分子检验检测技术培训讲义

分子检验检测技术课程讲义一、分子诊断又称DNA诊断或基因诊断，是通过从生物体（比如疾病患者等）内提取样本用基因检测方法来判断该生物体是否有基因异常或携带有其它不应该属于该生物体的生物成份。 （检测物）病原1 DNA 加热 退火（降温） 是否杂交（待检物）病原2 DNA 加热 退火（降温）注意：用于分子检测的器皿都需要消毒、灭菌所用水必须是双蒸水、去离子水二、分子检验检测的意义 随着社会经济的发展，国际国内贸易的日趋频繁，有害生物的扩散加速，动植物检疫工作越来越受到重视，由于检疫性有害生物的扩散造成的各类问题备受关注。 实现对检疫性有害生物的快速检测是当前社会经济发展的迫切需求。三、分子检验检测与传统检验检测方法的异同传统检验检疫方法：耗时，专业要求高等等，主要是症状上判断：同症状，多病原，疑难多，问题也多，耗时、耗材、耗力，对结果的准确性影响很大，且对专家的要求很高。 分子检验检测方法：快速，准确等等，直接从遗传物质入手，根据核酸序列来检测，既准确又快速。DNA序列的独特性、专一性的检测标记进行鉴定。四、分子探针，特异性其特点：三个相连核苷酸组成一个密码子，编码一个氨基酸，共有64个密码子。密码子之间无核苷酸间隔。一种氨基酸可有多种密码子。所有生物使用同一套密码子。分子生物学的基础一、几个简单的问题1.分子生物学主要研究什么？ 分子生物学是从分子水平研究生命本质的一门新兴边缘学科，它以核酸和蛋白质等生物大分子的结构、组成和功能，以及它们在遗传信息和细胞信息传递中的作用等为研究对象，是当前生命科学中发展最快并正在与其他学科广泛交叉和渗透的前沿领域；它包括：a、研究核酸结构及其功能的核酸分子生物学；b、研究蛋白质结构与功能的蛋白质分子生物学；c、研究细胞信息传递与细胞信号传导的细胞分子生物学等。 2.核酸包括什么？3.核苷酸是怎么连接的？4.什么是一级结构？ 5.二级结构是什么？6.三级结构呢？7.那么酶切是切什么？几级结构？8.RNA有几种？各有什么功能和特性？ 二、核酸的理化性质 1粘度 2紫外吸收 3沉降系数 4溶解性 5变性和复性三、思考题 请简述生物体、细胞、染色体、蛋白质、核酸、基因等相互间的关系，并阐述分子检验检测的目标对象。三、分子诊断技术概念：利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对病害作出诊断的方法。特点：针对性强、特异性高、灵敏度高、适用性强、诊断范围四、分子诊断的常用技术方法 核酸分子杂交技术1.限制性内切酶酶谱分析法 2.DNA限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析3.等位基因特异寡核苷酸探针（allele specific oligonucleotide，ASO）杂交法聚合酶链反应（PCR）基因测序基因芯片 动植物检疫的理想目标是：防止所有的检疫性有害生物（物质），人为跨境（国家或地区）传播，并及时地发现、限制或铲除外来的检疫性有害生物。 动植物病原物检验检疫技术是动植物检疫工作的重要组成部分，在动植物、动植物产品及其他检疫物的装载容器、包装物，以及来自动植物疫区的运输工具中是否有有害生物，或有害生物的种类与数量有多少，只有通过检测才能知道。动植物检验检疫的目的就是要发现、检查和鉴定有害生物，以作为出证放行或作进一步检疫处理的依据。 检测检验是判断一个样品内是否存在特定目标病原物，而病害诊断是病害发生原因和性质的鉴定。 检测检验技术要求快速、准确、灵敏、安全、高通量、简便、易于标准化和推广应用。 有害生物的传统检测鉴定，主要是从症状、形态鉴定、接种鉴别寄主、病原物培养性状等方面来观察有害生物所表现的表型和性状来判断，受环境因素，人为因素等多种因素的影响，往往影响对结果的准确判断。 此外，对于病害，许多传统的诊断程序一般都涉及到两个过程：第一，先要对病原物质进行培养，培养后再分析它的生理生化特性；第二，确定它到底是哪一类的病原物，是病毒、细菌还是其他的物质。这种诊断方法成本高、速度慢、效率低。如果病原体生长特别慢或者根本无法通过人工培养的方法获得，例如有些衣原体、植原体就不能培养或很难人工培养，那么这种传统的诊断程序就很难有结果。 分子生物学研究表明，所有生命类型和不同物种差异的根源都是由遗传物质（DNA或RNA）决定的，而遗传信息又是核酸上的核苷酸序列所决定的。因此最准确的检测鉴定方法，就是测定一些基于核酸序列的分子生物学检测技术。 分子检测技术主要是指应用分子生物学的方法来对有害生物进行诊断检测鉴定。从理论上讲，任何一个决定特定生物学特性的DNA序列都应该是独特的，都可以用作专一性的检测标记，这就是分子诊断检测鉴定的理论基础。 不论是传统的常规检测，还是现代的分子技术，一种有效的检测方法都应该具备以下3个条件：专一性（specificity）强，这指的是检测只对目标分子或只对某一种有害生物分子产生阳性反应；灵敏度（sensitivity）高，是指即使只有微量的目标分子，或是在有很多干扰存在的情况下，也能够很灵敏地检测出所寻找的那种有害生物的分子；操作简单（simplicity），主要是指在做大规模检测时，要求能够操作方便、简单、高效、廉价。分类、鉴定、命名、诊断分类（classification）分类的任务是解决从个别到一般或从具体到抽象的问题，亦即通过收集大量有关个体描述的资料，经过科学的归纳，整理成一个科学的分类系统。