《RNA的加功与修饰》PPT课件.ppt

第8章 RNA的加工与修饰,1) mRNA加帽的生物学功能 2) mRNA加尾的生物学功能 3) mRNA前体的可变剪接 4) RNA的修饰与编辑 5) mRNA的转移 6) mRNA的降解,细胞中RNA的组成,PolI, PolII和PolII类基因中的 非编码RNA,1) PolI: rRNA, 28S RNA, 5.8S RNA, 18S RNA 2) PolII: U RNA, miRNA, siRNA 3) PolIII: 5S RNA, tRNA, 7SL RNA,原核生物极少转录后加工,1) 原核生物mRNA缺少加帽和加尾; 2) 原核生物mRNA没有内含子, 不存在剪接 加工; 3) 未发现原核生物mRNA存在编辑的例子; 4) 原核生物无终止密码mRNA的翻译延伸.,tm RNA的工作机制,No stop codon mRNA 的翻译.,真核生物RNA的加工与修饰,RNA的加功与修饰,未端修饰（end-modification） 加帽与加尾. 真核生物和 古细菌的 mRNA合成时，需在5-端加帽及3-端加上 一段Poly(A)尾巴。 剪接（splicing） 内含子切除, 真核生物中大多数编码蛋 白质的基因都有内含子，这是一段不编码的顺序， 在转录时与编码顺序一道拷贝成前体RNA。前体 RNA中的内含子剪除后转为成熟的mRNA，然后翻 译成蛋白质。某些古细菌的转录物也有内含子，但 在真细菌中非常罕见。 剪切 原核生物和真核生物的rRNA和tRNA初级转 录物常由多个功能单位组成，必须剪切后才能转变 为成熟的分子。 化学修饰 所有生物的rRNA和tRNA都必须进行化学修 饰，将某些化学基团加入到每个RNA分子中。 编辑 通过化学修饰改变mRNA的编码信息称为RNA编 辑，仅在某些生物种属和细胞器基因组中存在。,线粒体RNA和叶绿体RNA的 加工与修饰,1) 不加帽 2) 不加尾 3) 有内含子,自我剪接 4) 广泛的编辑 5) 广泛的修饰,mRNA加帽的功能(1),在所有转录的RNA产物中, 只有POL II基因转录 产物才有帽子结构,其功能是: 1）阻止mRNA的降解 细胞内存在许多RNA酶（RNase），它们可攻击游离的RNA分子。 RNA酶的降解从5端起始， 当在mRNA的5 端加上 m7GpppG帽子后，带有3个连接磷酸 的5帽可阻止RNase切割。 2）提高翻译效率 真核生物mRNA必须通过5帽 结合蛋白才能接触核糖体, 起始翻译。缺少加 帽的mRNA由于不能被5帽结合蛋白识别， 其翻译效率比加帽 mRNA 低二十倍。,mRNA加帽的功能(2),3）作为进出细胞核的识别标记 凡由Pol II转录的RNA均 在5端加帽，包括snRNA，这是RNA分子进出细胞核 的识别标记。大多数snRNA转录后在细胞核中接收 5端单甲基m7G加帽，然后转移到细胞质与snRNP蛋 白结合。在细胞质中snRNA 5帽需再修饰成为三甲基 带帽结构m2，2， 7G，随后重新返回细胞核参与mRNA 的剪接加工。U6 snRNA由PolIII转录，在其5端保留 的三磷酸基团无帽子结构，因而不能输出细胞核。某 些突变型的被输送到细胞质中的snRNA由于不能合成 三甲基带帽结构，不能返回细胞核。 4）提高mRNA的剪接效率 5帽结合蛋白涉及第一个内 含子剪接复合物的形成，直接影响mRNA的剪接效 率。,加 帽 可 保 护mRNA,RNA进出细胞核,mRNA 的帽子 结构是 进出细 胞核的 识别标 记, 未 加帽的 mRNA 不能输 出细胞 核. 核 膜通道 具识别 其蛋白 质成分,mRNA3 加 尾,mRNA加尾的作用,1）提高mRNA 的稳定性 2）控制与提高mRNA翻译效率 3）有助于mRNA前体最后一个 内含子的剪切,poly (A)有 助 于mRNA的 稳 定,U1A蛋白合成的自我调节: UIA mRMA的5有UIA蛋白结合顺序. 当 UIA蛋白过剩时, UIA与前体mRNA 5结合, 导致3切割因子与 AUUAAA位点结合, 阻止加尾, 并引起mRNA前体降解. U1A蛋白质: U1 snRNPs 中与U1 snRNA结合的蛋白质, 与mRNA剪接加工有关.,poly（A）提 高 翻 译 效 率,Poly(A)与翻译起始有关,eIF4: eIF4E,4A,4G,Poly (A)可 调 控 翻 译 起 始,许多动物卵细胞 的成熟依赖于母 源mRNA的加尾. 