国内外及北京市组织工程研究进展.ppt

国内外及北京市组织工程研究进展伴随医学科学的发展，器官移植技术已经较为广泛地应用于临床，但至今器官移植仍存在一些问题，其中最严重的是器官和组织短缺，供体不足。组,织工程的诞生与发展为人类再造各种人体组织和器官、解决棘手的器官移植供体短缺问题带来了希望。同时推动了医学科学的发展。 国内外及北京市组织工程研究进展 伴随医,学科学的发展，器官移植技术已经较为广泛地应用于临床，但至今器官移植仍存在一些问题，其中最严重的是器官和组织短缺，供体不足。组织工程的诞生与发展为人类再造各种人体,组织和器官、解决棘手的器官移植供体短缺问题带来了希望。同时推动了医学科学的发展。 1组织工程概况 组织工程概念是1987年美国国家科学基金会正式提出的，组织,工程是应用工程科学和生命科学的原理，开发用于恢复、维持及提高受损伤组织和器官功能的生物学替代物的科学。组织工程作为一门多学科交叉的新兴边缘学科，它融合了细胞生物,学、工程科学、材料科学和外科学等知识。组织工程的研究内容包括：种子细胞的性质；细胞外基质替代物(生物材料支架)的性质及选取；种子细胞和细胞外支架材料的相互作用；,认识哺乳动物正常和病态组织或器官结构和功能关系，以研究工程组织对机体内各种病损组织的替代。 组织工程的提出和建立虽然只有10多年的时间，但已在国际上得到迅猛发,展。在美国,组织工程研究开展最早，进展较快。在80年代，美国首先由国家科学基金会组织资助建立了一系列组织工程实验室。1995年筹建了组织工程学会，并出版了正式刊,物TissueEngineering。美国集中了相当数量的研究机构（包括NASA，DOE，NIH）、大学（包括MIT，HMS，GIT，UCSD等）、公司（如,Sandoz，Organogenesis，AdvancedTissue等）。在美国，目前已经形成价值60亿美元的组织工程产业，并以每年25%的速度递增。培育的骨,骼、软骨、血管、皮肤以及神经组织正在进行体内实验。再造的肝脏、胰脏、乳房、心脏、手指、角膜等正在实验室里生长成形。德国、日本、加拿大、奥地利、瑞士和英国等也开展,了与组织工程相关的研究工作，据估计全球组织工程及其技术衍生产品则约有1000亿美元的潜在市场可供开拓。 2组织工程最新研究进展 2-1种子细胞的研究进展,为支架材料提供生命源泉、并能形成组织的功能细胞称为种子细胞。依据其来源可分为自体、同种异体和异种细胞。自体细胞可由活检或穿刺所得到的组织进行分离培养，获得所需要,的功能细胞，同种异体细胞主要来自胚胎、新生儿和成体组织，异种细胞主要来自于猪、牛等动物。其中干细胞研究最为突出。 成体干细胞的可塑性是在20世纪90年代后期才,被认识到。现在已经知道，不仅骨髓组织中存在的间质干细胞（MSCs）在一定条件下，可向成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞、脂肪细胞、成纤维细胞等分化，而且在其他组织如皮,肤、肝、神经等也存在干细胞，这些干细胞还存在相互转化的现象。研究发现，接种在小鼠体内的造血干细胞可培养出肝细胞，将神经干细胞接种在致死剂量照射过的小鼠体内，可在,小鼠血液中发现来源于神经干细胞的造血细胞。这些研究表明，成体干细胞有可能作为组织工程的种子细胞来源，其中自体MSCs与支架材料复合构建的组织工程骨已有临床应用的,个案报道，显示了临床应用的良好前景。MSCs还易于实现外源基因的导入和表达，为基因治疗开创了应用前景。 胚胎干细胞（ES）具有发育的多能性，可从早期胚胎的原始,胚细胞及原始生殖细胞中分离培养获得。由于人ES细胞培养条件特殊，虽然可以用多种诱导物质定向诱导分化，但要成为组织工程种子细胞还有很多科学问题有待研究解决。这一研,究已在小鼠和羊的实验中获得成功，在人的治疗性克隆研究方面也已取得十分突出的进展，如果获得成功，将为组织工程构建提供无抗原性、分裂增殖能力强、功能活跃的新型种子细,胞。 从动物身上获取组织和器官是近10年研究的热点之一。