理想的分类系统应该是反映生物进化规律的自然分类系统。鉴定（identification） 鉴定的任务与分类恰恰相反，它是从一般到特殊或从抽象到具体的过程，亦即通过详细的观察和描述一个未知名称纯种生物的各种性状特征，然后查找现成的分类系统，以达到知类辨名的目的。将病原物的种类和病害种类同已知种类比较异同，确定其科学名称或分类上的地位。命名（nomenclature）命名的任务是为一个新发现的生物种确定一个新学名。亦即当你详细观察和描述一个未知菌种后，经过认真查找现有的权威性分类手册，发现这是一个以往还未记载过的新种，这时就得按微生物的国际命名法规给以一个新的学名。诊断 （diagnosis）从症状等表型特征来判断其病因，确定病害种类。DNA提取与测定及PCR分子生物学基础1、核酸的组成、结构与性质 核酸(nucleic acid)是体内重要的生物大分子，由于最初从细胞核分离出来，又具有酸性，故称为核酸。核酸的基本组成单位是核苷酸 。DNA的基本组成单位是脱氧核糖核苷酸。RNA的基本组成单位是核糖核苷酸 。嘌呤 嘧啶 碱基腺嘌呤（A）鸟嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）尿嘧啶（U）DNA、RNA均有DNA有RNA有1 碱 基 嘌呤(purine)嘧啶(pyrimidine)戊 糖构成RNA 构成DNA核 苷：核苷 = 碱基 + 戊糖连接方式：糖苷键嘌呤环上的N-9或嘧啶环上的N-1与糖的C-1以糖苷键相连。核苷酸核苷酸糖苷键酯键核苷酸：AMP, GMP, UMP, CMP脱氧核苷酸：dAMP, dGMP, dTMP, dCMP RNA和DNA中常见的核苷酸碱 基RNADNA腺嘌呤腺嘌呤核苷酸（腺苷酸，AMP）腺嘌呤脱氧核苷酸（脱氧腺苷酸，dAMP）鸟嘌呤鸟嘌呤核苷酸（鸟苷酸，GMP）鸟嘌呤脱氧核苷酸（脱氧鸟苷酸，dGMP）胞嘧啶胞嘧啶核苷酸（胞苷酸，CMP）胞嘧啶脱氧核苷酸（脱氧胞苷酸，dCMP）尿嘧啶尿嘧啶核苷酸（尿苷酸，UMP）胸腺嘧啶胸腺嘧啶脱氧核苷酸（脱氧胸苷酸，dTMP）游离核苷酸及其衍生物多磷酸核苷酸环化核苷酸: cAMP，cGMP2.核酸的分类及生物功能 核糖核酸（RNA）：遗传信息的载体核糖体RNA（rRNA）:约占细胞中RNA总量的80%，是细胞质中核糖体的组成成分。蛋白质合成场所，指导蛋白质合成。转运RNA（t RNA ）:约占全部RNA的15%，转运RNA是细胞中相对分子量最小的一种RNA分子，以游离态存在于细胞质中。转运氨基酸。信使RNA（mRNA） : 占细胞中RNA总量的5%左右。它是以DNA为模板，经转录合成。转录遗传信息。3.核酸的一级结构 核酸中核苷酸的排列顺序。由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基序列。 核苷酸之间以3 , 5 -磷酸二酯键连接形成多核苷酸链，即核酸。4.核酸的空间结构 a.DNA的双螺旋二级结构 DNA双螺旋模型的基本要点 1. 两条链反向平行，围绕同一中心轴构成右手双螺旋 。螺旋直径2nm，表面有大沟和小沟。2. 磷酸-脱氧核糖骨架位于螺旋外侧，碱基垂直于螺旋轴而伸入内侧。每圈螺旋含10个碱基对，螺距为3.4nm。3. 两条链通过碱基间的氢键相连，A对T有两个氢键，C对G有三个氢键，严格按照碱基配对原则。4. 维持双螺旋稳定的因素：横向为氢键，纵向为碱基间的堆积力。b.DNA的三级结构 DNA的三级结构指在二级结构的基础上，DNA双螺旋进一步卷曲所形成的闭合环状、线状等超螺旋结构。 c.RNA的空间结构 单链RNA自行盘绕形成局部双螺旋区，在螺旋区，A与U配对，G与C配对。在3种RNA中，目前，研究最清楚的是tRNA的空间结构，它的二级结构均为三叶草形，三级结构呈倒L形。 核酸与核苷酸的主要性质及其应用 1 . 一般理化性质 核酸为多元酸，具有较强的酸性；DNA是线性高分子，粘度极大；2. 紫外吸收性质 在260nm波长有最大吸收峰，是由碱基的共轭双键决定。这一特性常用作核酸的定性、定量分析。3.核酸的变性、复性与杂交 核酸的变性：在某些理化因素作用下（温度、酸碱、有机溶剂、尿素等），核酸分子互补双链之间氢键断裂，使双螺旋结构松散变成单链的过程。变性产生增色效应。变性表征： 生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效应） 变性因素： pH（11.3或5.0）变性剂（脲、甲酰胺、甲醛）低离子强度、加热 核酸的复性：变性核酸在一定条件下如温度逐步恢复到生理范围内，两条互补链重新恢复天然的双螺旋构象。 将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。变性的DNA缓慢冷却时可复性即 “退火”。 退火温度Tm25复性影响因素: 片段浓度/片段大小/片段复杂性（重复序列数目）/溶液离子强度复性特点：紫外吸收减少减色效应：DNA复性过程中，紫外吸收减少的现象常用的复性方法：退火 杂交：不同来源的核酸经变性和复性的过程，其中一些不同的核苷酸单链由于存在包括：DNADNA 杂交 DNARNA 杂交 RNARNA 杂交原因：不同核酸的碱基之间可以形成碱基配对用途：是分子生物学研究与基因工程操作的常用技术 核酸分子检测技术核酸分子生物学自1953年Waston和Crick提出DNA双螺旋模型，标志着（核酸）分子生物学的创立。