高效液相色谱详解-郝建涛.ppt

高效液相色谱 （HPLC）,主讲：郝凤霞 能源化工重点实验室,目 录,基础理论 上机操作前的准备工作 Agillent 1100 的操作 常见故障排除 HPLC在科研中的应用,一、基础理论,溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。,1、色谱柱的分离原理,色谱分析法的分类,按两相的状态分类,2、分离模式键合相色谱、液液色谱、尺寸排阻色谱,键合相色谱 正相色谱： 流动相极性 固定相极性 常规分析，80,色谱图和峰参数 色谱图(chromatogram)-样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线。 基线(base line)-经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。 噪音(noise)-基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。 漂移(drift)-基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。,3、HPLC中的基本概念和术语,色谱峰(peak)-组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。 峰高(peak height，h)-峰的最高点至峰底的距离。 峰宽（peak width，W)-峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。 半峰宽（peak width at half-height，Wh/2)-峰高一半处的峰宽。 峰面积(peak area，A)-峰与峰底所包围的面积。 死时间(dead time，t0)-不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。 保留时间(retention time，tR)-从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。,流动相的洗脱方式,等度洗脱,梯度洗脱,分析时间长,分离度差,MeOH / H2O = 4 / 6,MeOH / H2O = 8 / 2,等度洗脱,95%,30%,MeOH 浓度,梯度洗脱,梯度洗脱是 HPLC 的常用手段,梯度洗脱装置 流动相中含有两种或两种以上不同极性的溶剂，在洗脱过程中连续或间断的改变流动相的组成，以调节它的极性，使样品中每个组分都有较高的分离度，从而实现各组分的圆满分离，梯度洗脱可提高柱效，缩短分析时间，改善检测器的灵敏度，它类似于气相色谱的程序升温技术。,4、高效液相色谱法的应用范围,高效液相色谱法适于分析沸点高、相对分子质量大，受热易分解的不稳定有机化合物、生物活性物质以及多种天然产物，这些化合物约占全部有机化合物的80%，可应用于化工生产、制药工业、食品工业、生物化工、医学临床检验和环境监测等领域。,5、HPLC的系统,输液泵 相当于人的心脏，不断提供连续、稳定、精确的流量 进样器 样品引入系统 色谱柱 关键部分，在这里样品实现分离 检测器 对分离后的样品进行检测 数据记录与处理装置,输液系统,进样系统,分离系统,检测系统,数据处理系统,HPLC的系统组成,Agilent 1100 高效液相色谱仪,储液瓶,真空脱气机,混合室,自动进样器,分离柱,VWD,手动进样,自动进样,六通阀进样演示,分离系统色谱柱,功能： 组分分离,目标： 分辨力强 效率高,吸附剂化学键和固定相色谱柱 化学键合相色谱柱:70% 将不同的官能团通过化学反应键和到硅胶表面的游离羟基上，而形成化学键和固定相，进而形成化学键和相色谱柱。 反相: C18, 65%; C8, 15%; 反相色谱是目前应用得最为广泛的高效液相色谱方法。 正相: 20%; -NH2、 -CN 其它 (手性柱， 离子交换柱): 10%,柱温箱,控制温度，保证分析结果重现性 升高温度，降低了流动相的黏度，降低柱压，保证色谱系统的稳定性,升温对于反相 HPLC分离强疏水肽的影响 (B27),流动相: A: 含0.05%三氟乙酸的水 B: 含0.05%三氟乙酸的乙腈 2% B / min 进样量: 100L (50g的6M脲/5%乙酸) UV: 210 nm 流速: 1 mL/min 室温,液相色谱柱: C18 色谱柱尺寸: 4.6 x 250 mm 5m,室温 300C 400C 500C 600C 700C,提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）,检测系统,药典中的液相检测器,检测器简介（一）, 紫外吸收检测器（UVD） 原理：用特定波长的紫外光照射样品池，通过检测透光率的 变化来测定样品浓度的检测器。它具有波长固定，波长可变和光二极管阵列三种类型。 