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学号：20071040114河北北方学院毕业论文奶牛酮病红细胞膜上atp酶活性变化的研究 the study on changes of atpase activity on the membrance of rbc in holstein dairy cow with ketosis学 生：刘帅帅指导教师：张丽云院 系：动物科技学院动物医学系专 业：动植物检疫班 级：07动植物检疫本科班论文提交日期：2011年6月9日目录引言51 材料和方法81.1 实验材料81.1.1 实验动物81.1.2 药品81.1.3实验仪器81.2 方法81.2.1实验动物处理82结果92.1酮病阳性牛的诊断92.1.1酮粉法诊断92.2红细胞膜上atpase活性测定结果93讨论104结论11参考文献12致谢1313河北北方学院学士论文奶牛酮病红细胞膜上atp酶活性变化的研究刘帅帅（河北北方学院动物科技学院动物医学系）指导教师：张丽云摘要： 为了深入研究酮病的发生机理，选择荷斯坦奶牛作为实验动物。应用酮粉法和改良式水杨醛比色法随机检测分组，组为10头对照牛、组为10头阳性牛。应用试剂盒比色法测定红细胞膜上atpase的活性变化。结果表明，阳性组和对照组相比，红细胞膜上atpase的活性显著下降(p0.05)，说明奶牛酮病影响红细胞膜上atpase的活性变化。关键词：酮病；atp酶；奶牛the study on changes of atpase activity on the membrance of rbc in holstein dairy cow with ketosis.liu shuaishuai(veterinary medicine, colloge of animal science and technology, hebei northern university)guide teacher:zhang liyunabstract：in attempt to study the mechanism of ketosis, the holstein dairy cows were randomly divided into two groups according to the ketone bodies powder method and improvemental salicylaldehyde colorimetric method, group（n=10）was the control, group（n=10）was experimental, and determination changes of atpase activity by reagent case colorimetric method. the results expresses that was significantly difference on changes of atpase activity on the membrance of control group and experimental group（p0.05）.therefore ketosis in dairy cow was influence to changes of atpase activity on the membrance.key words: ketosis；atpase activity；dairy cow引言近年来，我国奶牛酮病发病率显著增高，尤其是隐性酮病。降低奶产量，影响奶质量，给奶牛业发展带来了重大的经济损失。奶牛酮病是高产奶牛产犊后6周内，最常发生的一种以碳水化合物和挥发性脂酸代谢紊乱为基础的营养代谢病。临床表现为：顽固性消化紊乱、产奶量下降、机体脱水和一定的神经症状。临床特征为酮血、酮尿、酮乳、低血糖、血浆游离脂肪酸浓度升高和肝糖元含量降低2。为了进一步揭示奶牛酮病的发生机理，首次对奶牛酮病红细胞膜上atpase活性进行了测定，旨在为临床防治奶牛酮病提供科学依据3。为了深入研究酮病的发生机理,选择奶牛作为实验动物。