一些母源mRNA 的Poly(A)尾太短, 不能起始翻译. 原 因是加尾蛋白 CPSF在Maskin 的作用下不与加 尾信号结合.孕激 素可作用CPEB 磷酸化, 减弱 Maskin的作用, 促使CPSF与加尾 信号结合, Poly(A) 延伸,翻译进行.,mRNA前体的剪接,1) mRNA前体的剪接步骤 2) mRNA前体中与剪接有关的顺序 3) mRNA前体剪接中的转脂反应 4) snRNA在mRNA前体剪接中的作用 5) SR蛋白质在mRNA前体剪接中的作用 6) 可变剪接 7) 反式剪接,mRNA两步剪接两次转脂事件,前体mRNA剪接相关顺序,前体mRNA剪接中的两次转脂反应,mRNA的 剪 接 过 程,snRNA在前体mRNA剪接中的作用,内含子的种类与分布,内含子类型 分 布 - GUAU内含子 真核生物核前体mRNA AUAC内含子 真核生物核前体mRNA I 型（Group I） 真核生物核前体mRNA 细胞器RNA II型（Group II） 细胞器RNA 某些原核生物RNA III型（Group III） 细胞器RNA 孪生内含子（Twintrons） 细胞器RNA 前体tRNA内含子 真核生物核前体tRNA 古细菌内含子 不同RNA -,组群I内含子(Group I)核酶,这是最早在单 细胞原生生物 的rRNA剪切加 工中发现的内 含子切除现象, 不依赖蛋白质 仅由rRNA分子 自身催化的剪 接反应, 又称为 核酶.,组群II内含子(Group II),组群II内含子(Group II)主要出现在线粒体和叶绿体mRNA前体剪接 中. Group II内含子剪接也不依赖蛋白质, 主要由前体mRNA的构型 提供剪接活性,也属于一类核酶. Group II的内含子二级结构与 U snRNA的类似,因此推测后者由Group II型进化而来, U snRNA提 供了与前者类似的空间结构.,前体mRNA的可变剪接,果蝇的性别发育与基因调控,The X:A signal and the control of sex determination, sexual behavior, and dosage compensation. The X:A signal targets the Sxl gene, controlling its expression. Autoregulation of Sxl is established only in embryos whose chromosomal constitution is 2X:2A (two X chromosomes; two sets of autosomes), but not in X(Y):2A (one X chromosome; two sets of autosomes) embryos. The autoregulatory feedback loop regulates Sxl expression throughout development and adult life. Sxl controls the expression of the tra and msl-2 genes, whose products are required for control of somatic sex determination/sexual behavior and dosage compensation, respectively. The dotted lines indicate that the expression of the gene is “off,” and the solid lines indicate that the expression of the gene is “on”. 见: MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY REVIEWS, Sept. 2003, p. 343359,果蝇性别因子mRNA的可变剪接,雌果蝇SXL 阻止msl 内含子 切除 及 翻译起始,果蝇X染色体补偿是通过提高雄性X染色体基因的转录水平实 现的.通过msl基因产物及 roX RNA等与染色体结合增强转录. 