特点：选择性检测器、波长检测范围：190-800nm ； 对流量和温度敏感性低、灵敏度较高（10-9g）； 应用最广，对大部分有机化合物有响应； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。 定量基础：Lambert-Beer定律，AKbc,2019/6/22,光电二极管阵列检测器,紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。,检测器简介（二）,荧光检测器（fluorescence detector） （FLD） 原理：某些溶质在紫外光激发后能发射可见光（荧光）的性质检测。 特点：选择性检测器、灵敏度高（10-12g）、对流量和温度敏感性低。 对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。,检测器简介（三）,检测器简介（四）, 蒸发光散射检测器（ELSD） 原理：通过检测光散射程度而测定溶质浓度的检测器。色谱柱后流出物在通向检测器途中，被高速载气（氮气）喷成雾状液滴，再进入蒸发漂移管中，流动相不断蒸发，含溶质的雾状液滴形成不挥发的微小颗粒，被载气载带通过检测器。在检测器中，光被散射的程度取决于溶质颗粒的大小与数量。 特点：消除了溶剂的干扰，不受温度变化影响，灵敏度高，是通用型检测器。,检测器简介（五）, 电导检测器（ECD） 原理：监测溶液的电导率变化的检测器。 特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流动相的组成变化有明显响应、灵敏度低（10-3g）。适用于离子型化合物。, 示差折光指数检测器（RID） 原理：监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测量试样浓度的检测器。 特点：通用性检测器，温变化要保持在0.001、灵敏度低（10-6g）,二、上机操作前，我们需要准备好什么？ 如：样品怎么处理？ 流动相怎么选？ 仪器参数怎么设置？,1样品的前处理,最好使用流动相溶解样品。 使用预处理除去样品中的强极性或与柱填 料产生不可逆吸附的杂质。 使用0.45m的过滤膜过滤除去微粒杂质。,样品准备,样品过滤头的类型： 30mm内径：适用于大进样量的过滤，由0.2m和0.45m两种规格材料有，纤维素，醋酸纤维，聚四氟乙烯。处理样品体积少于50l。 13mm内径：适用于范围广的过滤，由0.2m和0.45m两种规格。 3mm内径：适用于小进样量的过滤，由0.2m和0.45m两种规格。处理样品体积为7l。,滤膜类型： 聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。 醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶液，推荐用于蛋白质和其相关样品。 尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸，70%乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。 再生纤维素滤膜：具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。,注意：1：每张滤膜只能用一次。 2：水相和有机相不要搞混。,2流动相的配制,流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。 流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应 流动相的黏度要尽量小 分离效果好 柱压低，延长液体泵的使用寿命 (可运用提高温度的方法降低流动相的黏度),流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。 流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。 在流动相配制好后，一定要进行脱气。,准备流动相,1) 色谱级纯或优级纯乙腈或甲醇 水超纯水，18.2Mcm,过滤装置,为什么要过滤？,1、对色谱柱、仪器起到保护作用 色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。 仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。 2、消除由于污染对分析结果的影响,3) 溶剂准备：脱气,目 的,流动相使用前必须进行脱气处理 ，以除去其中溶解气体。 以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。 溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。 