《生物技术制药》PPT课件.ppt

1,基因工程制药 抗体制药 动物细胞制药 植物细胞制药 酶工程制药 现代生物技术改造传统制药工业,生物技术制药,2,采用现代生物技术,借助某些微生物、植物、动物生产医药品，叫生物技术制药。,生物技术制药概念：,3,现代生物技术的基础学科和分支,分子生物学 生物技术疫苗 生物化学 遗传学 农业生物技术 细胞生物学 化学工程,医药生物技术 生物技术疫苗 生物技术诊断 农业生物技术 家畜生物技术 海洋生物技术,现代生物技术,4,生物制药的特点,专一性 无残留性 有预防性 少依赖性,5,一、药物的来源,化学合成,从动植物体中分离,微生物发酵,6,从动植物中分离,7,猪苓多糖提取为例,8,二、生物技术DNA诊断,指对患者某一特定基因或其转录产物进行检测，获取突变基因，从而对疾病进行诊断。称基因诊断、DNA探针技术。 类型：酶谱分析法、探针杂交分析法、PCR等方法。 应用：遗传病（染色体病、单基因遗传病、多基因遗传病、线粒体遗传病、体细胞遗传病）；癌症监测；传染性疾病诊断。,9,二、生物技术干细胞技术,干细胞：指具有自我更新、无限增殖扩容及多向分化潜能的细胞。 按其来源分：胚胎干细胞、组织干细胞 应用：治疗性克隆：利用病人体细胞克隆为干细胞，其DNA编码和基因表型均与病人完全一致，避免免疫排斥反应。,10,三、生物技术药物的分类,生物技术药物可粗分为三大类： 1、重组蛋白质药物 2、治疗性抗体药物 3、核酸药物,11,重组DNA技术生产的蛋白。,1、重组蛋白质药物,发现具有药物作用特性和活性的目的蛋白,分离或合成相关基因,该基因插入合适的载体中（质粒、病毒等）,转入宿主细胞,构建能表达产生目的蛋白的菌种库或细胞库,生物反应器或 发酵罐或 细胞培养制造目的蛋白,12,目前经批准的重组蛋白类药物，按照结构可分为三类： （1）与人完全相同的多肽和蛋白质 （2）与人密切相关但不同的多肽和蛋白质，在氨基酸序列上或翻译后修饰上的差异 （3）与人相关较远或无关的多肽和蛋白质，如具有调节活性，但和已知的人多肽和蛋白质没有同源性的多肽和蛋白质、双功能的融合蛋白、经蛋白质工程改造和模拟的活性蛋白。,1、重组蛋白质药物,13,2、治疗性抗体药物,B淋巴细胞抗原表位 单克隆抗体鼠的脾细胞与鼠的骨髓瘤细胞融合。人源或人源化单克隆抗体可以解决鼠源性单克隆抗体的免疫原性。即利用抗体工程对抗体进行改进从而得到具有一定用途，而对人体产生剧烈反应的抗体。 采用PCR技术、噬菌体表面展示技术和大肠杆菌表达技术构建人抗体库，从中筛选人源性抗体。,14,3、核酸药物,寡核苷酸药物是具有专一顺序的寡核苷酸，用于阻断有害基因的表达。其特点是有高的特异性，其降解产物对人体无害。 核酸药物可分为反义核酸、核酶、脱氧核酶、抗基因寡核苷酸和裸DNA疫苗与基因药物。,15,反义核酸为与mRNA的一段顺序互补的序列，能阻断mRNA的翻译；它通过与mRNA配对形成杂交双链，经RNase H水解DNA/RNA杂交双链中的RNA链，从而阻断基因的表达。 核酶是一种具有催化作用的RNA，通过碱基配对与靶RNA相互识别、结合并水解催化靶RNA从而阻断基因的表达。,3、核酸药物,16,脱氧核酶是具有酶活性的DNA分子，它的酶活性可特异切割RNA，从而抑制基因的表达。 抗基因寡核苷酸是将它嵌入双链DNA的大沟中形成DNA三股螺旋，抑制DNA结合蛋白（如转录活化因子）和RNA聚合酶的结合，从而抑制基因的转录。 核酸药物中另一类为裸DNA基因疫苗与基因药物，它们是将具有预防和治疗疾病的功能基因与真核表达载体重组，将此重组DNA导入人体细胞，使其表达活性的多肽或蛋白质，产生免疫或治疗作用。