雌性细胞中msl mRNA的加工及翻译均受到SXL蛋白的抑制.,mRNA前体的可变剪接扩充了基因的信息内含,神经生长导向因子mRNA的可变剪接,Schmucker, D., Drosophila Dscam is an axon guidance receptor exhibiting extraordinary molecular diversity. Cell 101: 671684, 2000.,(Dscam) gene的结构与进化,The exonintronorganization of the Dscam gene from each organism is shown. The black exons are constitutively spliced. The alternative exons in the exon 4, 6,9, and 17 clusters are shaded in red, purple, green, and blue, respectively. The number of variable exons within each cluster in each organism isindicated below each cluster. The exon 10 clusters in A. gambiae and A. mellifera correspond to the exon 9 cluster in the Drosophila species. The exon 14 and 22 clusters in A. gambiae and A. mellifera, respectively, correspond to the exon 17 clusters in the Drosophila species.,果蝇DSCAM mRNA可变剪接说明,果蝇的DSCAM（down syndrome cell adhesion molecular，唐氏综合 症细胞粘连分子）基因编码神经轴突导向受体（axon guidance receptor），该分子的胞外功能域中有一段多肽由10个免疫球蛋白 （immunoglobulin，Ig）重复单位组成，其中第4，6和9重复单位由 可变剪接产生。DSCAM的功能涉及果蝇躯体约250 000个神经元在 发育过成中的迁移与连接，指令轴突应该到达的位置。DSCAM基因 的外显子与内含子组成非常特别，其外显子4，6，9和17均由许多顺 序相似但略有不同的亚单位组成独立的可变剪接区，分别有12，48， 33和 2种剪接方式。在每个成熟的mRNA中，外显子4，6，9和17都 只有一个亚单位入选，全部可能的剪接方式为1248332=38 016 种， 产生38 016个不同的蛋白质（Schmucker，2000）。在已经克隆 与测序的50个DSCAM cDNA中，发现49种不同的4，6和9外显子组 合。目前还不知到细胞采取何种机制来挑选不同的外显子成员，也 不清楚由此产生的蛋白质在功能上究竟有何种差别。,果 蝇Dscam基 因 的 可 变 剪 接,声波感应蛋白基因（slo）的可变剪接,真核生物可变剪接的比例,The bar to the left (light purple) for each organism shows the estimate of alternative splicing based on all ESTs and the total number of published mRNA sequences and ESTs for the species: Homo sapiens, 23,161 mRNAs and 3.1 million ESTs; 47% Mus musculus, 9,682 mRNAs and 1.9 million ESTs; Rattus norvegicus, 5,803 mRNAs and 263,362 ESTs; Drosophila melanogaster, 2,973 mRNAs and 115,191 ESTs; Bos taurus, 1,370 mRNAs and 159,130 ESTs; Caenorhabditis elegans, 18,821 mRNAs and 108,115 ESTs; Arabidopsis thaliana, 3,084 mRNAs and 112,112 ESTs.,人类与小鼠直系基因可变剪接比较,人类与老鼠种间同源基因的可变剪接模式基本相同, 也有 少数外显子的剪接表现差异. Nature Genetics, 34: 177-180, 2003,物种间同源基因差异剪接的外显子 多为新生外显子,可变剪接的机制,mRNA可变剪接机理的研究,1) 有多少基因发生可变剪接? 