随后，双螺旋结构创始人之一的Crick于1958年提出分子遗传中心法则（central dogma），从而揭示了核酸与蛋白质的内在关系，以及RNA作为遗传信息传递者的生物学功能以来发展迅速。进入20世纪70年代，随着限制性内切酶的发现和DNA杂交技术的建立，核酸分子生物学进入技术化时代。之后，各种核酸分子生物学技术不断出现，概括起来，主要包括核酸分子杂交（molecular hybridization of nucleic acids）、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）和DNA重组（recombinant DNA）技术等。 核酸的发现与早期研究 1944年 Avery等人证实DNA是遗传物质 1953年 Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构 1985年 Mullis发明PCR 技术 2001年 美、英等国完成人类基因组计划基本框架1978年Kan和Dozy首先应用羊水细胞DNA限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）作镰刀状细胞贫血病的产前诊断，从而开创了DNA诊断的新技术。二十多年来，DNA诊断技术取得了飞速的发展，建立了多种多样的检测方法，这些检测方法已经广泛用于医学、农学、动植物检疫等各领域。一、核酸的提取核酸的分离与提纯是核酸研究中最基本的技术，分离获得的核酸质量的好坏直接关系到实验的成败，但是不同的研究目的对核酸的纯度和量的要求不尽相同。（一）分离提取核酸的方法目前分离提取核酸的方法多种多样，概括起来，可以分为三大类：通用方法，此方法的适用范围较广，对一般的实验材料都适用。针对某些特殊材料的方法，例如含多糖和多酚类物质较多的植物材料，以及一些动植物蜡制标本材料和毛发与角质等材料，通常在提取核酸的过程中，要采用一些适当的措施，消除多糖、多酚和角蛋白等的影响。针对某个物种或某一器官（或组织、细胞器）的方法，如针对某一物种例如棉花、甘薯等的特性，或某一器官和组织例如动物的肝脏或肾脏等的特性，或某些细胞器例如叶绿体和核糖体的特性，有一些专门的核酸提取方法。（二）分离提纯核酸的基本要求但是无论采用哪一种方法，一般而言，一个好的核酸的分离提纯方法都应该符合三个基本要求：所获得的核酸纯度应该能够满足下游操作的要求，例如用于核酸组成和结构分析的材料，对纯度的要求很高，否则将可能影响分析结果，而对于用于PCR的核酸，通常纯度要求不高，但是不得含有干扰PCR反应的污染物；所得到的核酸应当完整，电泳检查时可以给出精确性高、重复性好的迁移带型；所得到的核酸应有足够的量。所以，根据实验的要求和目的，常常有核酸大量提取方法和微量提取方法之分。（三）核酸提取的基本过程1材料的准备与细胞的破碎（1）材料的准备由于实验目的不同，对于核酸提取材料的要求也不相同，通常都要求材料新鲜无污染，这里所说的新鲜是指对采集得到的样品应立即进行处理，对于暂时来不及处理的样品应该在适当处理后冷藏保存。应尽可能选择富含目的核酸的实验材料，如果对目的核酸的分布不很清楚，也可以通过预备实验进行分析，还可以采取适当的措施增加实验材料中目的核酸的含量，例如在提取质粒DNA时，可以先用氯霉素处理宿主细菌，从而使质粒的拷贝数显著增加。对于一些存在于特定细胞或细胞器中的核酸，应先分离富集这些细胞或细胞器，然后再进行核酸的提取，例如要提取叶绿体或线粒体中的核酸，可以先采用超速离心的方法收集叶绿体或线粒体，然后再进行核酸提取。（2）细胞的破碎在天然状态下，除了少数病毒的核酸不存在于细胞内外，其他核酸都存在于动物、植物或微生物的细胞内，所以在提取核酸前首先要进行细胞的破碎。破碎细胞的方法很多，大体上可以分为三大类，机械破碎细胞，机械法破碎细胞通常适合于细胞壁比较坚固的植物细胞和真菌细胞，最常用的手段是液氮冷冻研磨，即加人液氮使样品迅速冷冻，然后研磨破碎细胞，有时也采用高速组织捣碎机、超声波和反复融冻等手段进行破碎。化学法破碎细胞，化学破碎法是采用一些化学试剂使细胞破碎，最常用的破碎细胞化学试剂是十二烷基磺酸钠（SDS）和NaOH，另外，还有Tween-80和Triton X-100等，化学方法常用于动物细胞的破碎和质粒DNA提取时破碎细菌细胞。酶法破碎细胞，酶法是采用生物酶制剂破碎细胞的方法，最常用的是在细菌细胞破碎中的溶菌酶。除了上述细胞破碎方法之外，还可以采用直接加热等方法破碎细胞。上述方法可以单独使用，也可以联合起来使用，例如将溶菌酶和SDS一起使用，能很好地破碎细菌细胞。另外，有些细胞破碎方法还兼有其他作用，例如SDS和Tween-80等去污剂，除了能使细胞溶解破碎之外，还具有使蛋白质和核酸分离以及抑制核糖核酸酶活性等作用。2核酸的提取和纯化（1）蛋白质的沉淀细胞破碎后，核酸和胞内的其他物质混合在一起，因此必须采用适当的措施使核酸从中分离出来。