目前世界各国主要以猪为研究对象，为了克服超急排斥反应，已成功地建立了转基因猪模型。 2-2支架材料的,研究进展 支架材料作为组织工程研究的人工细胞外基质（ECM），为细胞的停泊、生长、繁殖、新陈代谢、形成新组织提供支持。目前研究较多的有以下几种： 1可降解高,分子材料国内外研究较多的是聚羟基乙酸（PGA）、聚乳酸（PLA）、聚羟基乙酸与聚乳酸的共聚物（PLGA）等。这些材料具有可标准化生产、可降解、细胞相容性好等优点,，但其酸性降解产物有可能对细胞的活性产生不利影响，同时其亲水性、细胞相容性、力学强度等均尚待改进。采用多种改性技术有可能满足组织工程对支架材料的要求。 2陶瓷,类材料目前研究较成熟的是多孔羟基磷灰石（HA）、磷酸三钙等。这类材料生物相容性好，有一定强度，是骨的无机盐成分，常用作骨组织工程的支架材料。但由于它们降解慢，脆,性大，降低了这类材料的实用性。 3复合材料将有机材料如PGA与无机材料如HA复合，或将HA与胶原、生长因子如骨形态发生蛋白（BMP）复合形成复合材料，可克服单,纯材料的缺点，并能综合其优点。近几年对纳米材料或纳米复合材料的研究有了新的突破，这已成为组织工程支架材料研究的方向之一。 4生物衍生材料生物组织经过处理后获得,的材料称为生物衍生材料。来源于人体的生物衍生材料保留了正常的网架结构，组织相容性好，是较为理想的组织工程支架材料。如胶原凝胶、脱细胞真皮构建组织工程皮肤，纤维蛋,白凝胶构建组织工程软骨等。脱细胞、去抗原处理的生物衍生骨支架构建的组织工程骨已有临床应用个案报道。 2-3组织构建研究进展 1组织工程骨的构建Isogai将,可降解高分子材料预制成人指骨形状，分别接种成骨细胞和软骨细胞，植入裸鼠体内，20周后形成了含有软骨及软骨下骨的指骨和关节。Casabona将MSCc与HA在体外,联合培养后，植入裸鼠预先制备的带血管蒂背阔肌肌皮瓣中，8周后有丰富的新骨形成，新骨血循环丰富。组织工程骨的复合构建方式为临床修复带关节端的骨缺损、应用显微外科技,术形成组织工程骨提供了新思路、新方法。已有文献报道，采用在管状组织工程骨中植入血管束、带血管蒂筋膜包裹组织工程骨，或在体外培养中应用成骨细胞与血管内皮细胞复合培,养，或加入血管内皮细胞生长因子等，均可使组织工程骨建立良好的血液循环，血管化程度因所采用的促血管化方法不同而有一定差别。 2组织工程软骨的构建采用高密度软骨细,胞，在离心管内经离心应力作用后培养，在没有支架材料的条件下也能形成新的软骨组织。用这种软骨修复兔部分骺板损伤，显示在伤后4周内修复，可获较好效果。不少研究者发现,，将软骨细胞与支架材料经体外短时间培养后植入体内皮下，在体内条件下形成的软骨细胞具有更好的形态和功能。用双层型胶原作支架材料，表层为多孔结构，接种细胞后有利于,软骨细胞锚着、分裂繁殖及新陈代谢。 3组织工程周围神经的构建在导管中接种雪旺细胞，将神经导管与神经连接后，向导管内注入雪旺细胞悬液或雪旺细胞凝胶，有促进神经再,生作用，但效果并不十分满意。将高密度纯化的雪旺细胞与专用ECM混合后，接种在PLA纤维丝上，再将此复合物植入中空、多孔、可降解纤维管中，桥接大鼠坐骨神经缺损，组,织学、电生理检查证明其修复效果与自体神经移植相当。采用转壁式生物反应器所产生的微重力，使雪旺细胞均匀地接种在PGA支架材料上，用这种技术不仅使细胞分布均匀，还能,节省细胞量。 5组织工程皮肤的构建表皮移植临床效果较差，后来发展了将成纤维细胞接种在胶原凝胶中形成真皮的技术，临床应用效果较单纯表皮移植好。Prunieras,研制了人脱细胞真皮，在其表面接种角朊细胞进一步提高了临床效果，Yannas用胶原和硫酸软骨素混合制成真皮层。还有用PLA、PGA等高分子材料构建组织工程皮肤真皮,层的研究，临床应用各有优缺点。在研究中发现，角朊细胞和成纤维细胞的相互作用，可促进创面愈合，减少瘢痕形成，因此研制了表皮-真皮复合组织工程皮肤。 