若用FLD，可能会造成荧光猝灭。,常用的脱气方法,氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。 加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。 抽真空脱气法：易抽走有机相。 超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10-15min，此法效果最差。 在线真空脱气法：Agilent1100LC真空脱机利用膜渗透技术， 在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。,3、流动相流速的选择,具体根据色谱柱的内径选择,4、波长选择,首先在可见紫外分光光度计上测量样品液的吸收光谱，以选择合适的测量波长，如最灵敏的测量波长并避开其它物质的干扰。从紫外光谱中还可大体知道在HPLC中的响应值，如吸收度小于0.5时，HPLC测定的面积将会很小。,5记录时间,第一次测定时，应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针，并尽量收集较长时间的图谱（如30分钟以上），以便确定样品中被分析组分峰的位置、分离度及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来，确定是否会影响主峰的测定。,三、Agilent 1100 机器操作,1、检查流动相,Purge阀（清洗阀、排液阀）处于松开状态,Purge阀,逆时针打开清洗阀,顺时针关闭清洗阀,毛细管出口,流向进样器,废液管,清洗阀打开时溶剂由此流向废液瓶.,1、检查流动相,Purge阀（清洗阀、排液阀）处于松开状态 把流动相放入溶剂瓶中，且滤头浸入到液面下 A 水 B 甲醇 C 乙腈 D 缓冲液,2、冲洗管路,选择流动相为10异丙醇90水 （按此比例配好溶液后存放在矿泉水瓶中） 调节流速大约为1d/3s。,3、打开电脑，等待TAP窗口出现,4、打开1100各模块开关,指示灯状态,5、待1100自检完毕，双击online，启动工作站 化学工作站自动与1100LC通讯，进入工作站画面。,其它功能菜单,文件处理,运行控制,仪器控制,序列,放弃任务,在线帮助,工作站任务切换快捷键,方法存取快捷键,序列存取快捷键,运行方法,运行序列,面对工作站，我该怎么办？ What should I do？,我们知道要运行样品需要设置控制仪器的参数，比如泵流速、流动相比例、柱温、检测器波长、样品校正等； 在Agilent化学工作站中我们把仪器控制和数据分析以及仪器相关的运行等所有参数称为一个方法Method； 所以要运行一个样品，首先要得到一个正确的方法； 在Agilent化学工作站中要得到方法要么调用一个已经存在的方法，要么自己编辑一个新的方法； 一般来说，通过查阅资料比如国家标准或行业标准、药典、专业技术资料、EPA等都可以得到样品分析的详细方法； 您需要做的就是把这些方法在Agilent化学工作站中建立起来，然后运行仪器并得到数据。,6、方法的编辑,1）调用方法,在Method中点击Load Method工作站弹出下面对话框.,在右面对话框中选中要调用的方法名,点击“OK”,该方法即被激活.,使用 Edit Entire Method 编辑一个完整的方法,2）编辑一个新方法,选择所要编辑的内容,画面1:方法组成,在你想要的部分前选中,否则方法里将不包括该部分的内容。比如本方法不包括数据分析的内容。,方法信息,仪器控制与数据采集,数据分析,运行时间表,方法信息 (Method Information),画面2：方法信息,输入您想要对方法的说明，比如方法的用途、来源等信息。,包括：流量(Flow)，流动相组成(Solvents)，停止采集时间(Stop Time)，梯度编程(Timetable)，压力限制设定(Pressure Limits),泵的操作参数,压力限制：Max最高压力，Min最低压力,流动相梯度表,输入流量(Flow),输入停止采集时间(Stop Time),输入流动相组成，B、C、D可输，A=100-B-C-D,输入流动相名称,画面3：泵参数（四元泵）,检测器参数设置,画面5：检测器参数VWD,输入使用的波长,控温范围：低于室温1080 两个单独的加热区。 安装切换阀可以进行柱切换。 可以容纳30 cm长色谱柱。 安装柱识别可以自动记录进样次数。,柱温箱,画面6：恒温柱箱参数设置,输入控制温度,温度编程表,从Method菜单选择Save Method / Save Method as或从存贮方法工具图标存贮方法。,存贮方法,换名保存,覆盖保存,另存时在此处输入方法名,7、样品的测定,要分析单个样品, 从RunControl菜单选择 Sample Info., 输入样品信息。