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专论与综述 2011 年 11 月( 上) 收稿日期:2010- 11- 30; 修回日期:2011- 08- 29 基金项目: 现代农业产业技术体系项目( nycytx 44 2 5) 作者简介: 马佳( 1985 ) ， 女， 硕士研究生， majia3152 ya- hoo com cn 通信作者: 杨桂芹( 1966 ) ， 女， 博士， 教授 饲料防霉剂及其应用效果的评价分析 马佳， 杨桂芹 ( 沈阳农业大学 畜牧兽医学院， 沈阳 110866) 中图分类号: S816 7文献标识码: A 文章编号: 1004- 7034( 2011) 11 0021 04 关键词: 饲料防霉剂; 检测方法; 影响因素; 使用效果; 发展趋势 摘要: 饲料在保存过程中容易受到环境的影响而发生霉变， 使其营养价值下降， 动物采食霉变饲料 会引起中毒症， 甚至死亡， 给畜禽带来很大的危害， 而且霉菌污染还是造成饲料浪费的一个重要原因; 因此， 有必要使用饲料防霉剂预防饲料霉变。为了解防霉剂的防霉效果， 更好地合理使用防霉剂， 文 章在总结目前市场饲料防霉剂种类、 使用效果的基础上介绍了防霉剂防霉效果的检测方法， 同时对影 响饲料防霉剂使用效果的因素， 以及我国饲料防霉剂的发展前景和趋势进行了论述， 以期为防霉剂的 生产、 选用提供参考。 饲料防霉剂是指能降低饲料中霉菌的数量， 抑制 霉菌毒素的产生， 预防饲料贮存期间营养成分的损 失， 防止饲料发霉变质并延长贮存时间的饲料添加 剂 1 。如何更经济、 有效、 安全地使用防霉剂是众多 饲料工作者共同关心的问题。目前， 我国饲料工业普 遍采用化学防霉法。联合国农业组织( FAO) 和世界 卫生组织( WHO) 对防霉剂有严格的要求， 即防霉剂 的添加量应很小， 无毒性和无刺激性， 能溶解达到有 效的浓度， 性质稳定， 贮存时不发生变化， 也不与饲料 或原料中其他成分起反应， 无异味、 臭味， 有较广的抑 菌谱。由于防霉剂难以对所有致霉微生物都有抑制 作用， 并且所产生的毒性有残留问题， 促使人们考虑 如何开发和研制防霉性能好、 成本低、 毒性小、 安全可 靠的新型防霉剂。 1饲料防霉剂的种类 目前， 常用的防霉剂主要有化学防霉剂、 中草药 防霉剂和复合防霉剂三大类。化学防霉剂包括丙酸 盐、 丙酸、 双乙酸钠、 山梨酸、 山梨酸钾、 苯甲酸、 富马 酸、 富马酸二甲酯、 霉菌毒素吸附剂等。主要使用的 是苯甲酸及其盐、 山梨酸、 丙酸与丙酸钙， 由于苯甲酸 存在叠加性中毒， 有些国家和地区已经禁止使用， 丙 酸及其盐是公认的经济而有效的防霉剂。防霉剂发 展的趋势是由单一型转向复合型， 如复合型丙酸盐的 防霉效果优于单一型丙酸钙 2 ， 常见的具有抗菌防 霉作用的中草药， 如大蒜及其提取物、 丁香油、 山苍籽 油、 桂皮提取物、 杜仲及其提取物等; 复合防霉剂有丙 酸复合防霉剂( monopyop) ， 由 50% 的丙酸和 50% 的 载体蛭石( verxite) 组成; Mold x， 由丙酸、 乙酸、 山梨 酸和苯甲酸均匀分布于硅酸钙载体上而制成; 万香 保， 由丙酸铵、 乙酸、 富马酸、 山梨酸等多种有机酸组 成; 克霉霸， 由丙酸、 乙酸、 苯甲酸、 氯化钠、 磷酸钙等 组成。这类产品防霉效果作用强、 腐蚀性小， 是目前 国际上使用防霉剂的发展趋势。 2防霉剂防霉效果的检测方法 为了解防霉剂的防霉效果， 更好地合理使用防霉 剂， 必须掌握防霉剂防霉效果的检测方法。 2 1杯碟法 在杯碟中加入一定剂量防霉液， 使其在琼脂平板 上扩散， 根据抑菌圈直径大小测定其防霉效果。此方 法的特点是能定量比较防霉剂的抑菌效果， 速度快、 结果准确， 但试验要求选配一种理想溶剂， 要求较高， 操作复杂， 而且反映不出防霉的长效性， 因此可作为 初选和速选的方法 3 。 