实验七蛋白质免疫印迹实验.ppt

实验七 蛋白质免疫印迹实验 （Western Blotting）,一 实验原理,Western Blotting 是用来检测蛋白质的一种技术。 首先将含有待测蛋白的蛋白质混合物进行凝胶电泳分离，然后将已经分离的蛋白质通过电泳技术从凝胶转移到固体支持物上，这一固体支持物目前常为硝酸纤维素薄膜。随后以待测蛋白质上抗原决定簇特异性的抗体（称为第一抗体）为探针，与固体支持物上的蛋白质进行免疫反应，最后用偶联有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶的抗第一抗体的抗体（第二抗体）与第一抗体进行免疫反应，只有与第一抗体特异性结合的待测蛋白才能与第二抗体发生免疫反应。在有辣根过氧化物酶的底物用显色剂存在时就会出现颜色反应，结合有第一抗体、第二抗体的待测蛋白，通过颜色反应即能显现出来。,一 实验原理,电泳将蛋白质从凝胶转移到固体支持物上是通过电转移仪器完成的。它是将固体支持物面对阳极、凝胶面对阴极，二者结合在一起，然后将外面二侧用Whatman 3MM滤纸结合，形成“三明治”结构，放入电转移仪器上，加入电泳缓冲液，通上电源后，蛋白质即可从凝胶上转移到固体支持物上。,一 实验原理,其定量关系符合以下公式： Ve=Vo+KV1 Ve：某一溶质的洗脱体积 Vo：层析柱的外水体积 Vi：层析柱的内水体积 K：某一溶质的分配系数,1试剂 电转移缓冲液 pH8.3 39mM甘氨酸 4.8mM Tris碱 0.037% SDS 20% 甲醇 混合2.9克甘氨酸，5.8克Tris,0.37克SDS,加200ml甲醇，定容到1000ml. 封闭缓冲液：5%（W/V）脱脂奶粉溶于PBS中,二试剂和器材,1试剂 PBS: NaCl 8g,KCl 0.2g,Na2HPO4 1.44g,KH2PO4 0.24g 加双蒸水800ml,用HCl调pH到pH7.4,再加水到1000ml,分装后，15磅20分钟灭菌。 4-氯萘酚显色液：用30mg 4-氯萘酚（简称4-CN）溶于1ml无水乙醇中制成母液。将5014-CN对母液和5130%的H2O2加入到5ml 0.05M/L Tris-Cl(pH7.6)中。 氨基黑染色液：0.1%氨基黑10-B、45%甲醇、10%冰乙酸 氨基黑脱色液：90%甲醇、2%冰乙酸、8%水,二试剂和器材,2器材 电转移仪器 恒温摇床 硝酸纤维素薄膜 Whatman 3MM滤纸 电泳仪 裁纸刀 25cm培养皿 玻璃棒,二试剂和器材,1蛋白质电转移 戴上手套，取下SDS-PAGE凝胶，小心剥离凝胶。裁剪与凝胶同样大的硝酸纤维素薄膜和六层Whatman 3MM滤纸，在硝酸纤维素薄膜左下角剪去一角作为标记。将硝酸纤维素薄膜漂浮于去离子水的表面，使水从膜的下部浸透以去除其间气泡，将Whatman 3MM滤纸在电转移缓冲液中浸湿，用蒸馏水淋洗石墨电极，先将三层浸湿的滤纸放在阳极上，在滤纸表面滚动玻璃棒以除去其间的气泡，再将浸湿的硝酸纤维素薄膜小心平铺在滤纸上，用玻璃棒小心去除气泡。随后将12%SDS-PAGE凝胶舒展平铺在硝酸纤维素薄膜上，用玻璃棒小心去除气泡，再将三层浸湿的滤纸平铺在凝胶上，沁心去除气泡，最后加上石墨电极板，接通电源进行电转移，电流的大小由凝胶的大小决定，为0.65mA/平方厘米。电转移2小时后，停止通电，卸掉电转移装置，取下凝胶进行考马斯亮兰染色，以检测电转移是否完全。小心取下硝酸纤维素薄膜，放在一张干滤纸上，吸干30-60分钟后，开始进显色反应。,三 操作步骤,2显色反应 首先进行分子量标记的氨基黑染色。切下转有分子量标记的硝酸纤维素薄膜，用含有0.3%吐温20的PBS缓冲液漂洗三次后（每次15分钟），再将其浸入氨基黑染液中，室温染色5分钟，然后置于氨基黑脱色液中脱去背景，水中漂洗后景干备用。,三 操作步骤,转有样品的硝酸纤维素薄膜用含有5%脱脂牛奶的PBS缓冲液在室温下封闭2小时，同时1：100加入兔抗GST第一抗体，平缓摇动，室温保温1小时。然后用PBS缓冲液将硝酸纤维素薄膜漂洗4次，每次 30分钟。将辣根过氧分物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白第二抗 体用封闭液稀释50倍后，加入吐温20至终浓度为0.05%，然后与上述漂洗的硝酸纤维素薄膜进行反应，将膜浸于其中，平放在平缓摇动的摇床平台上，室温温育 1小时后，用PBS缓冲液将硝酸纤维素薄膜漂洗4次，每次5分钟，再加入4-氯萘酚显色液，加入 51 的30%H2O2，将硝酸纤维素薄膜置于其中缓慢摇动，待所检测的蛋白带显色达到最深程度后，将硝酸纤维素薄膜转入 PBS 溶液中停止显色反应。取出硝酸纤维素薄膜，自然晾干后拍照保存结果。,三 操作步骤,1. 为什么裁剪的滤纸必须与凝胶大小完全一