2-4组织工,程的临床应用 组织工程学研究虽然仅有10多年历史,但有些研究领域进展十分迅速，目前已有组织工程皮肤达到产业化水平,某些产品已进入临床前研究阶段。 1组织工程,骨的临床应用Vacanti首先采用自体MSCs与多孔珊瑚支架构建的组织工程指骨，修复手指缺损获得成功。意大利Quarto等将自体MSCs与HA复合物构建的组织工,程骨修复3例肢体骨缺损亦获得了较好临床骨愈合。 2组织工程软骨的临床应用自体关节软骨细胞移植修复关节软骨小面积缺损已有较长历史，有很多成功病例的报道。真正意义,上的组织工程软骨的临床应用是Vacanti将软骨细胞与PGA支架复合构建后，植入一位Poland综合征的患儿，修复其肋软骨缺损，患儿由胸廓畸形所致的心肺功能障碍,得到改善，恢复了正常生活和体育活动。 3组织工程皮肤的临床应用世界上第一个被FDA批准上市的组织工程产品是组织工程皮肤，其代表产品有DermagraftTM、,DermagraftTC、和Apligraft。尽管目前有关临床应用的报道不多，但可以预计将会有更多、更成熟的组织工程产品应用于临床。 3中国的组织工程学研究,进展 中国组织工程研究起步稍晚，1994年上海市科委将组织工程研究作为重点资助方向，组织工程重大研究项目正式立项，标志着中国组织工程研究正式起步。1997年组,织工程课题在国家自然科学基金正式立项，同年上海成立我国第一个组织工程实验室上海组织工程研究重点实验室。1998年，国家“973”重点基础研究计划正式将“组织,工程的基本科学问题”研究课题立项，上海第二医科大学、四川大学华西医学院、天津大学、中国科学院力学研究所与中国科学院化学研究所为项目共同发起单位，该项目的确立标志,着国家已将组织工程的研究列为高新技术领域的重点发展项目。 2001、2002年国家“863”高技术研究发展计划对组织工程的应用研究与产品开发进行了持续资助，标,志着国家已正式将组织工程作为生物领域的国家性产业展方向。第一、第二、第三届全国组织工程学术会议分别于1999、2000、2002年在上海、广州与成都召开。200,1年，上海组织工程研究与开发中心暨国家“863”计划生物领域组织工程研发基地在上海漕河泾高科技园内成立，这是我国第一个也是目前唯一的国家级的组织工程研发基地。,目前组织工程研究在全国大专院校、科研机构和中国科学院所属的研究所均进行了不同程度的开展，建立了一批各具特色的组织工程实验室，研究范围涉及临床医学、细胞生物学、,分子生物学、高分子生物材料以及相关领域，与国外的差距正在逐渐缩短，在某些项目研究已经达到或超过了世界先进水平，形成了一支高水平的专业组织工程科研队伍。结合国家“,973”、“863”组织工程研究课题进展情况，就我国组织工程发展现状作一概要总结。 3-1胚胎干细胞的培养、诱导分化及鉴定 上海第二医科大学发育生物学重点实,验室、组织工程研究重点实验室、中山医科大学、西北农林科技大学等单位，分别建立了人类胚胎干细胞和小鼠胚胎干细胞系，并初步建立了诱导分化为成神经干细胞、成肌肉干细胞,、成表皮干细胞、成血管内皮干细胞等技术和方法，为应用胚胎干细胞作为组织工程种子细胞的来源进行了开创性的工作。 3-2骨髓间质干细胞的分离、纯化及定向分化诱导,军事医学科学院基础医学研究所、上海组织工程研究与开发中心等单位，建立了人成年骨髓基质干细胞分离、纯化及定向分化诱导的技术体系，获得的骨髓基质干细胞具有向成骨细,胞、脂肪细胞、血管内皮细胞、软骨细胞等多向分化潜能，应用细胞表面标志鉴定，证明MCS具有独特的表面分子和组织化学特征，纯度在95%以上。通过上述研究，建立了成年,骨髓基质干细胞作为组织工程种子细胞来源的成熟技术体系。 3-3通用同种异种组织工程细胞系建立 暨南大学组织移植与免疫重点实验室、上海第二医科大学免疫学研究所,系统研究了软骨细胞表面MHC类、类分子表达情况，证明小鼠软骨细胞表面几乎不表达MHC类抗原，为建立通用同种异体软骨组织工程细胞系提供了理论根据。同时，建立,一套新颖的评价培养软骨细胞体内免疫原性的方法活细胞荧光标记体内追踪和软骨细胞移植体内分化评价的方法活细胞荧光标记体内移植追踪。 