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文档简介
实验基本技术,分子生物学部分,存在问题,1. 基本的实验技能 2. 实验习惯 3. 责任感和安全性,态度决定一切!,核酸纯化技术 离心分离技术 凝胶电泳技术 核酸定量技术 分子杂交技术 序列分析技术 ,一 核酸纯化技术,原理,1. 核酸混合物成分: 结构类-细胞碎片,细胞器,其他 大分子-DNA,RNA,Protein,糖类,脂类等 小分子-氨基酸,小分子糖类和脂类,水,无机物等 2. 关键: DNA,RNAProtein 3. 方案: Protein变性 苯酚:强变性 25 氯仿:弱变性 24 异戊醇:消泡 1,4. 苯酚的处理:重蒸-饱和-pH 重蒸:去除醌类氧化物 饱和:防止核酸损耗 pH: pH7.0-8.0-核酸最适合 方法:蒸馏(183)-收集(棕色瓶)-饱和与调pH(Tris-HCl pH8.0)-0.1%8羟基喹啉- 4 或-20 保存,方法,样品+等体积饱和苯酚 10kb以上轻柔混匀;10kb以下振荡 离心(12000*g) 取上清,核酸相 Protein变性相 有机相,二 离心技术,原理,离心力:F= 2rm RCF=F/G= 2r/g =(2 * rpm)2r/g =1.119*10-5(rpm)2r 浮力密度:K=m-mp0/p 沉降阻力:f*(dx/dt) RCF=k+ f*(dx/dt) 差速离心密度梯度离心,操作,离心机分类:普通 6000rpm 高速 20000-25000rpm 超速 30000-80000rpm 平衡 温度-离心力-转速 转头:角转,平转,垂直转,三 凝胶电泳技术,原理,等电点:DNA pI=6.0-7.0 琼脂糖-PAG:支持介质 U=V/E=(d/t)/(v/l) =Q/(6 r),电泳影响因素,1. DNA物理性质 质粒: CCL OC 线形:10M 正比 1/m 2. 介质性质 10U= 10U0-KrT 分离范围:agrose:100bp-60kb PAG:5-500bp 3. 电压:5v/cm 4. 缓冲液:TAE,TBE,TPE,四 核酸定量技术,原理,A= 10(1/T) = abc 浓度:稀溶液(A-0.05-1.0)+ b=1cm DNA:1OD260=0.05ug/ul RNA:1OD260=0.04ug/ul dsDNA:1OD260=0.033ug/ul 纯度:OD260/OD280=1.6-1.8,五 分子杂交技术,六 序列分析技术,作业,1. 市售苯酚为什么要饱和与重蒸? 2. 离心操作应该注意哪些问题? 3. 如果要分离470bp和5kb DNA 应该选择什么凝胶? 4. 在核DNA定量时,取10uL DNA待测液,用TE buffer 稀释到100uL 后,加入到0.5cm的石英比色皿中。OD260测定为0.21,问DNA待测液的浓度是多少? 5. 简述DNA序列分析的基本原理。,任 务,采
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