2 2最低抑菌浓度( MIC) 法 最低抑菌浓度法是根据防霉剂能够抑制霉菌生 长的最低浓度来判断防霉剂的抑菌效果， 抑菌浓度愈 低， 防霉效果愈佳。此方法需将防霉剂配成浓度梯度 液， 工作量较大， 其优缺点同杯碟法， 也可作为初选和 速选的方法 3 。 2 3饲料强化防霉( 破坏性试验) 饲料强化防霉法是通过提高饲料水分含量、 恶化 环境( 高温、 高湿) 促使饲料尽快发霉， 根据霉变严重 程度及测定霉菌数来判断其防霉效果。此方法作为 防霉剂性能评判的中期试验， 结果较直观， 在较短时 期内( 10 20 d) 即能得出防霉效果， 对各种饲料防霉 剂的评价普遍适用; 缺点是试验时间仍然较长， 对防 12黑龙江畜牧兽医 科技版 专论与综述 霉性能相近的防霉剂测定结果不够准确 3 。 2 4饲料常规试验 以正常饲料( 自然水分 11 0% 12 5%) 在自然 环境下贮存， 按规定的时间抽样进行霉菌检测判定其 防霉效果。此方法对于各类防霉剂的效果、 期效试验 说服力强， 可作为防霉剂的终选试验; 其最大的缺点 是完成时间长， 通常需 2 3 个月。 2 5二氧化碳稀释法 根据饲料在霉变腐烂的过程中会产生 CO2的原 理， 通过间接测定 CO2释放量来判断防霉剂的效果。 饲料霉变程度越重， 产生 CO2量越大。此方法适用 于对各种类型防霉剂的检测， 根据 CO2量化指标来 反映防霉剂的防霉效果， 使用方便; 缺点是很难掌握 急剧释放 CO2的时间， 需把握临界时段3 。 2 6温度测定法 饲料发热和霉变是紧密相关的， 饲料发热容易生 霉， 而生霉之后又促进发热。饲料发热主要与微生物 有关， 微生物大量生长繁殖， 由于其呼吸旺盛， 释放大 量的热， 促使饲料霉变; 因此， 测定温度指标能定性地 说明防霉剂的防霉效果， 一般饲料不容易传热， 它的变 化比环境温度变化慢， 有滞后现象， 并且饲料温度变化 幅度比环境温度变化大。在加入防霉剂后， 饲料温度 升高2 5 时， 即可判定饲料发热， 通常饲料发热后 1 3 天开始出现霉点， 在规定的时间间隔内测定饲料 温度， 试样温度先跃升， 且幅度大的防霉效果不佳。此 法缺点是耗时较长， 一般需2 3 个月 3 。 2 7平皿记数法 平皿记数法的原理是根据霉菌生理特性和防霉 剂防霉机理， 选择适宜霉菌生长而不适宜细菌生长的 培养基。采用平皿记数法， 即在菌液中加入一定量的 防霉剂， 培养后测定霉菌菌落总数来判定防菌效果。 菌落总数越少， 表明其防霉抑菌效果越佳， 并根据测 定的数据计算出各种防霉剂的抑菌率， 此方法操作方 便， 结果准确 4 。 3防霉剂的使用效果 何万领等 5 将膨润土与有机酸及有机酸盐适当 配合制作饲料防霉剂。结果表明: 普通有机酸复合后 的防霉剂在临界水分( 14%) 时， 对饲料有较好的防 霉效果， 对高水分( 16%) 饲料无防霉作用; 用膨润土 与有机酸盐复合配制的防霉剂效果优于普通有机酸 防霉剂; 在有机酸盐复合防霉剂的添加量为 0 5% 和 1%时， 对高水分饲料也有较好的防霉效果。汪莉 6 在饲料含水量为 14 46%， 气温为( 30 1) ， 相对湿 度为 70%的条件下， 进行苯甲酸、 山梨酸不同水平组 合对饲料的防霉效应试验结果表明， 添加 0 035% 苯 甲酸 +0 250%山梨酸的组合抑菌效果最好; 0 105% 苯甲酸 + 0 200% 山梨酸、 0 075% 苯甲酸 + 0 150% 山梨酸、 丙酸钙 0 200% 次之; 其余各组未表现出对 霉菌的抑制作用。 罗超等 7 在平均气温为30 的条件下， 将30 kg 新鲜的全价料均分为 3 组。A 组不添加防霉剂，B 组添加 50%丙酸钙 10 g，C 组添加 50% 丙酸 10 g。 