益气活血中药延缓血管老化的作用与机制研究.ppt

1,益气活血中药延缓血管老化的 作用与机制研究,中国中医科学院 雷 燕 陈可冀 等,973项目分课题之一,2,研究背景,血管老化（vascular aging）分为随增龄所致的生理性血管老化和各种疾病引起的病理性血管老化，均表现血管在形态和功能上发生各种衰老变化，如僵硬度增加、顺应性降低和动脉管壁增厚、血管内皮功能低下等 血管老化是人体衰老的关键始发因素，也是老龄人群心血管疾病风险增加的主要原因 衰老的过程其实是一个动脉进行性硬化的过程，动脉硬化是衰老的根本原因，对衰老起决定因素的是血管而非年龄,3,研究背景,目前我国老龄人口比例以每年3%的速度递增,老龄人群具有心脑血管病发病率高的特点，高血压病、冠心病、心功能不全、脑卒中等发生率随增龄急剧上升，均存在着明显的心血管老化的表现，即心血管系统结构和功能发生特征性改变 随增龄出现的血管老化问题已成为研究心血管病危险因素及防治的新靶点，开展心血管衰老的中医药干预研究，对延缓血管老化，防治心脑血管疾病具有重要意义,4,血管老化属于血管病变的一种，可由增龄、高脂饮食、运动减少、高血压、糖尿病、肥胖等原因引起，老化的血管病理学表现为血管内膜增厚、血管硬化和动脉血压改变 随着对血管病变认识的深入, 已知血管壁病变而不是管腔病变的发生发展才是各种心血管事件发生的基础；在细胞和分子水平，血管老化表现在血管内皮细胞、平滑肌细胞和胞外基质水平的改变 血管老化改变了各种心血管疾病的病理生理机制，从而改变了疾病发生的阈值、严重程度和预后,老龄及血管老化概述,老龄及血管老化概述,血管老化与血管病变,5,血管老化de主要表现,脉搏波速度(PwV) 是评价血管硬度的较好指标 脉压增大是反映血管硬化的一项重要指标 颈总动脉内径反映血管壁弹性与伸展性随年龄而下降,是衰老的标志 踝臂指数(ABI)作为评估血管功能的指标，其降低反映AS 晚期糖基化终产物(AGE)随增龄在体内积累，是老年病的病理基础之一 活性氧(ROS)水平异常增高在介导血管衰老中居于重要的地位 肾素-血管紧张素系统(RAS) 调节血管细胞的凋亡、VSMC 迁移、炎性反应及ECM重建等，Ang是RAS的功能多肽 基质金属蛋白酶（MMP-2)与其抑制剂(TIMP-2) 比值的调节可以控制血管重构的发生、发展,6,中医学对血管衰老的认识,认为虚损致衰。气（肾）虚夹瘀阻络是血管衰老的基本病机；延缓衰老应补虚祛瘀法并用 心血管疾病的基础病变和共同归路是血管老化，也是多种血管病变在“入络”阶段异病同治的病理基础 益气活血药人参、三七是常见的具有抗衰老作用的天然药物，均富含三萜类达玛烷型皂甙，国内外药理研究已证实此类有效成分有抗衰老作用，可达到益气活血，祛瘀生新，通脉活络的作用,7,研究目的,以自然衰老小鼠为模型，观察衰老小鼠血管老化所导致血管壁结构和功能的改变，阐明血管衰老的可能机制 通过复制内皮细胞( EC) 模型，揭示血管细胞衰老机制 观察益气活血中药能否通过产生ROS的NADPH氧化酶亚单位p47phox的途径延缓血管老化 揭示益气活血中药人参三七川芎提取物延缓血管老化的作用和机制,8,研究方法,模型：健康雄性自然衰老小鼠，14月龄，70只 复制衰老血管内皮细胞（EC）模型 分组：衰老模型组、人参三七川芎高、中、低剂量组、 维生素E组（VitE组）、另设青年对照组 给药：按照小鼠和人体重剂量折算系数关系，中药大、 中、小剂量相当于临床用量的2倍、1.5倍、1倍， 维生素E50.0 mg/（kgd），给药3个月,9,实验药物 中药制备： 人参、三七、川芎 按比例加入3倍70乙醇提取3次，将醇提取液进行乙醇回收，浓缩至无醇味，制成中药浸膏，含3.164 g生药/g浸膏 对照药： 维生素E 购自Sigma公司,10,研究内容,观察指标,11,益气活血药延缓血管老化的实验研究 EC部分,4代 5代 7代,8代 10代 11代,各代内皮细胞生长状况的比较,12,益气活血药延缓血管老化-EC形态学观察,中药高剂量组 中药低剂量组 光镜 100,8代对照组 VitE组,第8代自然衰老细胞，中药高剂量和VitE 组细胞较衰老模型组光镜下观察， 内皮细胞生长状态好，数量较多，增殖较旺盛,13,益气活血药延缓血管老化-内皮细胞B-gal染色,中药高剂量组 中药低剂量组 光镜x400,8代对照组 VitE组,8代模型衰老组表达B-gal蓝染细胞较多，约78%左右；VitE组阳性细胞数约25% 左右；中药高剂量组约42%左右，低剂量组约38%左右,14,细 胞 周 期,8代衰老组 VitE组,中药高剂量组 中药低剂量组,15,细 胞 周 期,与VitE组比较, 