应用酮粉法和改良式水杨醛比色法随机检测分组4:组为10头对照牛、组为10头阳性牛，应用试剂盒比色法测定红细胞膜上atpase的活性变化。结果表明，阳性组和对照组相比,红细胞膜上atpase的活性显著下降(p0.05)，说明奶牛酮病影响红细胞膜上atpase的活性变化。1 酮病发生的有关因素：1.1与生理状态的关系 在正常生理情况下，母牛分娩后的4周6周出现泌乳高峰，但其食欲恢复和采食量的高峰约在产犊后8周10周。因此，在产犊后10周内乳牛的食欲较差，能量和葡萄糖的来源本来就不能满足泌乳消耗的需要，如果母牛泌乳量过高，将势必加剧这种不平衡。通过研究发现，奶牛每天适合的产奶量为22 kg；如果每天产奶34 kg，则血液中全部的葡萄糖都将被乳腺所摄取，这就造成了乳牛血糖过低而引发酮病，所以，高产乳牛酮病的发病率较高。干奶期供应能量水平过高，母牛产前过度肥胖，分娩后严重影响采食量的恢复，同样会使机体的生糖物质缺乏，引起能量负平衡，产生大量酮体而发病。 1.11产前过度肥胖干奶期供应能量水平过高，母牛产前过度肥胖，分娩后严重影响采食量的恢复，同样会使机体的生糖物质缺乏，引起能量负平衡，产生大量酮体而发病。 1.12泌乳期赵海忠等研究表明，亚临床酮病主要集中在产后3个月，并随泌乳月增加而减少，第1个泌乳月发病率最高，达41.82%，依次为26.83%、13.64%，产后第4个月降为7.69%；酮病发病高峰期在分娩后第2周3周7。 1.13产奶量产奶量越高，酮病发生率也高，年平均产奶量在900 kg以上的高产牛发病率最高，达68.18%，但低产奶量(3.0吨以下)的奶牛酮病发生率也有上升的趋势7。 1.14胎次研究显示，随胎次升高而发病率逐渐降低，一般多发生于第2胎第5胎的高产奶牛，第6胎以后的奶牛酮病发生率降低。 1.2与营养组分的关系 饲料供应过少、品质低劣，饲料单一、日粮不平衡；或精料(高蛋白质、高脂肪和低碳水化合物饲料)过多、粗饲料不足等，均会使机体的生糖物质缺乏，可引起能量负平衡，产生大量酮体而发病。 添加下列营养组分可降低酮病的发生率，莫能菌素能改善奶牛的能量代谢，降低产后酮病发生率。在日粮中添加莫能菌素缓释胶囊，奶牛产后酮病降低，真胃异位发生率降低40%(p0.05)，胎盘滞留的发生率降低25%8。 在干奶期日粮中添加12.5 g/kg的沸石粉，奶牛产后1个月内的酮病发生率降低，产奶量提高，但长期使用效果不明显9。 纤维素可有效降低奶牛酮病发生率，何宝祥等10比较甲乙两个奶牛场的酮病发生率和日粮结构发现，乳酮及血酮含量在2个奶牛场间均存在着极显著差异(p0.01)，原因可能是日粮中纤维素的差异。 烟酸具有降低体脂分解，降低血液-羟丁酸、血中酮体和游离脂肪酸的能力。drackley等研究表明，奶牛因分娩可导致烟酸的暂时缺乏，此时补烟酸可以提高奶牛采食量并且还有生糖作用，可以诱导生糖氨基酸转化为糖，提高血糖浓度。 丙二醇或者甘油可提高血糖水平，减少血浆中游离脂肪酸和酮体，降低酮病发生率11。 1.3与饲养水平的关系 干奶期限饲可降低酮病的发生率，将35头经产干奶牛分成两组，自由采食和限饲(ri，按照净能的80%来计算日粮的饲喂量)，结果显示产前采食量对奶牛产后采食量、血清代谢物、产奶量没有影响，但自由采食组产后第1天肝中脂肪含量超过限饲组12；也发现干奶期限饲(满足净能需要的80%)可减少分娩后肝中总脂肪水平和三酰甘油的聚集，提高产后dmi的量。 泌乳初期限饲，在分娩后的第4天开始对奶牛实施限饲(按照50%的能量水平)，导致奶牛血液中nefa、bhba浓度和肝脏中三酰甘油增加，但血糖降低。 1.4与奶牛体况的关系 研究发现体况指数(bci)在3.5以上的奶牛酮病发生率较高(p0.05)2。bci4.0的奶牛易发酮病和脂肪肝，bci3.25和bci3.25相比，母牛有较高的非酯化脂肪酸(nefa)和bhba的血液浓度，bci平均在3.280.08时，nefa平均151.8 eq/l18.3 eq/l，bci平均在3.680.11时，nefa平均388.5 eq/l71 eq/l，说明体况较好的奶牛更易发生酮病。 2 酮病发生主要机制：2.1丙酸来源不足 丙酸的主要作用除异生成糖以外，还参与体内的脂肪代谢。当奶牛产奶的能量需要超过其食入的能量时，奶牛就开始动用体脂，脂肪首先被分解为nefa。