结果表明， 添加丙酸钙和丙酸的 2 组饲料黄曲霉含量 均低于国家饲料卫生标准，说明 2 种防霉剂效果良 好， 其中丙酸钙组防霉效果略低于丙酸组。黄通 旺 8 通过在饲料中加入不同浓度梯度的双乙酸钠防 霉剂， 在一定的间隔时间对饲料中的霉菌进行计数， 由霉菌数的变化来检测防霉剂的抑菌效力， 再将霉菌 进行分离纯化。对常见的几种霉菌进行最低抑菌浓 度测定， 得出该防霉剂的有效抑菌浓度。通过饲料贮 藏试验， 比较其与市售其他 2 种防霉剂( 万香保和露 保细盐) 的防霉效果， 结果表明双乙酸钠防霉剂对饲 料具有较好的防霉作用。 吕武兴等 9 对杜仲提取物、 复合有机酸类和丙 酸钙类 3 种饲料防霉剂防霉效果进行比较。结果表 明， 在一定程度上复合有机酸类防霉剂能降低饲料温 度， 而杜仲提取物对温度的影响不大。此外， 在整个 试验期间， 添加杜仲提取物组的饲料水分始终保持最 低， 蛋白质有所增加， 脂肪含量最高， 饲料霉菌总数最 少， 说明在饲料中添加 0 15% 杜仲提取物能有效防 止饲料霉变， 改善饲料的营养价值， 进而表明杜仲是 一种理想的饲料防霉剂。 4影响饲料防霉剂使用效果的几个因素 4 1与饲料有关的因素 1) 饲料的 pH 值。不同的防霉剂抑菌作用的最 适 pH 值范围不同， 如苯甲酸的最适 pH 值为 2 5 4 0， 当 pH 值大于 4 时， 防霉效果下降， 当 pH 值在 5 5 以上时苯甲酸对很多霉菌无作用; 当 pH 值大于 5 6 时， 山梨酸几乎无抑菌作用; 丙酸的最适 pH 值在 4 0 以下; 富马酸二甲酯的 pH 值在 3 8 之间有效。 2) 饲料的含水率 10 。水分是饲料中霉菌生长 的重要因素之一。当饲料中的水分超过 13% 14% 时， 霉菌易于生长。不同含水量需要添加的防霉剂也 不同， 具体添加量见表 1、 表 2、 表 3。 表 1不同条件下丙酸推荐添加量 kgt 1 饲料水 分/% 饲料预贮时间/d饲料预贮时间/d 205090205090 110 500 952 000 601 002 20 120 751 452 550 801 502 70 131 001 702 801 302 003 20 141 251 953 051 802 503 70 151 502 203 302 303 004 20 161 752 453 552 803 504 70 注: 饲料微生物数目 15 000 cfu/g， 相对湿度60%， 昼夜温差 10， 饲喂对象为成年、 生长动物; 饲料微生物数目15 000 cfu/g， 相对湿度 60%， 昼夜温差10 ，饲喂对象为幼年动物。 22 Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine 11 2011 专论与综述 2011 年 11 月( 上) 表 2不同条件下丙酸钙推荐添加量 kgt 1 饲料水 分/% 饲料预贮时间/d饲料预贮时间/d 205090205090 110 651 252 600 751 302 85 120 951 852 301 051 953 50 131 302 203 601 702 604 15 141 602 503 952 303 254 75 151 952 854 252 953 855 40 162 253 154 603 604 506 05 注: 饲料微生物数目 15 000 cfu/g， 相对湿度60%， 昼夜温差 10 ， 饲喂对象为成年、 生长动物; 饲料微生物数目15 000 cfu/g， 相对湿度 60%， 昼夜温差10 ，饲喂对象为幼年动物。 表 3在热带气候条件下霉敌 101 的推荐量 gt 1 水分/% 保质期/d 304560 11 05005001 000 11 0 12 55001 0001 500 12 5 13 51 0001 5002 000 13 5 14 51 5002 0002 000 3) 温度与湿度。