对核酸分离纯化影响最大的是蛋白质，去除蛋白质的方法很多，常用的方法包括：使用SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1，5-二磺酸钠等去污剂使蛋白质与核酸分离；采用苯酚和氯仿使蛋白质沉淀；采用某些蛋白酶使蛋白质降解，最常用的是蛋白酶K和链霉蛋白酶。（2）核酸酶的抑制在核酸提取中，还要特别注意的是应采用适当的方法抑制或消除核酸酶的活性，以避免核酸在提取过程中被分解。实际上，上述各种蛋白质沉淀剂都是很好的核酸酶抑制剂，它们在沉淀蛋白质的同时，也抑制了核酸酶的活性。另外，在核酸的提取中，通常加入乙二胺四乙酸（EDTA），它能够络合Mg2+和Ca2+等二价金属离子，从而抑制DNA酶的活性；也可以在核酸的提取过程中加入一些化学物质来抑制酶活性，例如异硫氰酸胍和-巯基乙醇都能很好地抑制RNA酶的活性。（3）RNA与DNA的分离去除了蛋白质等杂质后，接下来是如何将DNA和RNA进行分离。可以先将材料中的总核酸沉淀分离出来，然后采用RNA酶分解RNA就可以得到DNA，也可以采用LiCl选择性地沉淀DNA从而使RNA与DNA分开。另外，可以利用DNA核蛋白能溶于水和高浓度（例如12 mol/L。）的NaCl溶液而难溶于低浓度（例如0.14mol/L）的NaCl溶液，而RNA核蛋白则易溶于低浓度（例如0.14 mol/L）的NaCl溶液的特性，首先采用低浓度NaCl溶液将RNA核蛋白从溶液中去除，然后采用SDS等使蛋白质变性沉淀，并用高浓度的NaCl溶液溶解DNA，从而实现RNA与DNA的分离与纯化。对于不同RNA（mRNA、tRNA、rRNA）的分离通常很不容易，可以先将细胞匀浆进行超速离心，制得细胞核、线粒体和核糖体等细胞器，然后再分别从中提取不同类型的RNA。对于真核生物的mRNA，由于在3端有polyA尾巴，所以可以使其和固定化的寡聚脱氧胸腺核苷酸oligo（dT）结合，从而选择性地分离纯化mRNA。另外，目前从动物组织和培养细胞中提取完整总RNA普遍采用的方法是异硫氰酸胍法，异硫氰酸胍具有很强的抑制RNA酶活性的能力，同时能很好地使蛋白质变性沉淀，经异硫氰酸胍提取的RNA可以直接用于逆转录生成cDNA。（4）核酸的浓缩根据核酸溶于水而不溶于有机溶剂的特性，采用70%浓度的乙醇，就可以将核酸从溶液中沉淀分离出来，从而实现核酸的浓缩，当然也可以采用其他有机溶剂沉淀、浓缩核酸。3核酸纯度的鉴定和定量分析核酸在260nm处有最大吸收值，而蛋白质最大吸收值在280nm处。通过测定核酸溶液260nm和280nm处的吸光值，并计算它们的比值，可以估计核酸的纯度，DNA纯品的A260nm/A280nm比值为1.8，而RNA纯品的比值为2.0，如果样品中含有蛋白质和苯酚等杂质 ，则两者的比值明显会低于上述值。同样，利用核酸紫外吸收的特性可以进行定量分析。对纯品核酸，在260nm处的一个吸光值单位相当于50g/ml的双链DNA，37g/ml的单链DNA或RNA，或者20g/ml的单链寡核苷酸。对于核酸的分子质量大小和组成等，可以通过琼脂糖凝胶电泳等方法进行分析和鉴定。 聚合酶链式反应Polymerase chain reaction（PCR）一、PCR的定义 在引物指导下由酶催化的对特定克隆或基因组DNA序列进行的体外扩增反应。二、PCR技术的优点特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍三、PCR原理PCR是Kary Mullis于1985年发明的一种模拟天然DNA复制过程,即利用DNA 聚合酶（如Taq DNA聚合酶）等在体外条件下，催化一对引物间的特异DNA片段合成的基因体外扩增技术。PCR技术原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。模板DNA变性：加热至94左右，双链DNA解离成单链；模板DNA与引物的退火(复性)：55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：在Taq DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的双链；重复循环变性-退火-延伸三过程，使DNA扩增量呈指数上升。 PCR通用操作程序 配制反应体系，混匀后，离心数秒。 PCR仪上设置程序，置反应管于PCR仪上，进行热循环（加矿物油50100l于反应液表面以防蒸发） 琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。四、PCR的主要用途（一）目的基因的克隆（二）基因的体外突变（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列测定（五）基因突变分析几种重要的PCR衍生技术（一）反转录PCR把RNA提取后反转录成cDNA，并以其为模板进行的PCR反应，通常用于检测某种RNA是否被表达，或者比较其相对表达水平巢式PCR（nested PCR），是指利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在在内引物的存在下进行第二轮扩增。由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；又有两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。 