8代衰老模型组细胞周期向G0-G1期明显停顿，G2-M期细胞明显减少；与衰老模型组比较，中药高、低剂量组及Vit E组G0- G1期细胞明显减少，处于G2-M期的细胞明显增多，差异有统计学意义；表明中药在一定程度上能够延缓细胞衰老，促进细胞增殖,16,益气活血药延缓血管老化-细胞内ROS含量（激光共聚焦）,8代模型组 VitE组,中药高剂量组 中药低剂量组 激光共聚焦x100,中药高、低剂量和VitE组荧光强度较模型组明显减弱；提示中药可通过减少细胞内活性氧产生，延缓细胞衰老,17,细胞培养液抗超氧阴离子与NO含量,8代衰老模型组抗超氧阴离子和NO含量明显减少（P0.05）；中药高、低剂量组抗超氧阴离子和NO含量比衰老组明显增加，但较VitE组含量降低，差异有统计学意义。提示8代衰老EC抗氧化能力下降，而中药能在一定程度上改善内皮的功能，增强抗氧化能力，从而延缓细胞衰老,18,细胞p47phox、AT1R、AT2R蛋白表达,与VitE组比较，8代衰老组p47phox，AT1R，AT2R表达明显上调；与8代衰老组比较，中药两组与Vit E组p47phox表达明显下调，AT1R，AT2R表达明显下调；与Vit E组比较，中药两组p47phox，AT2R表达上调，AT1R表达仅有上调趋势，无明显差异,19,益气活血药延缓血管老化的整体研究（1）,一般情况 各组小鼠生活状况良好，体质量正常。青年组小鼠体毛白且光泽，行动活泼，反应灵敏；其余各组小鼠体毛较青年组颜色稍暗，动作稍迟缓；14月龄模型组小鼠，体毛蓬松，没有光泽，运动减少，动作相对较迟缓,20,益气活血药延缓血管老化的整体研究（2）,中药中剂量组 中药低剂量组 维生素E组 HE x100,青年对照组 衰老模型组 中药高剂量组,各组小鼠主动脉形态学比较 衰老模型组小鼠血管壁出现典型的衰老表现，给予中药后的小鼠血管内膜中膜增厚不明显，内皮细胞脱落减少，仅有部分平滑肌细胞向内膜迁移，衰老改变不显著,21,益气活血药延缓血管老化的整体研究（3）,各组小鼠主动脉Masson染色结果比较 衰老模型组小鼠血管壁平滑肌和胶原含量明显增多，给予中药后胶原增生明显减少，高剂量组可使平滑肌细胞增生明显减少，衰老小鼠血管老化相对减缓,青年对照组 衰老模型组 中药高剂量组,中药中剂量组 中药低剂量组 维生素E组 Masson染色x100）,22,主动脉Masson 染色及SMC、CF相对含量(面积)比较,益气活血药延缓血管老化的整体研究（4）,注：与对照组比较，*P0.05；与模型组比较，P0.05，下表同 衰老模型组小鼠血管壁平滑肌和胶原含量明显增多，给予中药后胶原增生明显减少，高剂量组可使平滑肌细胞增生明显减少，衰老小鼠血管老化相对减缓,23,益气活血药延缓血管老化的整体研究（5）,各组血管组织抗超氧阴离子、血浆Ang含量比较,注：与对照组比较，*P0.05；与模型组比较，P0.05，下表同,中药灌胃后，小鼠血管组织中的抗活性氧生成能力比衰老模型组有一定程度的增强，说明益气活血药可能通过减少活性氧的生成来延缓血管老化。衰老模型组Ang含量最低，对照组最高，说明血浆中Ang含量与血管老化的关系不密切，应进一步检测血管组织中Ang含量，确定与血管老化的关系,24,各组血管组织中AGEs含量及MMP-2/TIMP-2比值比较,注：与对照组比较，*P0.05；与模型组比较，P0.05 青年小鼠AGEs含量较少，而老年小鼠AGEs含量较多，给予中药灌胃后，老年鼠血管中AGEs含量有不同程度的降低，说明益气活血药在一定程度上降低动脉僵硬度，从而延缓血管的老化。而衰老模型组MMP-2 、MMP-2/ TIMP-2最高，TIMP-2含量最低，表明衰老小鼠已出现年龄相关的血管重构，中药各组小鼠MMP-2 、MMP-2/ TIMP-2明显降低，表明中药可能通过抑制MMP-2生成、增强TIMP-2的活性，减少血管壁EMC降解，从而延缓血管老化,益气活血药延缓血管老化的整体研究（6）,25,研究结果及进展,人参三七川芎能够改善衰老小鼠主动脉形态学衰老变化，降低血管组织中活性氧的生成，减少AGEs生成，抑制MMP-2的活性，调节MMP-2/TIMP-2的平衡 人参三七川芎具有延缓血管老化的作用，可能是通过影响NADPH氧化酶减少ROS（活性氧）的生成，从而达到延缓血管老化的目的,26,结 论,衰老小鼠血管在结构和功能上都出现了明显的衰老改变：血管内膜中膜增厚，管壁平滑肌和胶原含量明显增多，血管组织中AGEs含量增多，而抗活性氧生成能力降低，MMP-2/ TIMP-2比值增高，表明衰老小鼠血管组织已出现年龄相关的血管重构 人参三七川芎提取物能降低衰老小鼠血管的僵硬度、减少血管重构，延缓小鼠血管老化的发生,27,下一步工作打算,拟进行血管老化的临床特征调查和益