,3、核酸药物,17,三、生物技术药物的分类,生物技术药物可细分为四大类： 酶类、激素和多肽类、疫苗、单抗。,18,生物制药的类型,19,生物制药的类型,20,生物制药的类型,21,生物制药的类型,22,生物制药的类型,疫苗基因工程疫苗、核酸疫苗 基因工程疫苗：基因重组疫苗、基因重组亚单位疫苗、重组牛痘病毒多价活疫苗、基因修饰减毒灭活疫苗。第二代疫苗 核酸疫苗：DNA疫苗和RNA疫苗。第三代疫苗 单抗：利用细胞融合技术获得。,23,生物技术药物与其它药物之间的区别，主要由生物技术药物的以下特点所决定的： （1）生物技术药物的生产复杂，技术要求高，要有严格的监控措施。 （2）生物技术药物稳定性易受外界环境条件影响。 （3）生物技术药物存在着种属特异性。 （4）生物技术药物副作用较小，毒性较低，安全性高。 （5）生物技术药物，很多在体内的半衰期短，迅速降解，并在体内降解的部位广泛，药效反应快。,四、生物技术药物的特点及其新药评价程序,24,生物技术来源药物的新药评价按其特点可分为5个阶段，即：（1）实验室研制与验证；（2）中试及质量验证；（3）临床前药效、药代、药理与毒理验证；（4）临床试验；（5）生产 当完成临床前试验时向国家药品监督管理局注册司提出申请临床实验的资料，当临床、期结束后，一、二类新药提出申请试生产的资料。临床期结束后，一、二类新药再提出申请转为正式生产的报告。,四、生物技术药物的特点及其新药评价程序,25,发现和筛选生物技术新药: （1）从自然界、人或动物或植物中分离提取具有药物作用的生物活性蛋白，以基因工程技术钓取或合成其对应的基因片段，构建能表达制造某种药物的工程菌或细胞株。 （2）从基因工程构建的基因组DNA文库中，筛选表达某生物功能的活性蛋白的克隆，制备该活性蛋白，通过理化生物活性的分析和进一步筛选来获得生物技术新药。,五、生物技术来源药物的发现和筛选,26,（3）应用PCR技术、噬菌体表达技术构建噬菌体文库、细菌表达文库，从这些随机肽库中或融合随机多肽库中，以单克隆抗体或纯化蛋白或受体或完整的细胞作为陪体，筛选出与之结合的多肽和蛋白分子及其相对应的DNA片段，从中进一步筛选开发成新的生物技术新药。,五、生物技术来源药物的发现和筛选,27,（4）应用蛋白质工程技术和计算机模建技术，对活性蛋白进行突变、剪切、修饰改造或设计全新的分子，应用基因工程技术生产被改造的或新的分子，筛选出有效的新的活性多肽和蛋白质药物。 （5）应用DNA合成技术，合成阻断有害基因的复制、表达的寡核苷酸（反义核酸、核酶和抗基因寡核苷酸）药物，此外通过合成技术合成随机寡核苷酸库，通过与蛋白多肽或有机分子等配体的结合与作用来筛选寡核苷酸药物。,五、生物技术来源药物的发现和筛选,28,（6）应用基因工程技术为基础的酵母双杂交系统，通过在其体内检测蛋白质与蛋白质的相互作用，寻找与某已知蛋白质相互作用的未知蛋白质，直接克隆未知蛋白的基因，筛选某些修饰的调整蛋白，通过药理作用的验证，发现和设计新的生物技术药物。 （7）人类基因组计划为新的靶基因或靶蛋白的开发生物技术新药提供了的源泉。约30亿对核苷酸、34万个基因序列的确定，以生物信息学分析、分离功能基因和致病基因，通过基因表达、蛋白质分析、功能与代谢、药效毒理和药理学的研究，发现和设计新的生物技术药物,五、生物技术来源药物的发现和筛选,29,（8）通过基因工程技术，对一些小分子药物如抗生素等的生物合成途径中的多酶体系基因簇进行缺失、替换等突变，重建整个合成途径，最终产生与组合化学文库相似的组合生物合成文库，从中筛选具有新特性的小分子药物。