【医学ppt课件】实验一 哺乳动物细胞的培养、冻存和融合

实验一 哺乳动物细胞的培养、冻存和融合,一、实验目的,1、掌握细胞培养过程中的无菌操作的基本要求，掌握哺乳动物细胞原代培养的基本程序。 2、熟练原代培养细胞的代培养和观察方法。 3、掌握细胞冻存的方法，熟练进行细胞冻存与复苏操作。 4、了解细胞融合的基本原理，掌握PEG诱导细胞融合的基本技术。,二、实验材料、试剂与器材,1、材料：胎鼠或新生小鼠；公鸡静脉血。 2、试剂：1640培养基（含10%小牛血清）；0.25%胰蛋白酶；0.85%生理盐水；Hanks液；碘酒；酒精；DMSO；Alsever溶液；GKN溶液；50%PEG溶液；双蒸水等。 3、器材：CO2培养箱；培养瓶；青霉素瓶；小玻璃漏斗；平皿；吸管；移液管；纱布；手术器械；血球计数板；离心机；水浴箱；倒置显微镜；培养箱；超净工作台；冰箱；液氮罐；冻存管；注射器；微量加样器等。,三、实验原理,动物细胞的原代培养也称初代培养，是直接从动物体得到组织细胞后在体外进行的首次培养。从动物体内取出所需的组织，经酶消化处理，使分散成单个游离的细胞，在人工条件下培养，使其不断地生长繁殖。 原代培养是建立各种细胞系的第一步。虽然原代培养是获取细胞的主要手段，但原代培养的组织由多种细胞成分组成，比较复杂。即使生长出同一类型细胞如成纤维细胞或上皮样细胞，细胞间也有很大差异。原代培养的最基本和常用的有两种方法：组织块培养法和消化培养法。,细胞在培养瓶长成致密单层后，为使细胞能继续生长，数量扩增，就必须进行传代培养，也是一种将细胞种保存下去的方法。悬浮型细胞可直接分瓶，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 为避免培养细胞的污染和老化，可将各类细胞或细胞系低温长期保存。直接冻存的条件下，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能引起细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，最终导致细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。目前常用的冷冻保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。,目前一般采用缓慢冷冻-快速复苏的方法。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在-130以下的低温中能减少冰晶的形成。细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的-50，细胞仍能生长，活力受损不大。 在诱导物（如仙台病毒，聚乙二醇）作用下，相互靠近的细胞发生凝集，随后在质膜接触处发生质膜成份的一系列变化，主要是某些化学键的断裂与重排，进而细胞质沟通，形成一个大的双核或多核细胞（称多核体或异核体）。,（一）小鼠原代细胞培养,【实验步骤】 1、组织块培养法： （1）取材：将妊娠1014天的母鼠用拉颈椎方法处死，然后将其整个浸入盛有75%乙醇的烧杯中5秒，取出后放入已经消毒的肾形解剖盘中，用普通手术剪、手术镊在动物躯干中部环形切开皮肤，并将两侧皮肤分别拉向头尾把动物反包，暴露躯干。用眼科剪、眼科镊切来动物腹肌和腹膜，并取出含有胎儿的两侧子宫放入60cm培养皿中，剖开子宫体，取出胎儿，在Hanks液内洗去血液、羊水、胎膜等杂物后放入另一培养皿。,（2）剪切：去除胎儿头、尾及内脏，只留下胎儿四肢及躯干部分，在Hanks液内洗23次去除血污后，放入60mm培养皿或青霉素小瓶内，用眼科剪将小鼠胎儿剪成1mm3的小块。 （3）接种：用剪去尖头的枪头吸取若干小组织块，置于培养瓶中，均匀地铺展在培养瓶底部，调整小块之间的相互距离，每25ml培养瓶可接种2030小块。 （4）粘附培养：组织块布置好之后，稍微倾斜培养瓶，使瓶内的液体倾至培养瓶的一角，吸出瓶中的培养液，轻轻地将培养瓶翻转，让接种组织块的瓶底面向上。盖好瓶盖，将培养瓶放置于CO2培养箱内37培养24小时，使组织块粘着在培养瓶底上。,（5）培养：从培养箱中取出培养瓶，开盖，瓶底朝上，从瓶底角部加入1ml DMEM+10%20%FBS+抗生素的培养液，然后缓慢翻转培养瓶，让培养液覆盖附着于瓶底的组织块，放置培养箱中培养，待细胞从组织块游出数量较多时，再补加培养液至约3ml。注意培养过程中需拧松培养瓶盖，以利空气通过。 在翻转培养瓶和加液过程中，动作一定要慢，勿使组织块受到冲击漂浮起来。若组织块不易贴壁，可预先在瓶壁涂上薄层、胎汁或鼠尾胶原等。 组织块培养也可以不用翻转，即在接种组织块后，向瓶内仅加入少量的培养液，以能保证组织块湿润即可，放入培养箱内24小时再补加培养液。