2) 每个基因有多少可变剪接? 3) 不同的可变剪接产物是否都有功能?是否有功 能趋异? 4) 不同可变剪接产物之间的比例是如何控制的? 5) 可变剪接类型是否具有组织细胞专一性? 6) 哪些因素控制可变剪接? 7) 可变剪接与表型之间的关系. 8) 可变剪接是否与遗传病有关? 9) 可变剪接究竟有什么生物学意义?,超长内含子如何剪接,三种超长内含子剪接模型,人类基因最长内含子800 kb, 最短内含子10 bp.,果蝇基因最长内含子,1) 10%的人类基因和5%的果蝇基因含有10kb的内含子. 2) 果蝇的Y-linked dynein(动力蛋白) heavy chain 基因(DhDhc7)位 于Y染色体的异染色质区, 其内含子20长度为3500kb (3.5Mb)，相 当于大肠杆菌基因组的四分之三。根据转录速率每秒钟45nt计算, 推算完成该内含子的拷贝约需22小时，它的剪过程与一般的内含 子不同，可能采取滚动剪接。,长内含子的滚动剪接,AU-AC内含子的剪接方式,AUAC内含子的剪接 1) 近年来发现真核生物中少数mRNA内含子并不归属GT-AG范畴, 而有不同的剪接位置，即AUAC内含子。在人类，植物以及果 蝇等不同生物中已发现20多个基因含有这种内含子（Tarn and Steitz, 1997）。 2) AUAC内含子也有特征性的分枝点即5UCUUAAC3，该基 序中最后的腺苷酸参与第一个转脂反应。这一点向我们指出了 AUAC内含子的显著特征：它们的剪接路线与GTAG相同，但 涉及不同的剪接因子。 3) 只有U5snRNP参与GU-AG和AU-AC二种内含子的剪接过程。 在GU-AG内含子中起作用的U1snRNP和U2snRNP在AUAC 中由U11snRNP和U12snRNP取代，另一个全新的U4 atac/U6 atac-snRNP随后也被发现。这二个剪接过程从不同侧面展示了剪 接体中snRNP之间互作的详情。 4) 已经证明GUAG内含子剪接的模式同样适用于AUAC内含子。,转录与加工偶联,mRNA的反式剪接,mRNA的反式剪接系指由两个不同mRNA分子经 剪切连接形成成熟mRNA的现象, 主要出现在底等 真核生物如原生生物和线虫中, 它们有大量的基因 以操纵子形式组成多顺反子结构. 1) 锥虫(非洲磕睡虫)的所有mRNA均为反式剪接. 2) 线虫约10-15%的编码基因为反式剪接. 3) 果蝇某些基因, 植物线粒体基因也有反式剪接.,锥虫mRNA前体的反式剪接,反式剪接的其它例子,1) 裸子植物线粒体基因的反式剪接. 见PNAS 94:553-556,1997 2) 绿藻Chlamydomonas reinhardtii 叶绿体基因的反式剪接. 见:Plant Journal 15:575, 1998, 3) 大鼠(rat)肝细胞中存在前体mRNA的反式剪接. 见PNAS 95:12185-12190,1998 4) 果蝇mod(mdg4) 基因存在反式剪接. 见Genetics 160:1481-1487, 2002,反式剪接策略可用于基因治疗,Pptm+Sp表达 载体可用于 反向剪接产 生细胞毒素 蛋白mRNA,杀 死癌细胞.,人类肝脏细胞细胞色素P450A基因的反式剪接The Journal of Biological Chemistry, 277:5882-5890, 2002,在CYP3A4基因的转录产物有三种mRNA, 它们的5端均含有CYP3A43基因的外显子1. 因为CYP3A43位于CYP3A4基因邻侧, 转录方向相反, 因此推测CYP3A4的三种mRNA系由反式剪接产生.,真核生物rRNA的剪切依赖snRNA (U3,U8)的参与,真核生物tRNA内含子采取相同机制剪接,真核生物tRNA前体的内含子相对较短，并且在成 熟tRNA中所处位置相同，均位于反密码子环内， 但缺少共同的基序。tRNA内含子的剪接不涉及转 脂反应。