所以反转录-巢式PCR就是以cDNA为模板进行的巢式PCR，它和简单的反转录PCR一样是用于检测某种RNA是否被表达，或者比较其相对表达水平，但是特异性更高，可靠性更强。 （二）原位PCR(In-situ PCR) 原位PCR是指直接用细胞涂片或石蜡片包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增，然后用特异探针进行原位杂交检测含该特异序列的细胞的一种方法。 五、PCR的标准反应体系 10扩增缓冲液 10l 4种dNTP混合物 各200mol/L 引物 10100 pmol 模板DNA 0.12g Taq DNA聚合酶（耐热聚合酶） 2.5 u （Mg2+） 1.5 mmol/L 加双或三蒸水 100ul反应体系对PCR扩增的影响DNA模板 纯度：蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应 完整性：模板降解会导致PCR扩增无产物 浓度：加量过多导致非特异性扩增增加 特异性：长度适当、避免二级结构和二聚体 完整性：避免反复冻融 浓度 ：应适当,过高导致非特异性增加六、PCR反应五要素引物 （primer）、酶 （Taq DNA polymerase）、 dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP）、 模板 （template）、 Mg2+ （magnesium）（一）引物引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度 引物设计的原则引物长度：15-30个碱基，常为20个碱基左右引物扩增跨度：以500 bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段引物碱基：G+C含量以40-60%为宜, ATGC最好随机分布 避免引物内部出现二级结构 避免两引物间互补，特别是 3端引物 3端的碱基要求严格配对,特别是最末及倒数第二个碱基引物中可以加上合适的酶切位点要作酶切时加引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性（二） 酶及其浓度Taq DNA聚合酶一个典型的 PCR 反应约需酶量 2.5 U，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少特 异 性：基因组扩增、RT-PCR保 真 性：基因筛选、测序、 基因克隆长片段扩增：构建基因图谱、测序、分子遗传学扩增效率：复杂模板扩增（GC含量高、二级结构）PCR试剂盒：复杂模板扩增、大规模基因检测（三） dNTP 的质量与浓度dNTP质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系1)dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解；2)在PCR反应中，dNTP应为20200umol/L，注意4种dNTP的浓度要相等； 3)dNTP 能与Mg2+结合，使游离Mg2+浓度降低（四）模板（template）模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败的关键环节之一。（五） Mg2+浓度1) Mg2+对扩增特异性和产量有显著影响: Mg2+浓度过高，反应特异性降低； 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶活性，使反应产物减少。2)在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200mol/L时，Mg2+浓度为1.52.0 mmol/L为宜；七、 PCR热循环条件的选择（一）温度与时间的设置： 设置变性-退火-延伸三个温度点： 1）93-95变性； 2）40-60退火； 3）70-75延伸 对于较短靶基因（长度为100300bp时）可采用二温度点法， 一般采用94变性，65左右退火与延伸 变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因，一般9394 l min足以使模板DNA变性；若低于93则需延长时间，但温度不能过高，高温环境对酶的活性有影响。退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶片段的长度引物的复性温度当引物长度为15-20个碱基时，在高离子强度中反应（如1M NaCl） Tm = 4（G+C）2（A+T） 复性温度=Tm值 -（510）复性时间一般为3060 sec，足以使引物与模板之间完全结合 延伸温度与时间：延伸温度：一般选择在7075之间,常用温度为72延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定,1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min 延伸时间过长会导致非特异性扩增；对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些（二）循环次数决定PCR扩增程度 主要取决于模板DNA的浓度 选在2540次之间 平台期与平台效应（plateau effect） PCR经过一定数量的循环后，随着产物的对数累积趋于饱和，DNA片段不再呈指数积累，而是进入线性增长期或静止期，此过程称为平台效应。