3-4种子细胞功老规律,和延缓老化的研究 上海第二医科大学组织工程研究中心系统检测软骨细胞的增殖和细胞外基质的合成规律。观察到体外培养3周细胞数量增加35倍，第4周数量总数下降，第,1周即开始合成型胶原，型胶原的合成逐渐减弱，应用外源性生长因子TGF-1和bFGF促进软骨细胞体外扩增，为软骨组织工程的种子细胞产业化研究提供了,重要参数。 3-5生物材料的表面修饰及材料与细胞间亲和性改进的研究 中科院化学所应用等离子体处理后材料表面被引入了含氧基团、含氨基团，极性基团的引入使得材料,表面亲水性得到改善，表面自由能得到提高。浙江大学、天津大学等应用明胶、丝素蛋白、壳聚糖等进行了多种生物材料的表面修饰研究，提高了材料与细胞的亲和力。中科院化学所,建立了一整套平行流动系统，该系统可对细胞与材料之间的相互作用进行系统观察与数据统计，对开展细胞在生物材料表面粘附及材料表面的改性对细胞生长影响的研究工作打下了较,好的基础。 3-6生物降解高分子合成、降解速率调控及支架构筑地研究 一批具有自主知识产权的新型组织工程用可降解材料研制成功。中科院化学所掌握了改性聚乳酸的制,备关键技术和基本操作，参数掌握了改性聚乳酸的制备关键技术和基本操作参数，该研究已进入支架材料的加工精制阶段，已可根据不同研究者的要求提供各种类型的支架材料。复旦,大学初步合成了Pluronics聚合物，并予以改性；设计了一类结构不同、化学交联的水凝胶，并进行了组合，常温下获得的化学水凝胶不会在水中自行溶解，克服了以往该类,生物材料的主要缺陷。 3-7组织工程中的生物力学问题 中国科学院力学研究所建立了一套流体力学实验系统，可以用测量评价不同孔隙度和微结构的材料支架的培液灌注状,况；系统研究了力学因素与细胞生长、功能的相互关系，发现体内受力较大的组织细胞在体外对力的响应更为明显，为生物反应器的研制提供了理论根据。同时以皮肤、骨组织、肌健,、血管和组织化人工心瓣等工程培养为背景目标，发展了3种细胞/组织三维培养装置，培养过程中介质和基底应力可调控。 3-8组织工程化组织构建研究 上海第二医科大,学附属第九人民医院组织工程研究中心、上海组织工程研究与开发中心，结合以往在免疫功能缺陷的裸鼠体内构建组织工程化组织的研究基础，应用组织工程技术，在具有完全免疫功,能的自体哺乳动物体内,成功构建组织工程化骨、软骨、肌健、皮肤、角膜基质、血管组织；同时模拟甚至超出临床组织缺损的范围与程度，分别成功修复直径20mm的颅骨缺损、,长25mm的负重股骨缺损、直径为8mm的全层关节软骨缺损、长度为1cm的全层膝关节半月板缺损、最大长度为4cm肌腱组织缺损、全厚的皮肤组织缺损、角膜基质层缺损、,犬腹主动脉缺损等多种组织缺损类型。构建的组织工程化组织在形态、组织结构、生化组织成分与生物力学强度等方面，与正常组织十分接近；修复组织的功能同时得到完全重建。首,次明确应用骨髓基质干细胞诱导的成骨细胞可构建组织工程化骨组织并修复组织缺损，推动了组织工程研究进入到干细胞的阶段；首次确定自体软骨组织形成所需的最佳细胞浓度与形,成时间，参数已成为国际软骨组织构建的通用标准；国际首次应用真皮成纤维细胞作为种子细胞，构建组织工程化肌腱并修复自体肌腱组织缺损。上述研究成果为进一步临床应用提供,了理论依据和参数，从而使组织工程技术向临床应用方面迈出了重大一步。 四川大学华西医学院完成了生物衍生骨支架材料的制备、物理性质、细胞相容性、组织相容性研究，并,用自体骨髓基质干细胞与这种支架材料复合、修复1例胸壁巨大肿瘤切除后的3条肋骨缺损。第二军医大学建立了皮肤成纤维细胞和上皮细胞分离的纯化技术，将异种无细胞真皮(0,.6mm)植入深度烧伤切痂创面，经初步观察应用无细胞真皮可减少疤痕形成、减轻色素沉着、提高创面修复质量。华东理工大学建立了表皮细胞大规模培养扩增的微载体培养技术,，可用于细胞大规模培养的产业化生产。 吉林大学（原白求恩医科大学）再生医学科学研究所，从九十年代初开始进行组织工程研究，先后在人工软骨、人工皮肤、人工肝脏方面,取得重大进展。