,2、消化培养法： （1）取材与剪切：同组织块培养法。 （2）消化：将剪切后的组织小块移到10ml离心管内，加2ml的0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA组成的消化液，室温下消化520min，期间吹打数次，并随时吸取少量的消化液在显微镜下观察，如发现组织已分散成细胞团或单个细胞，则立即加入8ml含5%FBS的Hanks液终止消化。 （3）用吸管反复吹打组织块，分散单细胞，用100m不锈钢网筛过滤，收取滤出液，1000r/min离心10min，弃上清。 （4）用2ml DMEM+10%FBS培养液悬浮细胞，计数并稀释细胞浓度至（15）106/ml，每个培养瓶加细胞悬液2.5ml，使细胞数1105/cm2。置CO2培养箱，37、5%CO2、饱和湿度下静置培养，24小时后，更换新培养液，此后每3天换液1次 。,组织块培养游离出单个细胞100,成纤维细胞汇合呈旋涡状100,【实验结果与分析 】 1、观察和记录原代细胞的形态、培养细胞的贴壁时间、增殖时间、完全汇合时间。 2、比较组织块培养法和消化培养法获得原代培养物的效果和优缺点。 【思考题】 1、观察原代培养细胞中的细胞类型，并根据以往的知识初步分析哪些细胞属于成纤维细胞，哪些属于上皮样细胞？ 2、如何提高原代细胞培养的成功率？,（二）动物细胞传代培养,【实验步骤】 1将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2加入0.5-1ml 0.25胰蛋白酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰蛋白酶弃去，加入10ml培养液终止消化（观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3min）。 4用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，置37下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。,【实验结果与分析】 试述传代培养的步骤和注意事项，并指出哪些是关键步骤。 【思考题】 1细胞传代培养的目的是什么？ 2判断细胞健康的标准是什么？ 3如何估计是否传代和传代的方式？,（三）细胞的冻存和复苏,【实验步骤】 1冻存 消化细胞（同实验二），将细胞悬液收集至离心管中。 1000rpm离心10min，弃上清液。 沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5106/ml左右。 将悬液分装至冻存管中，每管1 ml。将冻存管口封严。 在冻存管壁上做好记录。写明细胞种类，冻存日期。 封好的冻存管即可直接冻存。 按下列顺序降温：室温4（20min冰箱冷冻室（30min）低温冰箱（-30 1h）气态氮（30min）液氮。,2复苏 从液氮中取出冻存管、迅速置于37温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1min之内融化。 打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。 1000rpm离心10min，弃去上清液。 沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10min，弃上清液。 加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，37培养，第二天观察生长情况。,【实验结果与分析】 列出细胞冻存与复苏的详细过程，并注明各过程应注意的事项。 【思考题】 1细胞冻存与复苏的基本原则是什么？ 2冻存液的作用是什么？,（四）动物细胞融合,【实验步骤】 1在公鸡翼下静脉抽取2 ml鸡血，加入盛有8 ml的Alsver液中，使血液与Alsver液的比例达1：4，混均后可在冰箱中存放一周。 2取此贮存鸡血1ml加入4ml 0.85%生理盐水，充分混均，800rpm离心3min，弃去上清，重复上述条件离心两次。最后弃去上清，加GKN液4ml，离去。 3弃去上清，加GKN液，制成10%细胞悬液。 4取上述细胞悬液以血球计数器计数，用GKN液将其调整为1106个/ ml。 5取以上细胞悬液1 ml于离心管，放入37水浴中预热。同时将50%PEG液一并预热20min。,620min后将0.5ml 50%PEG溶液逐滴沿离心管壁加入到1 ml细胞悬液中，边加边摇匀，然后放入37水浴中保温20min。 720 min后，加入GKN溶液至8ml，静止于水浴中20 min左右。 8800rpm离心3min，弃去上清，加GKN溶液再离心1次。 9弃去