应用方面的现状和问题,1.酶制剂企业规模太小； 2.酶制剂品种少，产品结构极不合理； 3.对酶制剂的开发热情不高，主要依赖于各大学及科研机构，经费投入不足； 4.酶制剂生产成本太高； 5.生产装备落后； 6.酶制剂应用领域十分狭窄，主要集中于洗涤剂、淀粉加工、乙醇和酒类生产。,工业酶制剂的来源与特点,工业酶制剂主要来源于动物、植物和微生物，尤其是微生物，因微生物繁殖速度快；种类繁多，品种齐全；培养方法简单，易于大批量生产。 工业酶制剂的特点：一般而言，含杂蛋白的酶制剂比纯品稳定，干燥品比液体制剂稳定。酶是通过催化活性而不是一般质量来识别和出售的。,选择使用酶制剂时应考虑的因素,（1）底物特异性 （2）pH （3）温度 （4）激活剂和抑制剂 （5）价格因素,酶制剂产品的开发热点,（1）食品加工用酶， （2）饲料用酶，特别是植酸酶， （3）纺织用酶 （4）洗涤剂用酶 （5）临床诊断用酶、治疗用酶、化妆品用 酶,第二节 酶在食品加工方面的应用,一、酶法生产葡萄糖,国内外萄萄糖的生产大都采用酶法。酶法生产葡萄糖是以淀粉为原料，先经淀粉酶液化成糊精，再用糖化酶催化生成葡萄糖。,淀粉的液化,淀粉先加水配制成浓度为30一40的淀粉浆，pH值一般调至6.065，添加一定量的淀粉酶后，在8590的温度下保温45min左右，使淀粉液化成糊精。液化反应一般以碘反应颜色正好消失时为终点。,淀粉液的糖化,液化完成后，将液化淀粉液冷却至5560，pH调至4.55.0，加入适量的糖化酶，保温糖化48h左右，使糊精转变为葡萄糖。,葡萄糖生产应注意的问题,所采用的淀粉酶和糖化酶都要求达到一定的纯度。尤其是糖化酶中应不含或尽量少含葡萄糖苷转移酶。因为葡萄糖苷转移酶会催化葡萄糖生成异麦芽糖等杂质，会严重影响葡萄糖的收率。 去除葡萄糖苷转移酶的最简单的方法之一是将糖化酶配成酶液后，加酸调节pH值至2.02.5，室温下静置一段时间，可以选择性地破坏葡萄糖苷转移酶。,二、果葡糖浆的生产,果葡糖浆是由葡萄糖异构酶催化葡萄糖异构化生成部分果糖而得到的葡萄糖与果糖的混合糖浆。,方 法,将精制葡萄糖溶液调节pH为6.57.0，加入0.01mol/L的硫酸镁，在6070的温度条件下，由葡萄糖异构酶催化生成果葡糖浆。异构化率一般为4245。 镁离子和钴离子是葡萄糖异构酶的激活剂，所以葡萄糖液中需加入0.01mol/L左右的硫酸镁。,三、啤酒发酵,在啤酒生产过程中，制浆和调理两个阶段需使用酶制剂。 在浸泡麦芽浆时，需使用蛋白酶、 淀粉酶和糖化酶。 在发酵完毕后，啤酒需要进一步酶处理。木瓜蛋白酶、波萝蛋白酶可以降解使啤酒浑浊的蛋白质组分，延长啤酒的储存期。,四、在蛋白制品加工方面的应用,酶在蛋白制品加工中的主要用途是改善组织，嫩化肉类，转化废弃蛋白质成为供人类使用或作为饲料的蛋白质浓缩液，因而可以增加蛋白质的价值和可利用性。 用木瓜蛋白水解酶制成嫩肉粉，使肉食嫩滑可口。 用蛋白酶生成明胶。 用溶菌酶处理肉类，则微生物不能繁殖，因此肉类制品可以保鲜和防腐等。 葡萄糖氧化酶在食品工业上主要用来去糖和脱氧，保持食品的色、香、味，延长保存时间。,五、在水果、蔬菜加工方面的应用,用果胶酶处理溃碎果实，可加速果汁过滤，促进澄清。主要依靠降低粘度使悬浊物质失去保护胶体而沉降。 葡萄糖氧化酶可除去果汁、饮料、罐头食品和干燥果蔬制品中的氧气，防止产品氧化变质，防止微生物生长，以延长食品保存期，也可用葡萄糖氧化酶保鲜。 溶菌酶可防止细菌污染，起食品保鲜作用等。