降钙素基因相关肽衍生物的优化表达及纯化.doc

降钙素基因相关肽衍生物的优化表达及纯化 作者：肖莉杰 林平 陈文 姜颖 刘紫君 于晓光【摘要】 目的 优化重组降钙素基因相关肽衍生物(CGRPVY)蛋白的表达体系，并利用亲和层析获得高纯度的重组蛋白。方法 在前期研究的基础上，将构建的pET32a(+)rhCGRPVY在大肠埃希菌中表达，分别对时间、温度和IPTG的浓度进行优化。采用NiNTA亲和层析柱分离纯化可溶性蛋白，YLN凝胶影像分析系统和Bradford法检测纯化蛋白的纯度与含量。结果 重组蛋白的最佳表达条件为诱导时间4 h、诱导温度37、IPTG浓度0.75 mmol/L，重组蛋白的最高表达量占菌体总蛋白的70%80%，高效表达的CGRPVY融合蛋白大部分可溶，纯化后蛋白纯度可达90%以上，蛋白浓度约为0.09 mg/ml。结论 成功优化了蛋白表达条件，并用亲和层析法纯化出大量可溶性TrxArhCGRPVY。 【关键词】 降钙素基因相关肽衍生物;VY;优化;纯化【Abstract】 Objective To optimize the expression level of engineering strain of calcitonin generelated peptide derivant(CGRPVY), then use affinity chromatograph to obtain recombinant protein of high purity. Methods Based on the groundwork of former research, an expression vector pET32a(+)rhCGRPVY which was constructed by this group was used to express TrxArhCGRPVY in E coli. Expression of TrxArhCGRPVY was optimized on the induction time, temperature, and the concentration of IPTG respectively. The soluble fusion protein was purified by NiNTA chromatography column and its purity and content were detected by YLN2000 gel image analysis and Bradford assay. Results The optimized expression condition of TrxArhCGRPVY was obtained which was 4 h of induction, 37 of incubation, 1.0 mmol/L IPTG of final concentration. Expression conditions was optimized, the maximum yield of fusion protein was about 70% 80% of the total mass of bacterial proteins. The purity reached at least 90% and about 0.09 mg/ml protein was acquired. Conclusions To optimize the expression condition of TrxArhCGRPVY in E coli successfully and obtain soluble TrxArhCGRPVY by affinity chromatograph.【Key words】 CGRPVY ;VY;Optimization;Purification降钙素基因相关肽(calcitonin generelated peptide alpha，CGRP)是迄今所知体内较强的扩张血管的多肽成分，具有舒张血管、降低血压等生理功能，同时兼有治疗心衰和增强心输出量的作用。降血压肽(Angiotensinconverting enzyme inhibitory peptides，ACEIP)是一类能够降低人体血压的小分子多肽的总称，是血管紧张素转化酶(Angiotensinconverting enzyme，ACE)的抑制剂，可通过抑制人体血管紧张素的生成而达到降低血压的目的1。其突出优点是对高血压患者具有降血压作用，而对血压正常的人无降压作用，降压作用持久、无副作用2，3。二肽VY(ValTyr)是从清酒中提取的降血压肽，在体内具有降血压功能4，且无毒副作用。本室已成功构建CGRP衍生物(CGRPVY)的基因工程菌株，并进行了体外表达及粗提物对蟾蜍肠系膜微循环的扩血管活性检测，证实CGRPVY菌株粗提物具有扩血管活性，且活性高于CGRP的菌株粗提物5。本研究进一步探索重组质粒pET32a(+)CGRPVY在大肠埃希菌中的表达特点，以获得可溶性重组CGRPVY 融合蛋白(TrxA recombinant human CGRPVY 即：TrxArhCGRPVY )的最佳表达和纯化条件，以期纯化出大量的TrxA rhCGRPVY，为以CGRPVY为主要成分的降血压药物的开发性研究做必要的实验准备。1 材料与方法1.1 材料 菌株和质粒：大肠埃希菌BL21trxB(DE3)pLysS和pET32a(+)质粒载体为Novagen公司产品。重组菌株pET32a(+)CGRPVY由哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学教研室保存。主要试剂：异丙基D硫代半乳糖苷酶(IPTG)等购自Promega公司，BugBuster NiNTA His.Bind 纯化试剂盒为Novagen公司产品。1.2 方法1.2.1 可溶性TrxArhCGRPVY的诱导表达及条件优化 按照单因子顺序进行，每项优化结果用于后续实验。首先挑选鉴定正确的单菌落接入牛肉膏蛋白胨(LB)培养基中过夜培养，获得的菌液按照2%接种量接入含有氨苄青霉素和葡萄糖的LB培养基，用作培养条件的研究。1.2.1.1 诱导时间对表达产量的影响 LB培养基接种液在37继续培养至OD600=0.60.8，加入IPTG至终浓度1.0 mmol/L，37 诱导培养1、2、3、4、 5、6 h，收获细菌，15%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)分析。