nefa在肝脏被分解为乙酸，进入三羧酸循环被彻底分解为二氧化碳和水以产生更多的能量，但这个过程需要丙酸；如果没有足够的丙酸可被利用，过多的乙酸就会在肝脏中聚集，在酶的作用下转化为丙酮、乙酰乙酸和-羟基丁酸。 2.2葡萄糖来源不足 葡萄糖缺乏时，生成的丙酸过少，使脂肪分解生成的甘油成为糖异生的重要前体；且由于糖缺乏刺激糖异生加速，使甘油代谢加快，同时脂肪酸的-氧化也加快，使生成的乙酰辅酶a增多。另一方面当糖缺乏时，草酰乙酸生成量严重不足，而草酰乙酸是乙酰辅酶a进入三羧酸循环所必需的。在这种情况下，乙酰辅酶a会大量生成酮体。同时因糖的缺乏不能产生更多的3-磷酸甘油，并且由组织中动员出来的甘油，在肝中也大部分沿糖异生途径进行代谢。这样肝中3-磷酸甘油的产量受到限制，不能将很多的ffa酯化为三酰甘油，进一步促使更多的ffa氧化为乙酰辅酶a，这样更加剧了酮体的生成。 血糖浓度下降，引起胰高血糖素分泌增多，胰岛素分泌减少，垂体内葡萄糖受体兴奋，促进肾上腺髓质分泌肾上腺素，肝糖原分解增多，脂肪水解为甘油和游离脂肪酸的速度加快，酮体生成增多。由此可见酮病的发病机理很复杂，但普遍接受的是糖缺乏理论。机体低血糖是产生酮病的关键。由于各种原因所致碳水化合物供应不足及高泌乳消耗大量的糖，导致机体低血糖及能量负平衡。为此,动用体脂肪和体蛋白，补充能量的不足。但是，脂肪和蛋白质分解产生大量的游离脂肪酸和生酮氨基酸，经肝脏的-氧化为乙酰辅酶a，乙酰辅酶a可与草酰乙酸缩合成柠檬酸经三羧酸循环氧化供能。如果生成草酰乙酸的先质丙酸的碳水化合物不足,使得大量乙酰辅酶a不能进入三羧酸循环，导致酮体蓄积，进而引起一系列的代谢与机能紊乱4。临床表现为消化型、神经型和瘫痪型酮病5。atp酶存在于组织细胞及细胞器的膜上，是生物膜上的一种蛋白酶，它包括na+-k+-atpase、ca2+-mg2+-atpase、ca2+-atpase和mg2+-atpase 4种，在物质运送、能量转换以及信息传递方面具有重要的作用，机体在缺氧及某些病理情况下，此酶活性发生一系列改变6。为了深入研究酮病的发生机理，本试验选择奶牛作为实验动物，应用酮粉法和改良式水杨醛比色法随机检测红细胞膜上atpase的活性变化。1 材料和方法1.1 实验材料1.1.1 实验动物 黑龙江某牛场泌乳量在6.5103kg以上的36胎荷斯坦奶牛。1.1.2 药品 红细胞膜上atpase活性测定试剂盒，南京建成生物研究所；亚硝基铁氰化钠,无水碳酸钠，硫酸铵(分析纯)，天津市化学试剂一厂。 1.1.3实验仪器 7230g分光光度计(上海第三分析仪器厂)；低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；旋涡混匀器(上海第一医学院仪器厂)。1.2 方法1.2.1实验动物处理应用酮粉法2和改良式水杨醛比色法3对黑龙江某农场的荷斯坦奶牛进行酮病抽样检测。分为两组，每组10头，分别为对照组和试验组。1.2.2 红细胞膜上atpase活性测定于对照组和实验组奶牛尾静脉采取1 ml肝素抗凝全血，测定红细胞数,然后加4倍左右的0.86% nacl溶液，2 000r/min离心10 min，弃去上层血清，留红细胞沉淀。在沉淀的红细胞中加双蒸水1.0 ml反复混匀，使其充分溶血,直至溶液透亮，取0.2 ml溶血液应用试剂盒比色法测定红细胞膜上atpase活性。 1.2.3数据处理与分析采用excel软件对实验数据进行t检验。2结果2.1酮病阳性牛的诊断2.1.1酮粉法诊断酮体的含量与实验色泽反应的快慢,深浅成正比，阴性反应成土褐色，阳性结果以“+”表示，并代表乳中酮体的大约含量。阳性牛显示有紫色迹象，并逐渐加深，于30 s达顶点者为(+)，表示乳中约含酮体4.0 mmol/l以上。图1酮粉法测定结果 fig.1result of determination by ketone bodies powder method 2.1.2 改良式水杨醛比色法诊断在酮粉法诊断结果的基础上进行改良式水杨醛比色法血清酮体含量的测定(表1)，根据上述两种方法选择实验牛。