八、PCR反应特点（一）特异性强 靶序列的特异性决定扩增产物的特异性。 在较高的温度下进行，引物结合的特异性大大增加。（二）灵敏度高 PCR 产物的生成量是以指数方式增加 从 100 万个细胞中检出一个靶细胞，在细菌学中最小检出率为3个细菌（三）简便、快速 在DNA扩增仪中进行变性-退火-延伸反应，一般13 小时完成。（三） 对模板的纯度要求低可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA或RNA扩增检测。九、PCR常见问题与对策PCR常见问题之一 无扩增产物 现象：正对照有条带，而样品则无； 原因：模板:含有抑制物，含量低 Buffer对样品不合适 引物设计不当或者发生降解 反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 对策：纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 更换Buffer或调整浓度 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 降低退火温度、延长延伸时间PCR常见问题之二非特异性扩增 现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。原因：引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 Mg2+浓度偏高 退火温度偏低 循环次数过多对策：重新设计引物或者使用巢式PCR 适当降低模板或引物浓度 适当减少酶量 降低镁离子浓度 适当提高退火温度或使用二阶段温度法 减少循环次数 PCR常见问题之三拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态 原因：模板不纯 Buffer不合适 退火温度偏低 酶量过多 dNTP、Mg2+浓度偏高循环次数过多对策：纯化模板 更换Buffer 适当提高退火温度 适量用酶 适当降低dNTP和镁离子的浓度 减少循环次数PCR常见问题之四假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况)现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交叉污染 对策：1 操作时防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。离心管及枪头等均一次性使用。3 各种试剂先进行分装，低温贮存。四种策略巢式PCR（Nest-PCR）、递减PCR（TouchDown PCR）、热启动PCR（HotStart PCR）、使用PCR增强剂策略之一巢式PCR（Nest-PCR） 巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。 巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5 RACE）的特异性。 策略之二递减PCR（TouchDown PCR） 递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2,直到退火温度低于Tm 5。 特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。 递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。策略之三热启动PCR （HotStart PCR） 热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度； 现在有很多公司都有HotStart Taq酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用； 热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。策略之四使用PCR增强剂 甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等都可充当PCR的增强剂。 其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。 增强剂浓度要适当 十、 PCR污染（一）污染原因1 模板间交叉污染2 PCR试剂污染3 实验室中克隆质粒的污染（二）防止污染的方法1 合理分隔实验室2 移液枪不能接触PCR相关试剂3 手套、吸头、小离心管应一次性使用4 设阳性和阴性对照，重复实验十一、 PCR技术的应用 1 基因组中特异片段克隆 2 反向PCR 3 不对称PCR 4 RT-PCR 5 基因的体外诱变 6 基因组的比较研究核酸的分子杂交Nucleic Acid Hybridization核酸分子杂交： 把同源关系较近的，不同生物个体来源的变性DNA或RNA单链，经退火处理形成DNA-DNA或DNA-RNA这一过程叫分子杂交。 