毛细管电泳原理及分析策略CE.ppt

毛细管电泳分离原理及分析策略,CE分离原理-与模式有关,毛细管区带电泳（CZE） 毛细管胶束电动色谱（MECC/MCKC） 毛细管凝胶电泳（CGE） 毛细管等电聚焦（cIEF） 亲和毛细管电泳（ACE） 毛细管电色谱（CEC）,第一章 毛细管区带电泳,样品在电解液中泳动,根据物质的荷/质比差异来进行分离，比值愈大,跑得愈快,进样方式,压力进样 电动进样 浓缩进样,毛细管种类,非涂层毛细管（裸管） 内壁涂层毛细管（涂层管）,非涂层毛细管-电渗流的概念,电渗流的特点,纯电泳状态,电泳+电渗流,电渗流的作用,电渗流的活塞流特点,Hydrodynamic flow Parabolic Resistance to flow at surface More diffusion/broader detection zone,EOF gives plug flow Minimizes band broadening Narrows detection zone,Hydrodynamic flow Parabolic Resistance to flow at surface More diffusion/broader detection zone,EOF gives plug flow Minimizes band broadening Narrows detection zone,电渗流的活塞流特点,电渗流是CE中最大的驱动力来源之一,电渗流的正面及负面作用,正面作用 增加分离速度 使得正、负电荷物质同时分离,负面作用 减少分离时间和分离有效距离 电渗流的波动极大的影响了迁移时间的重复性,影响电渗流的因素,pH值 pH越高，电渗流越大 离子强度 离子强度越高，电渗流越小 缓冲溶液添加剂 离子型表面活性剂、有机溶剂、环糊精,电渗流随pH的变化情况,控制电渗流的三个重要手段,采用涂层毛细管，消除电渗流的影响 改变pH，从而调整电渗流的大小。pH10以后，电渗流基本不增加 添加剂：有机溶剂可以降低电渗流的大小，从而增加分离的有效距离；表面活性剂可以彻底改变电渗流的方向和大小，主要是在阴离子分析时使用,缓冲溶液的影响和选择,在CE中应该根据以下性质来选择缓冲溶液： 在所选的pH范围内有较强缓冲能力； 在检测波长处有低的紫外吸收； 小的淌度（即大体积、低电荷离子）以降低所产生的电流。 那些被称为生物“优良缓冲液”的，如Tris, borate, CAPS等特别有用，因为这些缓冲溶液中的离子一般较大，能够在较高浓度下使用而不会产生大的电流，但一个潜在的缺点是这些大的缓冲离子有强的紫外吸收。,常用的CE缓冲体系,磷酸钠体系 宽缓冲范围 硼酸钠体系 高pH范围 Tris-HCl体系 低pH范围 醋酸-醋酸铵体系 CE/MS常用体系,CZE分离条件的选择,毛细管类型-涂层还是非涂层？ 毛细管长度-长毛细管还是短毛细管？ 缓冲液体系-种类和pH值 添加剂类型-甲醇|环糊精|乙腈 检测器选择-紫外|二极管阵列|激光诱导荧光,缓冲溶液的选择,可先用磷酸缓冲体系为搜寻基础，初步确定（最佳）pH范围后，再进一步细选出更好pH和缓冲试剂。磷酸盐是毛细管电泳中最常用的缓冲体系之一，它的紫外吸收低，pH缓冲范围比较宽（pH=1.513），但电导也比较大。,缓冲溶液及pH值的选择,研究经验表明：对于蛋白质、肽和氨基酸等两性样品，采用酸性（pH 2）或碱性（pH9）分离条件，比较容易得到好的分离结果；糖类样品通常在pH=911之间能获得最佳分离；羧酸或其他样品多在pH=59之间选择分离条件。,缓冲溶液及pH值的选择,pH 的选择也和所用的毛细管种类有关，许多涂层毛细管只能在一定的pH范围内工作，例如聚丙烯酰胺涂层毛细管，在3pH8的范围以外工作，其涂层容易水解失效。