表1血清酮体含量的测定结果table 1determination results of ketone body content in serummmol/l 组别groups样本数number酮体ketone body对照组control group实验组experimental group10100.6512.062.2红细胞膜上atpase活性测定结果阳性组和对照组相比,红细胞膜上atpase的活性显著下降(p0.05) 。表2实验各组红细胞膜上atpase活性测定 table 2determination results of atpase activity on membrance of rbc molpi/107 rbc/h组别groups样本数numbersna+-k+-atpaseca+-mg+-atpase ca+atpasemg+atpase对照组control group 实验组experimental group 10100.45140.0361a0.10860.0089b0.68070.0624a0.30120.0210b0.39160.0436a0.25000.0123b0.23110.0193a0.09640.0082b 注：ab表示对照组和阳性组相比，na+-k+-atpase、ca+-mg+-atpase、ca+-atpase和mg+-atpase活性变化均差异显著（p0.05）note:ab mean na+-k+-atpase、ca+-mg+-atpase、ca+-atpase and mg+-atpase activity p0.05 between control group and experimental group.3讨论 酮病的发病机理很复杂，但普遍接受的是糖缺乏理论。机体低血糖是产生酮病的关键。由于各种原因所致碳水化合物供应不足及高泌乳消耗大量的糖，导致机体低血糖及能量负平衡。为此，动用体脂肪和体蛋白,补充能量的不足。但是,脂肪和蛋白质分解产生大量的游离脂肪酸和生酮氨基酸,经肝脏的-氧化为乙酰辅酶a，乙酰辅酶a可与草酰乙酸缩合成柠檬酸经三羧酸循环氧化供能。如果生成草酰乙酸的先质丙酸的碳水化合物不足，使得大量乙酰辅酶a不能进入三羧酸循环，导致酮体蓄积,进而引起一系列的代谢与机能紊乱1。床表现为消化型、神经型和瘫痪型酮病。 atp酶存在于组织细胞及细胞器的膜上，是生物膜上的一种蛋白酶，它包括na+-k+-atpase、ca2+-mg2+-atpase、ca2+-atpase和mg2+-atpase 4种，在物质运送、能量转换以及信息传递方面具有重要的作用，机体在缺氧及某些病理情况下，此酶活性发生一系列改变4。试验结果表明,酮病阳性组与对照组相比，na+-k+-atpase、ca2+-mg2+-atpase、ca2+-atpase和mg2+-atpase活性均有程度不同的下降，并且差异显著。从而说明奶牛酮病影响红细胞膜上atpase的活性变化。分析实验结果可能有以下两方面的原因：酮病阳性牛的高酮血症和低糖血症导致动物机体缺氧，缺氧则导致atpase活性降低；酮阳性牛早期的食欲下降和代谢紊乱，使血液中na+、k+、ca2+、mg2+水平发生变化，进而影响na+-k+-atpase、ca2+-mg2+-atpase、ca2+-atpase和mg2+-atpase活性，表现程度不同的下降，尤其是神经型酮病和瘫痪型酮病更为突出。另外，atpase作为生物膜物质转运和能量代谢的关键酶，对酮病敏感，故可作为奶牛酮病的早期诊断、治疗和预防效果监测的指标。综上所述，奶牛酮病影响红细胞膜上atpase的活性变化，这一结果对深入揭示酮病的发生机理和临床防治具有重要的意义。4结论 4.1 在酮粉法诊断中，阳性牛显示有紫色迹象，并逐渐加深，于30 s达顶点者为(+)，表示乳中约含酮体4.0 mmol/l以上，比阴性牛含酮体多。4.2 在酮粉法诊断结果的基础上，进行改良式水杨醛比色法血清酮体含的测定，结果实验组奶牛酮体含量比对照组奶牛酮体含量高很多。4.3 应用试剂盒比色法测定红细胞膜上atpase的活性变化，结果表明：阳性组和对照组相比，红细胞膜上atpase的活性显著下降(p0.05)。参考文献1 夏成,孙恒,武瑞.改良的水杨醛比色法检测奶牛血酮、尿酮的研究j.吉林畜牧兽医,2003,14(12):3-5.2 孙斌,