霉变在温度为 7 、 相对湿度 为 75%时即可发生。温度为 20 30 、 湿度 80%以 上时霉菌生长速度最快。曲霉菌属生长的最适温度 在 30 左右， 青霉菌属为 25 ， 镰刀菌属一般在 20 左右; 因此， 不同的温度、 湿度条件下， 防止不同 霉菌毒素所需要的防霉剂的添加量也不同。 4) 饲料的成分 10 。饲料中含有碳酸钙时对有机 酸抑菌有不利的影响， 蛋白质也不同程度地使有机酸 的抑菌性能下降， 而脂肪则能提高有机酸的穿透性， 增进抑菌作用; 因此， 含碳酸钙、 高铜或高蛋白质的日 粮需要更高水平的防霉剂。此外， 不同种类饲料霉变 速度也不一样， 浓缩料霉变最慢， 粉料次之， 颗粒料最 快。颗粒料颗料的大小对霉变也有影响， 通常饲料颗 粒越小， 表面积越大， 与氧气、 水分交流越大， 霉菌生 长的机会就越大。 4 2与防霉剂有关的因素 1) 防霉剂的种类。在三大类防霉剂中， 以复合防 霉剂和富马酸二甲酯的抑菌效果最好， 它既能保持有 机酸原有的抑菌功效， 又能消除或降低有机酸的腐蚀 性与刺激性; 其次是有机酸， 但有机酸的腐蚀性和刺激 性较大; 再次是有机酸盐， 它只有在转化为相应的有机 酸时才有抑菌作用， 因而它必须在一定水分含量和低 pH 值条件下才发挥作用， 其防霉效果比有机酸差。 2) 载体 11 。选择防霉剂载体对防霉剂使用效果 有重要影响。选择载体不仅要考虑其必须具有良好 的吸附性、 分散性及流动性; 同时， 还要考虑载体和防 霉剂的相互作用及有效成分的释放方式。如丙酸类 具有杀菌作用的是游离羧基， 单体丙酸能游离出羧 基， 而丙酸气体常以二聚体的方式存在， 二聚体的羧 基是不能游离出羧基而杀菌的; 因此， 当用丙酸作为 有效成分时， 应选择具有释放单体丙酸性能的载体， 如蛭石粉具有催化单体丙酸形成的性能。 3) 混合均匀度。由于防霉剂的抑菌作用很大程 度上依赖接触杀菌， 因而在整个饲料空间内混合越均 匀， 其防霉效果越好。 4) 添加方式。目前， 各生产厂家主要采用的添加 方法有预混合时添加、 混合时添加及在饲料袋口缝合 部使用较高浓度的防霉剂。结果表明， 采用预混合时 添加防霉剂的饲料样品的带菌率最低， 防霉效果最 好， 混合时添加使用防霉剂不具有优势。 5) 防霉剂颗粒的大小。防霉剂颗粒越小， 与饲料 的接触面积越大， 防霉剂的流动性越好， 分布也越均 匀， 防霉效果越好。 此外， 防霉剂的溶解度、 饲料中糖和盐类的含量， 以及饲料污染程度等都可能影响防霉剂的作用效 果 12 。 5小结与展望 饲料防霉是一个复杂的系统问题， 不能仅仅依赖 添加防霉剂作为饲料防霉的唯一手段， 因为防霉剂不 能完全保证饲料不霉变， 它只能在一定的条件下， 适 当延长饲料霉变的时间， 要想从根本上避免饲料霉 变， 需要从霉菌生长的内部条件入手， 如尽量避免采 用不新鲜的原料， 控制饲料及原料的水分， 控制饲料 加工过程中的水分和温度， 注意在干燥、 通风处保存， 减少饲料在仓库或市场中的周转贮运时间等。只有 充分考虑了这些方面以后， 利用优良的防霉剂才能最 有效地保存饲料。 未来的防霉剂研究开发应朝着优质高效、 低成本 的方向发展， 从单一型向复合型发展， 从化学合成防 霉剂向天然防霉剂方向发展， 防霉剂载体由接触型向 气雾型方向发展。一些因含有对人体及动物有害的 物质， 或在应用中存在潜在危害的防霉剂已经或将被 禁用; 因此， 开发复合型天然防霉剂和选择有利于防 霉剂扩散的载体， 提高防霉剂的使用效果， 研制无不 良反应、 无残留的绿色环保型饲料防霉剂将成为今后 研究开发的热点。 