,缓冲溶液及pH值的选择,在相同的 pH下，不同缓冲体系的分离效果不尽相同，有的可能相差甚远。一般的经验是，能与样品发生相互作用的试剂，有可能就是最好的试剂。一个典型的例子是，在分离糖类和DNA等分子时优先使用硼酸盐缓冲体系，因为硼酸根能与糖羟基形成配位键，从而增加糖的负电荷和分离度。硼酸缓冲试剂也适用于其他含邻位羟基或多羟基化合物的分离。,缓冲溶液及pH值的选择,缓冲试剂及pH调节剂的浓度也需要优化。缓冲试剂的浓度一般控制在10200 mmol/L之间。电导率高的缓冲试剂如磷酸盐和硼砂等，其浓度多控制在20 mmol/L附近，而电导小的试剂如硼酸及HEPES等，其浓度可在100 mmol/L以上。有时为了抑制蛋白质吸附等特殊目的，可采用很高（0.5mol/L）的试剂浓度，此时要注意减少分离电压，分析速度自然也将随之降低。,添加剂的选择,目的： 改善分离 抑制分析物在毛细管上的吸附,添加剂的选择,甲醇|乙腈（5-50%） 降低电渗流，增加分离有效距离，从而改善分离效果 增加非极性物质的水溶性 环糊精|SDS等表面活性剂 增加分离选择性，提高分析效果 降低电渗流，增加分离有效距离，从而改善分离效果 非极性高分子聚合物 掩蔽毛细管内壁电荷，抑制分子吸附 降低电渗流 形成一定的分子筛，提高分子大小选择性,第二章 毛细管胶束电动色谱,电解质中加入表面活性剂(surfactant，例如SDS)，使之形成胶束（Micelle），样品根据其疏水性(Hydrophobicity)强弱的差异，在胶束与电解质的分配系数有所不同來进行分离 ，样品疏水性愈強，则进入胶束的机会愈大。通常物质进入胶束后，泳动的速度会变慢，因此疏水性愈強的物质则愈慢出來。,毛细管胶束电动色谱原理,Micellar Electrokinetic Chromatography (MEKC),七种青霉素的分离,CZE : 20mM Pi-Borate, pH 8.5,(B) MEKC : 0.1 M SDS in (A) soln.,胶束电动色谱的特点,优点 增加对弱极性物质分离的分离度 在中药分析、天然产物分析、农药分析中经常使用,缺点 稳定性不佳，达到好的重复性比较困难,第三章 毛细管凝胶电泳,毛細管內先填充凝胶(例如polyacrylamide或cellulose)，此时凝胶会在毛細管內形成分子筛，样品依分子量的大小在毛細管內移动速度不同而进行分离。 主要用于核酸片断及蛋白分子量分析,毛细管凝胶电泳,CE双链及单链核酸分析,45-寡核苷酸质控,CE-SDS蛋白分子量分析,第四章 毛细管等电聚焦,第五章 亲和毛细管电泳 -分离条件基于CZE,当在CZE样品或缓冲液中引入抗原或抗体时，便可以用于研究和分析抗体或抗原，也可以利用这种方法对电泳峰进行特异性定性。显然除抗原与抗体的选择需要应用生化知识外，其他方面的选择与CZE等相同。 用于研究 分子间相互作用测定，分子构型变化 特定物质检测 活性物质筛选,ACE测定分子间结合常数与解离速率,JAK2与SH2-B之间的相互作用研究,ACE特定物质的检测,ACE用于相互作用筛选,适体Aptamer类似于抗体，但可以体外合成，结合常数比抗体更高，有广泛的药物筛选和临床诊断应用潜力 目前已有以下的一些蛋白的aptamer是采用CE方法筛选得到的 IgE HIV type 1 reverse transcriptase Thrombin Anti-thrombin III Taq DNA polymerase,ACE用于相互作用筛选,传统筛选方法如亲和色谱或者CEC筛选一个Aptamer需要4-6周 而CE只需要几天就可以了，大大提高了筛选速度 -MicroScale Bioseparations 2006,第六章 检测器选择,小分子检测 