Abi定量PCR原理-upda.ppt

报告人：刘雪燕 Tel: 8008302001广州,8008203939上海，8008100192北京， Email: 2005年6月22日 昆明,欢迎参加美国应用生物系统公司 基因分析技术进展讲座！,ABI 公司荧光定量PCR仪器介绍,第一代荧光定量PCR仪 -1995年推出全世界第一台7700型荧光定量PCR仪 -1997年推出5700型荧光定量PCR仪 第二代荧光定量PCR仪 -2000年推出7900型荧光定量PCR仪 -2001年推出7000型荧光定量PCR仪 第三代荧光定量PCR仪 -2004年推出7300型荧光定量PCR仪 -2004年推出7500型荧光定量PCR仪,荧光定量PCR原理,TaqMan 探针法 SYBR Green I 染料法,TaqMan 探针法,5,3,5,5,3,5,Forward Primer,Reverse Primer,TaqMan Probe,R,Q,Polymerization,TaqMan 探针法,5,3,5,5,3,5,Forward Primer,Reverse Primer,R,Q,Displacement,TaqMan 探针法,5,3,5,5,3,5,Q,R,Cleavage,TaqMan 探针法,5,3,5,5,3,5,R,Q,Polymerization Completed,SYBR Green 1 染料法,DNA Target Sequence,Denaturation,SYBR Green 1 - Double Stranded DNA Binding Dye Assays,SYBR Green 1 染料法,Polymerization Complete,Polymerization,TaqMan探针法定量的特点,High specificity- primer and probe based high accuracy Multiple Reporter-Mutation Detection,SYBR Green 1 染料法定量的特点,Primer-based specificity Target identification (screening) assays Convenient than Taqman Low-cost assays where high specificity is not required Can not do mutation Detection,荧光定量PCR仪的应用,定量检测 绝对定量 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 相对定量 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 点突变检测 与疾病相关的等位基因点突变检测 SNP检测,荧光定量PCR仪的应用,应用一: 核酸定量检测（绝对定量）,定量PCR技术原理 在定量PCR技术中，有一个很重要的概念 Ct值。 C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是： 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。 Ct值的确定,Amplification of the Template (50 - 5x108 copies),Standard Curve of the Template (50 - 5x108 copies),Sample 1,Sample 2,相对定量研究,基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究,荧光定量PCR仪的应用,应用三: 突变检测，SNP分析，等位基因分析,突变检测,G C,A C,FAM,VIC,G T,A T,FAM,VIC,正常(Allele 1) 只有VIC 绿色荧光,突变(Allele 2) 只有FAM 蓝色荧光,终点结果,1/1,1/2 杂合子,2/2,空白对照,实时结果,NFQ,MGB,R,NFQ,MGB,R,: Reporter Dye,: Non-Fluorescent Quencher,: Minor Groove Binder (Tm Enhancer),Structure of TaqMan MGB Probes,MGB 荧光探针的好处,无背景荧光No background fluorescence 更好的淬灭效果Better Quenching efficiency 荧光标记灵活Increases flexibility for future dye advancements 提高荧光信号的信噪比 提高退火温度 (e.g. 15 mer up by 18 C) 探针短Allows for Shorter probes 提高SNP识别率Increased Discrimination Power in SNP assays,ABI 公司荧光定量PCR试剂,Reagent kits,ABI试剂盒3大优势 1st 预防污染,Uracil-N-Glycosylase (UNG) Acts on single/double-stranded dU-containing DNA,UNG酶,金牌Taq酶,经过修饰，常温下没有活性 95 10min热启动后才能做PCR 阻断加样时的随机扩增，降低本底 活力特别高,ABI试剂盒3大优势 2nd 热启动,ABI试剂盒3大优势 3rd ROX校正,减少孔间差异，提高数据精确度 诊断反应异常,管家荧光,Rn = RReporter / RROX,TaqMan的ROX校准,Reporter / Reference,Reporter,Reference,Detection and Quantitation Methods for GMO Regulatory Sequences in Processed Foods,Matthew Lorence, Ph.D., M.B.A. Molecular Microbiology Group,什么是二恶英和呋喃类物质,dioxin” ：一大类氯代含氧三环芳烃类化合物 多氯二苯-P-二恶英 (PCDDs) 多氯二苯并呋喃 (PCDFs) 多氯联苯 (PCBs) 419 种被鉴定、分离 30 种被认为有毒性 17 PCDDs/PCDFs 受到特别关注,污染来源：Sources of Dioxin Contamination,主要是工业生产过程中的副产品，也可自然界中产生 全世界广泛存在 空气、土壤、水、沉积物、食物、尤其是日常生活中的物品如肉类鱼类贝类等 土壤、沉积物和动物中水平高 空气和水中水平低,对健康的影响,已经被归结为人类的致癌物 报道的毒性反应有: 免疫毒性 皮肤毒性 生殖系统和内分泌系统功能障碍 神经系统的不可修复性 新生儿和胎儿比成人的危险性更高,Dioxins的监测,分析研究需要复杂的手段和昂贵的仪器设备 操作繁琐，需要专门高级训练 全世界只有100家实验室可进行环境和食物中样品的分析 全世界只有 20 家实验室可进行生物来源的的二恶英的检测。 