2个剪接位点由tRNA内切核酸酶 （endonuclase）产生，位于上游外显子3末端的 3-磷酸基团与其2-羟基环化，下游外显子5端留 下一个游离的羟基基团。这2个末端因tRNA分子 自然形成的碱基配对构型而相互接近，然后由 RNA连接酶使两个末端形成3-5磷酸脂键。,真核生物tRNA的剪接由tRNA内切 核酸酶与RNA连接酶负责,tRNA的内含子是在形成三叶草构型之后剪除的.,rRNA的化学修饰,rRNA有二种修饰方式： 1）将甲基基团加到核苷酸糖基的2OH位，这是主要的修饰 类型；人类前体rRNA有106处甲基化. 2）使尿苷酸转变为假尿苷酸, 人类rRNA有95处假尿嘧啶修饰. 细胞中所有rRNA均在相同的位置发生相同的修饰。这种修饰在不同种属间具有某种程度相似性，如细菌和真核生物中修饰的模式大体一致，但真核生物的修饰更加广泛。目前还不了解前体rRNA化学修饰的全部意义，但大多数rRNA中出现的化学修饰被认为对其在核糖体中的活性极为重要。例如，修饰的核苷酸可能涉及rRNA催化多肽键的反应。,rRNA核苷酸假尿嘧啶修饰,rRNA核苷酸的甲基化修饰,snoRNA负责rRNA分子的修饰,真核生物snoRNA在RNA修饰过程中扮演了关键角色。 snoRNA长度在70100个核苷酸之间，主要位于核仁区。 这里既是rRNA合成的场所，也是其加工的场所。 1) C/D盒 snoRNA负责2-O-核糖甲基化 snoRNA中有一段称为D盒（D box）的顺序，它们总是位于互补区段下游5个碱基的位置处，与之配对的rRNA核苷酸将被修饰。这些snoRNA组成了C/D盒家族， 负责2-O-核糖甲基化。D盒是甲基化修饰酶识别的信号。 2）H/ACA盒snoRNA负责假尿嘧啶修饰 在发现C/D盒snoRNA之后，又找到另一个H/ACA snoRNA家族，它们的作用是引导修饰酶将rRNA尿苷酸转变为假尿苷酸。这些snoRNA虽然没有D盒，但仍有保守的基序可与rRNA靶位形成碱基配对，并含有修饰酶识别的信号。,snoRNA保守的D/C盒与H/ACA盒,snoRNA的结构,大多数snoRNA由内含子编码,人类基因组中大多数snoRNA由内含子编码,1）rRNA前体每个被修饰的位点都有一个对应的不同的 snoRNA。根据修饰的位点推测，每个细胞必需有数百 个不同的snoRNA。 2）目前仅有极少数snoRNA基因被定位，估计只有少数 snoRNA分子是从标准的基因转录的，大部分成员可能 来自基因的内含子，经剪接后再释放出来。如U14-U24（除U22外）和U32-U40基因位于蛋白质编码基因的内 含子中， 而U22和U25-U31则位于一个编码RNA分子的 基因内，其产物也经RNA剪接释放sno URNA。,tRNA与细菌rRNA的修饰,1) 原核生物和真核生物tRNA的 修饰均由酶催化 2) 细菌rRNA的修饰由酶催化 以上的修饰不涉及其它RNA分子,mRNA编辑的类型,1) 碱基修饰,如将CAA转变为UAA. 2) 泛编辑(pan-editing), 在guide RNA指导下在mRNA分子内插入若干U. 3) 插入编辑, 在mRNA合成时插入碱基,改变读框. 4) 多聚A编辑,在mt mRNA尾部加上一连串A, 产生终止密码.,mRNA碱基更换编辑,线粒体COXIII mRNA的编辑,泛编辑（pan editing）：插入U 锥虫mt mRNA可通过不同的gRNA进行可变编辑.,脱脂蛋白apo-B mRNA的编辑,腺嘌呤脱氨基,果蝇para mRNA的编辑(ag),腺嘌呤脱氨基生成次黄嘌呤, 后者的化学特性类似鸟嘌呤.,果蝇para mRNA加工与修饰后的类型,1）果蝇para mRNA有1536种可变剪接； 2）para mRNA有11种RNA的编辑方式； 3）理论上para mRNA可产生1 032 192种顺 序不同的mRNA。,哺乳动物GluR mRNA的编辑,1）哺乳动物神经系统glutamate receptor subunit gene（GluR）基因为神经细胞跨膜蛋白，对神经传 递分子谷氨酸作出响应，在记忆与学习中起重要作 用.GluR可开通离子通道，启动神经脉冲。 2）GluR mRNA在转录后可由ADAR（adenosine deaminase edting on RNA）编辑，将A转变为I （inosine，次黄嘌呤）。,人类线粒体mRNA的编辑,1）人类线粒体 有13个mRNA,其 中5个mRNA均以U 或UA尾,无终止 密码； 2）通过编辑可 将U或UA转变为 UAAAA-，产生 终止密码UAA。