在人工皮肤方面，已成功地在体外构建出鼠人工表皮、人工真皮及具有表皮和真皮结构的复合人工皮肤，继而又构建出了人的人工表皮、人工真皮及复合人工皮肤。所,构建的复合人工皮肤在裸鼠身上进行移植试验，并已获得成功。 重庆大学生物工程学院组织工程实验室，是教育部生物力学及生物流变学开放实验室的一部份，是目前国内细胞力,学研究手段最系统的专业实验室。在研项目包括：1项国家自然科学基金重点项目，4项国家自然科学基金面上项目，2项重点实验室基金重点项目等。 3-9国内开展组织工程,研究的主要机构（北京以外地区） 上海组织工程研究中心（“973”组织工程项目首席科学家曹谊林教授领衔） 上海第二医科大学附属第九人民医院整复外科 四川大学,华西医院卫生部移植工程与移植免疫重点实验室组织工程研究室 重庆大学生物工程学院生物力学及组织工程教育部重点实验室 暨南大学生物医学工程研究所 复旦大学高分,子科学系聚合物分子工程教育部重点实验室 南开大学生物活性材料教育部重点实验室 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室 西北农林科技大学陕西省干细胞工程技,术研究中心 浙江大学高分子复合材料研究所 东南大学生物科学与医学工程系、东南大学附属中大医院整形外科 天津大学高分子材料研究所 吉林大学再生医学科学研究,所 同济大学材料科学与工程学院,上海其胜生物材料技术研究所 华南理工大学材料学院 中山大学附属第一医院骨科 华中科技大学同济医学院附属协和医院 福建师,范大学生物工程学院生化与分子生物学系 第一军医大学南方医院全军创伤骨科中心 第二军医大学长征医院骨科 第三军医大学组织工程研究与开发中心 第四军医大学西,京医院全军骨科研究所 兰州医学院骨科研究所 天津医院骨伤研究所 青岛海洋大学生物工程系 江西医学院第一附属医院 哈尔滨医科大学第一临床医学院骨科 山,西医科大学第二医院 4北京市组织工程主要研究机构及进展 北京市在组织工程研究领域也具有很强实力，中国科学院、大学、医院以及军队等科研机构在基础与临床应用领域,都取得了许多重要的研究进展。 中科院化学所高分子物理与化学国家重点实验室的生物医用高分子组在开展“973”项目“组织工程的基本科学问题”的研究方面取得了进展。,化学所应用等离子体处理后材料表面被引入了含氧基团、含氨基团，极性基团的引入使得材料表面亲水性得到改善，表面自由能得到提高。化学所还掌握了改性聚乳酸的制备关键技术,和基本操作，参数掌握了改性聚乳酸的制备关键技术和基本操作参数，该研究已进入支架材料的加工精制阶段，已可根据不同研究者的要求提供各种类型的支架材料。 最近该所科,研人员通过高分子分子设计、取长补短的方法，发明了一类新型生物降解高分子“乙交酯-L-丙交酯-己内酯三元无规共聚物”(PGLC)。通过调节三种成分的比例、分子,量和形态结构，得到了分子量从几千到数十万、生物降解速度(降解半衰期)从几星期到一年以上、玻璃化温度从零下到零上四十多度、形态结构从无定型到结晶型、具有广泛用途的,一系列生物降解高分子材料。在此基础上，他们又进一步通过调节组成和分子量，研制了一种玻璃化温度接近于体温、在体内3-6个月内可完全消失的药物载体用PGLC共聚物。,近年来，他们利用此PGLC共聚物为载体，与山东省医科院眼科研究所合作发明了一种新型植入型缓释免疫抑制剂长效环孢素眼内释药体系。此新药剂已经完成了动物试验，并,且开展了初步的临床试用，上述药物载体和制剂都已申报了国家发明专利，作为国际上首创的植入型缓释免疫抑制剂，已被列入了国家“十五”863计划新药专项研究课题，并且正,在作为一类辅料VI类新药办理药物新剂型的申报手续。 中国科学院力学研究所建立了一套流体力学实验系统，可以用测量评价不同孔隙度和微结构的材料支架的培液灌注状况；,系统研究了力学因素与细胞生长、功能的相互关系，发现体内受力较大的组织细胞在体外对力的响应更为明显，为生物反