,六、乳品工业,凝乳酶制造干酪； 过氧化氢酶牛奶消毒； 溶菌酶添加在婴儿奶粉；人奶与牛奶的区别之一在于溶菌酶含量的不同，奶粉中添加卵清溶菌酶可防止婴儿肠道感染。 乳糖酶分解乳糖； 脂肪酶黄油增香。,七、肉类和鱼类加工,酶在这方面的两个用途是改善组织、激化肉类，及转化废弃蛋白质使其成为供人类食用或作为饲料的蛋白质浓缩物。 蛋白酶还用于生产牛肉汁、鸡汁等来提高产品收率。,八、蛋品加工,用葡萄糖氧化酶去除蛋品中的微量葡萄糖，是酶在蛋品加工中的一项重要用途。 葡萄糖氧化酶的作用是催化葡萄糖脱氢，氧化成为葡萄糖酸同时产生过氧化氢，后者被共存的过氧化氢酶催化分解为水和氧，一分子葡萄糖氧化酶在1min内可催化34000个葡萄糖分子。,第三节 酶在轻工业方面的应用,酶在轻工业方面的应用十分广泛。 概括起来主要有3个方面的用途。 (1) 用酶进行原料处理， (2) 用酶生产各种产品， (3) 用酶增强产品的使用效果。,一、酶在原料处理方面的应用,(1) 发酵原料的处理：发酵工业大多数以淀粉为主要原料。有些微生物由于本身缺乏淀粉酶系，无法直接利用淀粉。故此必须先经过原料处理，将淀粉转化为可发酵的单糖或二糖，才能利用。例如，酒精、酒类、甘油、乳酸、氨基酸、核苷酸等发酵所使用的酵母或细菌等微生物，一般都不能直接利用淀粉进行发酵。 淀粉原料的处理，一般是采用淀粉酶进行液化，然后再经糖化酶进行糖化，将淀粉转变为葡萄糖。,(2) 纺织原料的处理,在纺织工业中，为了增强纤维的强度和光滑性，便于纺织，需要先行上浆。将淀粉用淀粉酶处理一段时间，使粘度达到一定程度就可用作上浆的浆料。,(3)造纸原料的制浆,造纸原料的纤维中含有大量木质素，若不除去则会严重影响纸的质量。用木质素酶可以使木质素水解而除去，不但可提高纸的质量，而且使环境污染程度大为减轻。,(4) 生丝的脱胶处理,天然蚕丝的主要成分是不溶于水的有光泽的丝蛋白。采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶或微生物蛋白酶处理，可在比较温和的条件下催化丝胶蛋白水解，进行生丝脱胶。,二、轻工产品方面的应用,1. 酶法生产甜味剂： 在青桔柑中合有10一20的橙皮苷，经抽提后用黑曲霉桔皮苷酶水解除去分子中的鼠李糖，在碱性下水解和还原，可得到一种甜味强烈的橙皮素葡萄糖苷二氢查耳酮。它的甜度是蔗糖的70一100倍，是一种安全、低热的甜味剂，可是它的溶解度很低，仅0.1，故无实用价值，若将此物与淀粉溶液混合，利用环糊精葡萄糖基转移酶的偶联反应使其葡萄糖分子接上两个葡萄糖分子于是使溶解度提高10倍而不影响甜度。,二、轻工产品方面的应用,2酶法生产L氨基酸 3酶法生产核苷酸 4. 酶法生产有机酸 5丙烯酰胺的生产 6邻苯二酚的生物合成 7用于明胶、胶原纤维生产,三、加酶增加产品的使用效果,1加酶洗涤剂: 洗涤用的酶制剂需要满足下列条件：碱性条件(pH 910)下能够有效洗涤；表面活性剂存在下，很少失活：在荧光染料、漂白剂、香料等洗涤剂辅助成分存在下不失活；在洗涤温度下能有效地发挥作用。,三、加酶增加产品的使用效果,2加酶清洗剂 3加酶牙膏、牙粉和漱口水 4加酶饲料 5加酶护肤品,酶工程复习题,一、名词解释,1、酶的活性中心： 2、Km： 3、共价修饰调节： 4、竞争性抑制： 5、人工模拟酶： 6、测糖试纸：,7、亲和标记： 8、变构调节： 9、同工酶： 10、固定化酶： 11、化学修饰： 12、抗体酶：,二、填空题：,1、酶工程主要指_，由四个