大分子检测,CE检测器种类及性能,小分子检测,有紫外吸收 首先选择二极管阵列检测器或紫外检测器 无紫外吸收 可以衍生化的，可以采用自外衍生的方法再用紫外检测器检测，如氨基酸、还原性糖等 不可以衍生化的，可采用间接紫外法用紫外检测器检测，也可以尝试电化学检测器 有荧光或需要高灵敏度检测的可采用LIF检测器 需要测定结构或者难以用光学检测器检测的，可以考虑质谱检测,大分子检测,蛋白、核酸 可以首先选择紫外检测器 如果需要高灵敏度检测可以采用柱前或者柱上衍生的方法标记荧光，然后用LIF检测 如果需要特异性检测，可使用特异性荧光探针，标记后再LIF检测 需要测定分子量或氨基酸序列，可采用质谱检测 多糖 含量较高的多糖可以采用末端吸收法以紫外检测器检测 含量较低的还原性多糖可用衍生试剂标记后以LIF、UV的方式检测,第七章 分离条件选择流程,分离条件的选择是毛细管电泳中最重要但也是最难之处。不同的专业研究工作者可能会有各自不同的选择策略和流程，我们提出如下九步选择流程，仅供参考： 第一步，尽可能多地了解分离样品的类型、来源、组成及其性质； 第二步，根据样品的可能性质和来源，选择分离模式，若无样品信息可先选CZE；,条件选择流程,第三步，根据样品性质确定检测方法，一般先选直接紫外吸收； 第四步，确定样品处理方式，包括衍生方案以及离心过滤除蛋白等； 第五步，根据样品解离常数计算最佳pH，或利用75mID毛细管和磷酸缓冲体系确定pH范围;,条件选择流程,第六步，根据所需pH构建缓冲体系，包括进一步优化pH、缓冲试剂浓度等； 第七步，优化其他操作参数，如毛细管尺寸、分离电压和温度等； 第八步，确定是否需要使用添加剂和使用非水溶剂； 第九步，确定是否需要换用其他分离模式。,条件选择流程,在毛细管电泳条件选择中，还应充分注意下列操作事项： 最好对样品和缓冲液进行过滤或离心处理。 毛细管的洗涤或平衡，与缓冲体系、pH以及柱子有关。磷酸根与石英和玻璃之间存在慢相互作用，需要延长平衡或冲洗时间，处理的时间应由分离重现性决定。,条件选择流程,欲降低缓冲液的电导，应尽量使用所谓的“生物缓冲试剂”；欲降低检测背景，则应尽量使用无机缓冲试剂。 欲保持分离重现，要尽量采用相同的条件，包括毛细管、缓冲液、温度、电压、洗涤等。,第八章 各类物质的分离要点,阴离子及有机酸 此类物质没有紫外吸收，要采用间接检测法 间接紫外法一般以铬酸钠等物质作为背景吸收物 CTAB通常用作电渗流反向剂，以加速出峰，提高峰的尖锐度 要使用反向极性分离,各类物质的分离要点,阳离子及金属离子的分离 此类物质没有紫外吸收，要采用间接检测法 间接紫外法一般以氨基吡啶等物质作为背景吸收物 与阴离子不同的是阳离子的分析不需要在缓冲溶液中添加电渗流反向试剂 也不需要使用反向极性分离,各类物质的分离要点,易电离有极性的化合物 一般采用长60cm的毛细管 分离的最佳pH在分析物pKa+/-1左右 通常不需要添加剂,各类物质的分离要点,弱极性物质和水溶性差的物质（一些中药成分、农药等） 要注意分析物的溶解性，防止在毛细管中的沉淀 通过有机溶剂的添加，提高分析物在buffer中的溶解度 添加SDS，增加溶解度 降低样品中分析物的浓度，延长ramp time也可以防止分析物的析出,各类物质的分离要点,还原性的单糖、寡糖和多糖（葡萄糖、半乳糖等及其聚合物） 通常无紫外和荧光，注意检测问题 可用APTS等衍生试剂衍生，使其带上电荷和紫外/荧光基团 多糖也可以采用末端吸收来检测（180-200nm），不需要衍生化处理，但是要尽量采用高pH使得羟基部分电离带电,各类物质的分离要点,非还原性的单糖、寡糖和多糖 很难采用衍生的方法检测，通常对单糖和寡糖采用间接检测法 对多糖采用末端吸收的方法来检测 通常采用高pH使得羟基部分电离带电 高pH缓冲液还有防止多糖在毛细管内壁吸附的作