参考文献: 1HUSSEIN H S， BRASEL J M Toxicity， metabolism， and impact of my cotoxins on humans and animalsJ Toxicology，2001， 167 ( 2) : 101 134 2王成章， 王恬 饲料学M 北京: 中国农业出版社， 2003 3祁艳霞， 陈玉林， 窦晓丽 饲料防霉剂的应用研究J 饲料工 业， 2004， 25( 4) : 22 24 4周永红， 唐执文 饲料防霉剂防霉效果的检测方法: 平皿计数法 J 饲料工业， 2001， 22( 2) : 39 40 5何万领， 齐得生， 赵芙蓉 膨润土作载体制作饲料防霉剂及防霉 效果观察 J 河南科技大学学报: 农学版， 2004， 24( 1) : 65 6汪莉 苯甲酸、 山梨酸不同水平组合对饲料的防霉效应J 饲 料工业， 2003， 24( 2) : 32 33 32黑龙江畜牧兽医 科技版 专论与综述 7罗超， 李逢慧， 程天印， 等 丙酸、 丙酸钙对饲料霉变效果的比较 J 湖南畜牧兽医， 2008( 2) : 12 13 8黄通旺 新型饲料防霉剂双乙酸钠防霉效果研究J 汕头大学 学报， 2006， 21( 2) : 24 9吕武兴， 贺建华 杜仲提取物防霉效果的研究J 饲料研 究， 2004( 6) : 5 7 10 刘学剑 饲料防霉剂的应用及发展趋势J 饲料博览， 2002 ( 1) : 37 38 11 旷春桃 浅谈影响饲料防霉剂使用效果的几个因素J 湖南畜 牧兽医， 2002( 1) : 14 12 刘国信 饲料防霉问题不容忽视J 广东饲料， 2003， 12( 4) : 24( 006) 收稿日期:2010- 12- 13; 修回日期:2011- 09- 07 作者简介: 徐楠楠( 1983 ) ， 女， 硕士研究生，1211443 sina com 通信作者: 胡桂学( 1963 ) ， 男， 教授， 博士， 博士生导师， hu- guixue901103163 com 实时荧光定量 PCR 技术的研究进展及应用 徐楠楠， 胡桂学 ( 吉林农业大学 动物科技学院， 长春 130118) 中图分类号: S813 3文献标识码: A 文章编号: 1004- 7034( 2011) 11 0024 04 聚合酶链反应( PCR) 技术自 1985 年问世以来， 以其灵敏性高、 特异性强和速度快在分子生物学等科 研领域得到了广泛应用。但是， 由于传统的 PCR 技 术不能准确定量， 在操作过程中易受污染而使假阳性 率偏高; 因此， 使其应用受到限制。实时荧光定量 PCR 技术拥有特异性强、 灵敏度高、 重复性好、 定量 准确、 速度快、 全封闭反应等优点， 已成为了分子生物 学研究的重要工具。文章对实时荧光定量 PCR 技术 的原理、 检测方法、 定量方法及其应用进行了综述。 1实时荧光定量 PCR 的原理 实时荧光定量 PCR 技术， 是指在 PCR 反应体系 中加入荧光基团， 利用荧光信号的累积实时监测整个 PCR 进程， 最后通过标准曲线对未知模板进行定量 分析的方法 1 。在荧光定量 PCR 中， 对整个 PCR 反 应扩增过程进行实时监测和连续分析荧光信号， 随着 反应时间的延续， 监测到的荧光信号可以绘制成一条 曲线。在 PCR 反应早期， 产生荧光的水平不能与背 景明显区别， 而后荧光的产生进入指数期、 线性期和 最终的平台期， 在 PCR 反应处于指数期的某一点检 测 PCR 产物的量， 并由此可以推断模板最初的含 量 2 。为了准确判断样品中某基因产物的起始拷贝 数， 荧光定量 PCR 采用参数“Ct” 值， Ct 值( cycle threshold) 是指每个反应管内的荧光信号到达设定的 阈值时所经历的循环数。研究表明， 每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系， 起始 拷贝数越多， Ct 值越小 3 。利用已知起始拷贝数的 标准品可以