,植物叶绿体与线粒体mRNA的编辑,1）叶绿体基因总数约150左右，烟草叶绿体基因 mRNA的编辑位点数约30个； 2）高等植物线粒体基因总数在60-90之间； 烟草线粒体基因mRNA的编辑位点超过400； 3）细胞器基因大多数的编辑为CU； 4）叶绿体mRNA的编辑信号为-22nt-C-16nt-： -CUUAAUCCGAAUUAUAGAGCUA C GACACAAUC-,叶绿体mRNA编辑机制,核酸开关(riboswi-tch),见:Science 306:233-234 , 2004. Nature 428:281-286, 2004.已报道 枯草杆菌中 约20%的基 因具有 riboswitch 调控机制. Genome Research, 6:315, 2005,mRNA的定位机制,1) mRNA的局限合成 2) mRNA的局限保护性降解 3) mRNA的扩散: 随细胞骨架的组装极性 分布 4) 区域锚定: 主动运输, 依赖顺式元件和反式因子转移到工作场所.如神经细胞轴突生长与花粉管的伸长.,老鼠神经成纤维细胞-actin mRNA的定位过程,ZBP1(Zip-code binding protein 1)蛋白控制-actin mRNA转运及其翻译 的工作模型. ZBP1在细胞核中与-actin mRNA结合, 输出细胞核后 立既与40S核糖体亚基结合, 并通过MP蛋白装载到细胞骨架运输线上. 在到达指定位置(突出生长边缘), 然后在Src激酶作用下ZBP1与 mRNA脱离, 释放的mRNA和40S 亚基再与60S亚基结合起始翻译. 见: Nature 438:512-515, 2005,mRNA的降解,1) mRNA的降解是基因表达调控的重要内容之一, mRNA的降解涉及正常mRNA和异常mRNA。 2) 真核细胞中有一定比例的异常mRNA，它们 具有前移的终止密码，可产生残缺蛋。如人类 细胞平均约20%的mRNA编码残缺蛋白质.有的 mRNA具有无终止密码的3-非翻译区, 影响核 糖体的利用效率.。 3) 细胞必需将不再需要的mRNA和异常的mRNA 及时清除，以保证细胞正常的功能。 4) 真核细胞有多种mRNA降解机制，针对不同 的mRNA。,细胞内异常mRNA的降解,降解mRNA的类型,从编码功能可将mRNA划分为正常mRNA和非正 常mRNA: 正常mRNA: 具有正常编码顺序, 但细胞内已经不再需要的mRNA. 不同mRNA的半衰期有很大差别, 从数分钟到几十分钟. 非正常mRNA: 1.无终止密码mRNA; 2.密码子前移的mRNA,编码残缺蛋白质. 非正常mRNA主要来源于: 1)发生点突变的假基因;2) mRNA加工过程中发生差错产生的mRNA, 如缺少poly(A)的mRNA; 3) 可变剪接产生的非正常mRNA.,mRNA降解的4条路线,1) 依赖于3-poly(A)脱腺苷酸和5-脱帽的53降解路线, 真核生物正常mRNA和部分非真常mRNA的降解采取这一路线, 是主要的mRNA降解路线. 2) 依赖于3-poly(A)脱腺苷酸和35降解路线, 采用exosome降解mRNA. 3) 内切核酸酶降解路线. 4) 独立于3-poly(A)脱腺苷酸直接5-脱帽的53降解路线, 或称质量监控路线.,mRNA降解的四条路线,见: Annu. Rev. Biochem.73:861-890, 2004.,影响mRNA 5-脱帽的因素,影响mRNA半衰期的顺式因子位于mRNA的5- UTR区、编码区和3-UTR区，这些成分依其功 能可分为稳定成分和非稳定成分。,MIE和PGK1的功能,MIE：mRNA不稳定成分，顺式作用 1）酵母Mat1a（Mating hormone A-factor 2 precursor，或Mat1a，结合激素A因子前体）mRNA是一种极不稳定的mRNA，在其编码区有一段65 nt的顺序是加速mRNA降解必需的成分，称之为MIE（Mat1 instable element）。Mat1a mRNA 5UTR区35nt内含有一些罕见的密码子，其32nt碱基可激发mRNA的降解。 Mat1a mRNA 的加速降解在翻译时发生的，Mat1a mRNA在翻译时核糖体停留在某些顺序位置，由此引发mRNA的降解。（The EMBO Journ