,五、生物技术来源药物的发现和筛选,30,六、生物技术药物的生产,生物技术来源药物的生产是通过基因修饰的活细胞或机体来生产的，因此它与天然来源的材料如血浆、血清、组织中分离的或化学合成的药物显然不同。 生产过程中一般需要高密度发酵或高密度细胞培养和复杂的提纯方法及质量控制分析鉴定方法。 对生物技术药物的评价与验证过程、生产环境的控制、净化的无菌操作及质量分析系统与质量控制，基本上与所有的药物制品相同，但鉴于生物技术药物系统的复杂性要求较其它一般药物为高，一定要确保它们的同源性、批次间的一致性及安全性。,31,六、生物技术药物的生产,1、活性多肽、蛋白质的生产 （1）原核系统的生产 优点是：对细菌的生物学及分子生物学背景的了解已非常透彻； 细菌生长增殖快，应用的培养基比较简单，易获得高密度培养和高浓度的蛋白产物； 大肠杆菌宿主系统已研究的非常成熟，具有各种载体和适用于表达生产蛋白的各种方法，可达到高水平的生产； 可以大规模发酵，现已应用超过10万升规模的发酵罐进行工程菌的生产，成本较低廉。,32,六、生物技术药物的生产,1、活性多肽、蛋白质的生产 （1）原核系统的生产 缺点是： 大肠杆菌生产的蛋白常常是以无活性还原状态的包涵体存在，需要通过氧化产生分子内二硫键形成正确的折叠，复性转变为有活性的蛋白； 大肠杆菌生产的蛋白起始序列为N-甲酰甲硫氨酸、大肠杆菌的水解系统常常不能去除该残基，于是所得蛋白是天然蛋白的甲硫氨酰衍生物； 在大肠杆菌中表达的蛋白由于存在微量蛋白酶而有遭致生物降解的可能； 大肠杆菌系统产生的蛋白常污染有内毒素，要通过纯化除去。最近进展可使大肠杆菌表达产生的蛋白以可溶性形式分泌至胞外或细胞周质中，这样既可除去不需要的N-末端的甲硫氨酸和较易纯化。,33,六、生物技术药物的生产,（2）真核系统（哺乳动物细胞及酵母）的生产 优点是产物往往分泌于胞外，并且它具有原核细胞所不具有的蛋白质转录加工的能力，这样生产的活性蛋白能特异地折叠，在一级、二级及三级结构上与天然蛋白一致。 缺点是所需要费用较高，技术难度大，其规模越大影响也越大，随着生物反应器、微载体、微囊培养系统及培养基研究的进展，这方面已有了很大突破。此外通常应用永生化的细胞系，要注意污染有潜在的致瘤DNA、病毒及逆转录病毒的可能，必须通过有效的验证确保其安全性。,34,六、生物技术药物的生产,2、单克隆抗体的生产 体内法（小鼠腹水法）和体外法（细胞培养法）制备单克隆抗体，经提取纯化获得特异性单抗制剂。 3、核酸药物的生产 寡核苷酸生产由DNA合成仪进行裸DNA基因疫苗和基因药物的生产技术及要求类似于重组多肽蛋白药物，不过目标产品不是多肽产品，而是DNA。,35,七、生物技术药物的药学评价,1、起始材料的评价 2、生产（制造过程）的评价 3、质量控制及评价（最终产品的评价）,36,基因工程药物制造实例,干扰素（interferon，IFN）是人体细胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。根据分子结构和抗原性的差异分为、等4个类型。型干扰素在分为1b 2a 2b等亚型。,37,一、基因工程菌的组建,38,二、基因工程干扰素的制备,启开种子 制备种子液 发酵培养 粗提 精提 半成品制备 半成品检定 分装 冻干 成品检定 成品包装,39,2b干扰素生产过程 1.发酵 工程菌：SW-IFN-2b/E.coli DH5，质粒用启动子，含氨苄青霉素抗性基因。 培养基：1%蛋白冻0.5%酵母提取物0.5%NACl。摇床培养：30 ，10h，发酵种子。 15L发酵罐培养：30，8h。然后42，3h。离心去上清。,40,2.产品的提取与纯化