或是指同一生物个体非同一分子来源但具有互补序列（或某一区段互补）的两条多核苷酸链，通过碱基配对形成稳定的双链分子的过程。五、DNA芯片技术一、核酸分子杂交技术的原理 有互补特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混在一起时，其相应同源区段将会退火形成双链结构。 如把一段已知基因（DNA或RNA）的核酸序列用合适的标记物（如放射性同位素、生物素等）予以标记，当作探针（probe),在一定条件下， 按碱基互补配对原则与变性后的互补单链基因组DNA或RNA等进行杂交（变性）形成双链杂交体， 鉴定靶序列的存在、分子大小或进行靶序列的相对定量分析。 用合适方法（如放射自显影或免疫组织化学等技术）把标记物检测出来，就可确定靶核苷酸序列的拷贝数及表达丰度等。 应 用：1）检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系；2）用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。 二、核酸探针的制备探针（Probe): 一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。探针的制备方法探针长度一般以50300bp为宜。 制备方法：1）利用DNA重组技术2）PCR扩增3）化学合成探针的分类： 据制备方法及核酸性质不同，可分为：1 基因组DNA探针2 cDNA探针3 RNA探针4 寡核苷酸探针注意的问题 蛋白质电泳 常用SDS-PAGE 非变性PAGE Tris-Tricine胶中电泳聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套合成寡核苷酸探针注意原则：1）长度（10-50 bp); 2) G:C对含量40%-60%；3）探针内避免互补；4）避免同一碱基连续出现；5）与非靶序列有70%以上同源性或连续8个以上碱基序列相同，最好不用。三、核酸探针的标记为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。1、标记的种类同位素： 32P、35S、3H、125I等标记探针非同位素： 生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物 两者比较：后者不及前者敏感，但后者保存时间较长，无同位素污染。一个理想的标记物：1）标记前后探针的基本结构、化学性质相同;2）特异性强、本底低、重复性好；3）操作简单、节时；4）安全、无环境污染。2、探针的标记方法（1）缺口平移法（2）随机引物标记法（3）末端标记法（4）生物素光照标记法缺口平移法的原理将DNAase I 的水解活性与大肠杆菌DNA polymerase I 的53的聚合酶活性和5 3的外切酶活性相结合。首先用DNAase I 在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于E.coli的DNA pol I的53外切酶活性，切去带有5-磷酸的核苷酸；同时利用该酶53聚合酶活性，使生物素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。 这两种活性同时作用，缺口不断向3方向移动，DNA链上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。 随机引物标记法原理 用一些六核苷酸作为随机引物，将这些引物和探针DNA片段一起热变性，退火后，引物与单链DNA互补结合，再在DNA聚合酶的作用下，按碱基互补配对原则不断在其3- OH端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新的标记的探针片段。末端标记法原理（1）一种是在5末端加成标记法： 先用碱性磷酸酶（AP）去掉dsDNA 5-磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化标记的ATP转移加到DNA片段5-OH上。（2）在探针3-末端用末端转移酶掺入一个单标记的ddUTP。生物素光照标记法光敏生物素在紫外线照射下与DNA或RNA的碱基发生化学加成反应，获得生物素标记的DNA探针。四、核酸分子杂交技术 将特定的单链DNA或RNA混合在一起，其相应的同源区段（互补）就会退火形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子就被称为杂种核酸分子。能够杂交形成杂种分子的不同来源的DNA分子，其亲缘关系较为密切；反之，其亲缘关系则比较疏远。因此，DNA/DNA的杂交作用，可以用来检测特定生物有机体之间是否存在着亲缘关系，而形成DNA/RNA间杂种分子的能力可被用来揭示核酸片段中某一特定基因的位置。 在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地吸印上去的，因此，核酸杂交也被称为DNA印迹杂交。