单样品分析成本超过 US $1000,毒性如何计算？,毒性当量因子 (TEFs) ：某个化合物异构体的相对毒性 2,3,7,8- (TCDD), 毒性最强, TEF 为 1 其他二恶英异构体的毒性折算成相应的相对毒性强度。 17种同族元素均被高灵敏度的 GC/MS测定毒性 相对毒性的累加总和记为 毒性当量 (TEQ),毒性当量因子的数值TEF VALUES,ITEF：国际毒性当量因子 WHO: WHO1997年修订的毒性当量因子,AhR 受体活性 Bases for TEF and TEQ,加入 TEF 评分表格的标准包括： 必须与受体结合 (AhR) 由它激发由AhR介导的毒性反应 在食物链中持续存在并有累积作用 TEQ 代表了多种化合物的叠加的毒性效应 均可以和AhR受体结合并启动毒性反应,Dioxin 与 AhR 结合,AhR,HSP90 dimer,PM,XAP2,核膜,转录,Ah受体核转位因子（ ARNT ）,DNA,Ah 受体激活示意图,AhRC PCRTM ASSAY,利用 AhR 的高度特异性 二恶英检测中 TEQ评分的基础 利用 Polymerase Chain Reaction (PCR) 获得Nobel 奖的技术 可检测极少量的DNA分子,分析原理,样品加入到盛有Ah受体和特异 DNA片段的试剂瓶中 Dioxin 与Ah受体结合，然后再与 DNA 探针结合 Ah受体/DNA探针杂交体在一微量反应管表面被捕获 DNA 探针被 PCR扩增 (Real-time) 荧光信号被检测，反映样品中的底物含量,DNA 探针在荧光定量PCR扩增仪上检测,Microwell,ABI 7000,AhRC PCRTM Protocol,溶解Reaction Mix (包含Ah受体 和 DNA探针） 加入样品Sample 30oC温育1hr 移液至 Capture Strip “Microtiter Strip” (室温30 min, 震荡) 用于捕获杂交的DNA分子 洗涤 加入 PCR Master Mix 和引物 PCR 扩增 (少于 2 hrs),AhRC PCRTM 校正标准曲线,Triplicate Analysis of TCDD Samples,EC50 = 375 ppt R2 = 0.9911,可根据Ct值获得TCDD的含量,TaqMan microRNA定量分析试剂盒,用实时荧光定量PCR方法和 TaqMan试剂盒来定量分析成熟的小RNA: microRNAs *Mature miRNAs are the biologically active form,Precursor,miRNA,什么是 miRNAs,MicroRNAs 是一种内源性长度在个碱基左右的RNA分子，它在动植物中具有重要的基因调控作用，它们通过与 mRNAs结合抑制翻译或造成 mRNAs 被酶解切割而起作用 目前在各种生命体中发现的miRNAs类型共有约 700种以上,通过实验验证或经数据库和软件推测 其中人源的约有种 高丰度存在：平均每个细胞中约有50,000个拷贝,为什么miRNAs非常重要 ?,MicroRNAs 是一类新的基因调控因子 某些miRNAs控制了动植物的发育 理解miRNA 的功能将帮助现在流行的siRNA 实验结果：RNA干扰基因沉默 MicroRNAs 有可能成为新型的疾病标志物 MicroRNAs 可能具有重要临床应用价值,现有的miRNA检测方法,克隆法Cloning 杂交法Northern Blot Ribonuclease Protection-based PAGE电泳法 基因芯片法Microarray-based miRNA profiling 上列各种方法均未被证实是有效，准确并且是高度重现的：不少小RNA间只有一个碱基的不同,TaqMan MicroRNA 分析方法 发夹状引物的反转录荧光定量PCR,miRNA,Step 1: Stem-loop RT,Step 2: Real-time PCR,F,Q,Oligos required per miRNA Specific RT primer Specific forward primer Specific reverse primer Specific TaqMan probe Enzymes required Reverse transcriptase AmpliTaq Gold DNA Polymerase,MicroRNA 定量方法,Estimated synthetic miRNA input (lin-4) in RT based on OD: 707-71 copies 已经实验证明可达7个数量级的线性范围,Slope = -3.4 R2 = 0.9991,No. PCR cycles,Fluorescence signal (Rn),No. copies,Threshold Cycle (CT),70M copies,7 copies,A,B,Stem-loop RT-PCR miRNA assays 高度的重现性,Averaged standard deviation: 0.1 CV: 0.6% for 4 miRNAs 16 replicates 2 operators,let-7a,miR-20,miR-324-5,miR-16,MicroRNA 的应用,实时定量分析miRNAs miRNA 表达谱分析：疾病正常的比较分析 发现疾病的miRNA 标志物 or疾病相关的基因表达标签 通过同时并行比较基因和miRNA表达类型，发现新的miRNA 靶基因 细胞分化研究 转录后基