样品信息包括：操作者姓名(Operator Name)，存盘数据文件(Data File)，样品参数(Sample Parameters)。然后运行方法(Run Method)。,指定样品瓶号及数据路径,样品瓶所放位置,子目录名称,数据形式Manual为手动，Prefix/Counter为自动累加。,从Instrument 菜单选择System on。,鼠标左键点击红色或蓝色标题，即可将Y轴显示成对应的相应值和单位,8、数据分析,从“View ”菜单中，单击“Data analysis”进入数据分析画面 从“File ”菜单选择“Load signal ” ，选中您的数据文件名，如下图所示。单击Ok。,调用信号文件,叠放多个信号文件,做谱图优化,从“Graphics”菜单中选择“Signal options ”选项。从Ranges中选择Auto scale及合适的显示时间，单击ok，或选择”Use Ranges ”调整。反复进行，直到图的比例合适为止。,图形优化,图形优化,Signal Options 信号选项,积 分,从“Integration ”中选择 “Auto integrate ”，如积分结果不理想，再从菜单中选择“Integration Events ”选项，选择合适的Slope sensitivity，Peak width，Area reject，Height reject。,积分参数优化,Integration Events 积分参数选项（及快捷键）,积分参数,Slope Sensitivity 设置斜率灵敏度，截除噪音积分,Peak Width 设置半峰宽度，远大于或小于该数值的峰的积分将被截除,Area Reject 设置面积截除，截除面积低于此值的峰的积分,Height Reject 设置峰高截除,Shoulders 设置肩峰参数,这是一张优化了积分参数的谱图积分，噪音及杂质积分已被截除。,9、打印报告 10、回到Method and Run control 可继续测量,11、关机,1）冲洗管路和色谱柱30min A：水 B：甲醇 （如果使用了D缓冲溶液，则用一干净小烧杯盛放超纯水） 流速：5ml/min,2）用甲醇2030ml冲洗进样阀 3）关闭工作站 4）关闭TAP窗口 5）关1100的电源 6）关电脑 7）在大型仪器使用记录本上登记 8）关闭实验室的水、电、气及门窗等,小结：液相色谱操作步骤,倒入流动相，装柱 开机：计算机Bootp 开设备 打开Chemstation工作站 创建（调用）方法 排气：打开排气阀，先排有机相、再排无机相，5ml/min 流速调至0.1ml/min，拧紧排气阀。 平衡柱子：梯度升速至最终流速，基线平直1015min 系统平衡后点击“start”开始进样 操作结束：10%有机相+90%水洗柱0.5h；再用纯有机相洗0.51h；梯度降速至0ml/min 关机、卸柱子,四、常见故障排除,液相色谱仪结构复杂，且不同型号的色谱仪，出故障时产生的现象有可能不同，以下罗列的现象仅供参考：,常 见 故 障 排 除,常 见 故 障 排 除,常 见 故 障 排 除,常 见 故 障 排 除,常见图谱分析,由于液相色谱仪在工作中受到的影响因素较多，因此出现的色谱图形也较为复杂，除与操作者的使用和仪器所处的环境有关外，还与分离柱、流动相性质、分析对象的性质、所选择的工作条件有关。现仅对与仪器性能有关的常见图谱作一粗略分析，供参考。,图 谱,分析原因,现象说明及排除,1.环境温度变化过大 2.液流不稳定或有漏液 3.在技术指标范围内,1.避开室内通风口位 置和发热或制冷源 2.观察泵的工作状态, 并查漏 3. 110-4Au,图 谱,分析原因,现象说明及排除,1.外界干扰讯号 2.输液泵柱室内有气泡 3.流通池内有气泡,1.使机壳良好接地， 排除附近干扰源 2.用“清洗”键或排 放阀排除气泡 3.拆下输入导管，大 流量冲洗池体或在 池体出口增加阻力 (接长排液导管),漂移,1.仪器在稳定中 2.在技术指标范围内 3.柱箱升过高温后， 再处于室温工作 4.检测器工作不稳定,1.正常现象 2.属正常状态 3.将分离柱从柱箱 内取出后使用 4.元器件工作点不稳 定，修理后再使用,图 谱,分析原因,现象说明及排除,1.组份分离不佳 a.色谱柱选择有误 b.流动相不符合分析要求 c.柱后导管过长 2.波长选择不正确 3.流速过大,1.重叠峰 a.更换色谱柱 b.重新选择流动相 c.尽可能减短柱后导管长度 2.重选波长，增大组 份的吸光度差异 3.减小流量值,1流动相已用完 2温度控制器失控 (恒温开启条件下) 3在工作过程添加 流动相,1.突然漂移大多为 流动相用完造成 2.检查温度控制器 3.尽可能不要在工作 时加流动相，可采用 较大的贮液瓶,图 谱,分析原因,现象说明及排除,1放大器量程选择 过大 2放大器无输出 3二次仪表或检测器 失效,1.减小量程范围(若接 积分仪，可减小仪 器的满度电压值) 2. 未按起始键 3.更换失效的部件,基线无噪声,出倒峰,1.组份吸