由于该方法是EMSouthern于1975年首先设计出来的，所以又叫做Southern blotting。杂交中常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜和二乙氨基乙基纤维素滤膜(DEAE)等。 核酸分子杂交包括两个步骤：第一，将样品转移到滤膜（印迹转移）;第二，将滤膜与DNA或RNA探针进行杂交。具体步骤：1、转移。2、在80下烘烤12h或用紫外线交联法将DNA片段永久性地固定在滤膜上。3、放入探针溶液中进行核酸杂交。一旦与滤膜上的单链DNA杂交之后，就很难再解链。4、用漂洗法去掉没有杂交上的探针分子。放射性同位素标记的探针可检测2ng ；为了安全，我们用DIG（地高辛）标记探针，荧光法检测杂交信号 。 基因组DNA被限制性内切酶酶切为DNA片段；各片段经电泳后在凝胶分为条带；（c）中由下到上是：玻璃板、一层滤纸、凝胶、滤膜、很多层滤纸、玻璃板、重物。通过毛细管作用将凝胶上的DNA条带原封不动地吸印到滤膜上去。（d）在80下烘烤12h或用紫外线交联法将DNA片段永久性地固定在滤膜上并形成单链。(e) 滤膜放入带标记的DNA或RNA核酸探针溶液中进行核酸杂交。核苷酸序列分析 仪器分析发展很快。 如果将来做测序工作，有了分子生物学基础，就可以做。 如果将来工作中需要测序，一般送到公司去测。（一）Southern 印迹杂交此技术由Southern 1975年首先设计。被检测对象为DNA。 （二）Northern印迹杂交与Southern杂交类似。检测目的RNA的存在与否及含量。（三）Western印迹杂交 将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并染色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗原”免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。（四）斑点印迹杂交和狭线印迹杂交适合于核酸样品的定性检测，而不是定量检测。优点-简单、迅速；核酸粗提、多样品检测缺点-不确定分子量、特异性不高，假阳性 (五）原位杂交in situ hybridization 又分为菌落杂交或噬菌斑、以及真核细胞原位杂交。 标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸中的互补序列杂交。 1969, Pardue -爪蟾核糖体基因探针 1970, Orth -兔乳头状瘤病毒cDNA探针 核酸原位杂交技术就是利用放射性或非放射性标记的已知核酸探针，通过放射自显影或非放射检测系统在组织、细胞及染色体上检测特异DNA或RNA序列的一种技术，是一种直接、简便的研究基因定位和表达的方法。 原位杂交的杂交双方是待测核酸序列及探针，待测核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性同位素、非放射性荧光染料直接或间接标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组DNA探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。一、原位杂交的基本原理 当溶液中的DNA分子经高温或高PH处理后，DNA双链分子会变性产生两条单链，如果将温度逐渐下降或PH恢复到中性，单链会按照碱基互补配对的原则，重新形成氢键恢复到原来的双链结构。如果两条单链的来源不同，只要它们之间的碱基顺序同源互补或者部分同源互补，在条件适宜时，就可以全部或部分复性，产生分子杂交。 原位杂交技术包括有：菌落原位杂交（colony in situ hybridization）、斑点杂交法（Dot blot）、Southern印迹杂交（Southern blot）、Northern印迹杂交（Northern blot）、组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）和基因组原位杂交（Genome in situ hybridization) 原位杂交组织化学技术在生命科学的研究中可视为一项革命性的技术。它使它们的研究从器官、组织和细胞水平走向分子水平。为各个学科的研究带来突破性的进展。其中特别突出的是细胞或组织的基因表达、染色体分析、病毒诊断和发育生物学。 原位杂交技术主要步骤： 材料处理及细胞样品的固定； 样品的制备和预处理； 探针的制备和预杂交； 探针及样品的变性； 杂交温育； 检测杂交信号，进行结果分析。染色体制片技术发展 染色体制片主要包括三类：一是中期染色体制片，二是粗线期染色体制片，然后是DNA纤维制片 。 中期染色体具有良好的形态结构，容易辨认，分辨率低，仅能达到13Mb，可检测到的DNA序列间长度一般要求超过1Mb。 粗线期的染色体的线性长度约为中期染色体的530倍，分辨率可达100kb，可识别的DNA片段长度大于100kb 。 DNA纤维制备技术所产生的染色体纤维的分辨率接近游离态DNA双螺旋，实际实验中可以达到几个kb。玻片的处理 原位杂交程序繁杂而且周期长 ，DNA更需要在玻片上表现出强有力的粘附