1.2.1.2 温度对表达产量的影响 LB培养基接种液在37继续培养至OD600=0.6 0.8，按照已经优化的诱导时间，加入IPTG至终浓度1.0 mmol/L，在45、40、37、32、27不同条件诱导培养，收获菌体，15% SDSPAGE分析。1.2.1.3 IPTG浓度对表达产量的影响 LB培养基接种液在已经优化的诱导温度下继续培养至OD600=0.60.8，加入终浓度为 0.25 mmol/L、 0.50 mmol/L、0.75 mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L IPTG，按照已经优化的诱导温度诱导培养，诱导时间按照上步优化结果，收获细菌，15% SDSPAGE分析。1.2.2 可溶性TrxArhCGRPVY的纯化 按上一步找出的最佳表达条件，用100 ml含氨苄青霉素(50 mg/L)的LB 液体培养基增菌后，收集菌体利用BugBuster NiNTA His.Bind 纯化试剂盒中提供的裂解液裂解菌体，离心后分别将上清和沉淀进行15%SDSPAGE电泳检测。由于表达蛋白的N端融合了6个组氨酸，故可将菌体裂解液上清用NiNTA琼脂糖树脂亲和层析进行纯化(具体方法参照其说明书)，纯化后，15% SDSPAGE电泳检测，采用考马斯亮蓝(Bradford)法经核酸蛋白检测仪进行蛋白浓度测定。2 结 果2.1 可溶性TrxA rhCGRPVY诱导表达条件的优化2.1.1 诱导时间对表达量的影响 随诱导时间的延长TrxArhCGRPVY的表达量升高，但增加诱导时间表达量增高不明显，因此，IPTG的适宜诱导时间为4 h。见图1。图1 诱导时间对蛋白表达量的影响2.1.2 诱导温度对表达量的影响 在37诱导时TrxArhCGRPVY的表达量最高，高于或低于37表达量均下降。见图2。2.1.3 诱导剂IPTG浓度的影响 随诱导剂IPTG浓度的升高，蛋白表达量增加，但浓度高于0.75 mmol/L时表达量增加不明显，因此，可选0.75 mmol/L的IPTG浓度作为最佳诱导剂浓度。见图3。2.2 可溶性TrxA rhCGRPVY的纯化 融合蛋白TrxA rhCGRPVY主要以可溶性形式存在于菌体裂解液的上清中，经NiNTA琼脂糖柱亲和层析纯化后的洗脱液有一条清晰的约为21.2 kD的特异带;经光度扫描分析，TrxA rhCGRPVY蛋白占细菌总蛋白的30%，纯化后蛋白纯度可达90%以上，蛋白浓度约为0.09 mg/ml。见图4。图2 诱导温度对蛋白表达量的影响泳道1，2，3，4，5的IPTG诱导浓度分别为0.25 mmol/L,0.50 mmol/L，0.75 mmol/L，1.0 mmol/L，1.5 mmol/L图3 IPTG浓度对蛋白表达量的影响泳道1：未被IPTG诱导;泳道26：重组菌诱导条件均为37、IPTG 诱导4 h，3：上清，2,4：沉淀，5，6：层析洗脱液图4 表达产物的SDSPAGE3 讨 论CGRP是由Amara和Rosenfold等于1982年发现的37肽6，因其具有较强的舒张血管、降低血压、激动心肌和抑制血管平滑肌增殖等作用7,与心血管疾病、特别是高血压密切相关。CGRP不仅参与疾病的发生与发展，更可以作为抗高血压物质，具有潜在的临床应用价值。1994年，Saito等人从清酒中分离得到二肽VY，并通过口服给药途径，使得自发性高血压大鼠血压显著下降8。VY是由缬氨酸酪氨酸组成的二肽，目前大多是从沙丁鱼中提取此种活性短肽的混合品加以使用9，但提取过程繁琐，耗时较长，不适于大规模生产10。为了获得降压活性更强的多肽，将VY与CGRP耦联，耦联后不会因肽链太长改变蛋白分子空间构型而影响生物活性。相反，由于降血压肽VY可以抵抗蛋白酶的降解，在体内降压作用持久，因此耦联了VY的CGRP(CGRPVY)，降压幅度有所提高，而副作用没有增加。在构建pET32a(+)rhCGRPVY重组质粒与初步表达及纯化的基础上，本文通过设立培养温度、培养时间及IPTG浓度的梯度实验，成功的摸索出了可溶性的TrxArhCGRPVY最佳表达条件。本研究发现：培养温度、诱导时间及IPTG浓度对可溶性的TrxA rhCGRPVY表达有很大的影响。结果表明，诱导温度37、IPTG浓度0.75 mmol/L和诱导4 h是可溶性TrxA rhCGRPVY的较佳表达条件，经亲和层析可获得高纯度的融合蛋白。本研究为以rhCGRP为主要成分的降血压药物的开发性研究工作奠定了实验基础。【参考文献】 1 Fujita H，Yokoyama K，Yoshikawa M.Classification and antihypertensive activity of angiotensin Iconverting enzyme inhibitory peptides derived from food proteinsJ.J Food Sci，2000;65(4)：5649.2 Pentzien AK，Meisel H.Transepithelial transport and stability in blood serum of angiotensinIconverting enzyme inhibitory dipeptidesJ.Z Naturforsch C，2008;63(56):4519.3 Wu J，Ding X.Hypertensive and physiological effect of angiotensin converting enzyme inhibitory peptides derived from soy protein on spontaneously hypertensive ratsJ.J Agric Food Chem，2001;49(1)：5016.4 Matsui T,Tamaya K,Seki E,et al.Absorption of ValTyr with in vitro angiotensin Iconverting enzyme inhibitory activity into the circulating blood system of mild hypertensive subjectsJ.Biol Pharmacol Bull，2002;25(9):122830.5 林 平，邹海峰,于 靖,等.降钙素基因相关肽衍生物克隆表达与活性鉴定J.中国老年学杂志,2008;28(18)：17902.6 Rosenfeld MG，Mermod JJ，Amara