血管钠肽抑制低氧刺激心成纤维细胞c┐fos的表达.doc

血管钠肽抑制低氧刺激心成纤维细胞cfos的表达作者：郭海涛朱妙章吕顺艳于军董明清高瞻施溥涛 【关键词】,血管钠肽 关键词:血管钠肽;低氧;心成纤维细胞;c-fos;Ca2+ 摘要:目的研究血管钠肽（VNP）对低氧作用时心成纤维细胞增殖的影响，并对其机制进行探讨.方法分离纯化乳鼠心成纤维细胞，随机分为4组:对照组、低氧组（2030mL・L-1）、VNP组（10-810-6mol・L -1）和VNP（10-6mol・L-1）+低氧组.以免疫组织化学染色方法观察各组c-Fos的表达情况，采用激光共聚焦方法测定了Ca2+i水平.结果低氧组较对照组可以显著升高Fos样免疫阳性细胞数及染色强度（P<0.05）;VNP预处理心成纤维细胞可以减弱低氧的作用（P<0.05vs低氧组），但Fos的表达量仍高于对照组（P<0.05）;对照组Ca2+i水平无显著变化，低氧组Ca2+i水平显著升高，而VNP能使升高的Ca 2+i水平较对照组和低氧组显著降低（P<0.05）.结论VNP能减弱低氧对心成纤维细胞生长的刺激作用，其机制可能与Ca2+等信号转导分子及c-fos表达有关. Keywords:vasonatrinpeptide;hypoxia;cardiacfibroblasts;c-fos;Ca2+ Abstract:Chiefaimofthepresentworkwastoinvestigatevasonatrinpeptide（VNP）attenuateshypoxia-inducedexpressionofc-fosgeneincardiacfibroblastsfromculturedneonatalrats.Theculturedcardiacfibroblastsweredividedrandomlyintofourgroups:Controlgroup，hyoxiagroup（2030mL・L-1），VNPgroup（10-810-6mol・L-1）andVNP（10-6mol・L-1）+hypoxiagroup.Thec-Fosexpres-sionofcardiacfibroblastswasmeasuredbythemeansofim-munocytochemistry，Ca 2+iconcentrationwasmeasuredbythemeansofinteractivelasercytometer.Thestudiesper-formedwiththesetechniquesshowthathypoxiaincreasedsignificantlythepositivecellsandmeangreyofcardiacfi-broblasts（P<0.05vscontrolgroup），VNPdecreasedthepositivecells（P<0.05vscontrolgroup）anddecreasedthelevelofCa2+iinVNP+hypoxiagroup.Thesefindingsindi-catethatVNPcanattenuatehypoxia-inducedexpressionofc-fosgeneincardiacfibroblastswhichwasassociatedwiththechangesoftheCa2+i. 0引言 低氧性心室肌肥厚是高原性心脏病的主要表现之一，而心室肌肥厚的原因除了心肌细胞的肥大外，心肌间质细胞的增殖、间质纤维化也是重要的原因，而且心成纤维细胞分泌许多生长因子，通过旁分泌途径影响心肌细胞的增殖.因此，了解影响心成纤维细胞增殖和基因表达的因子非常必要.钠尿肽是一多肽家族，具有利钠利尿以及抑制心肌肥厚的作用.ANP（心房钠尿肽）可抑制低氧引起的心成纤维细胞的增殖1，VNP（血管钠肽）是ANP和C-型钠尿肽（CNP）的嵌合体，可能与ANP有相似的药理效应2，3.低氧可引起心成纤维细胞增殖，细胞内钙增多，以及c-Fos表达增高4.关于VNP对c-fos表达的调控，目前国内外尚无报道.我们观察VNP是否减弱低氧刺激的心成纤维细胞增殖，及其是否影响c-fos表达以及机制. 1材料和方法 1.1材料SD乳鼠（12d）由本校实验动物中心提供，胰酶购于DIFCO公司，胶原酶、EDTA，DMEM培养基、小牛血清购于Gibco公司，VNP由中国科学院上海生物化学研究所提供，BrdU（5-溴-2-脱氧尿苷）购于Sigma公司，c-Fos抗体购于SantaCruz公司，ABC试剂盒购于博士德公司，LE-ICAO500MC图像分析仪购于德国Leica公司. 1.2方法 1.2.1主要药物配制VNP:用生理盐水配成10-3mol・L-1的原液，4保存，实验前用DMEM培养基稀释成工作液.DMEM培养基:按说明书配置，用0.1mol・L-1的盐酸调pH至7.27.4，4保存备用.小牛血清:56灭活30min，-20保存.胰蛋白酶:用生理盐水配成2.5g・L-1的溶液，4保存备用.EDTA:用生理盐水配成0.4g・L -1的溶液，4保存备用.胶原酶:用生理盐水配成1.5g・L-1的溶液，4保存备用. 1.2.2心成纤维细胞培养无菌条件下取出乳鼠的心脏，剪碎，以1.25g・L-1胰蛋白酶及0.75g・L-1的胶原酶消化成单细胞悬液，离心（1000r・min-1，5min），用含0.1mmol・L-1BrdU及100mL・L-1灭活小牛血清的DMEM培养基重新悬浮，贴壁90min后将悬浮细胞吸弃，加入含100mL・L-1灭活小牛血清的DMEM培养基传代至24代时，将心成纤维细胞以5107L-1接种于24孔培养板（预置10mm10mm的盖玻片，用于免疫组化染色）或100mL的玻璃培养瓶（用于传代），或以1107L-1，每皿0.3mL接种于培养皿之后，移入37，50mL・L -1CO2培养箱中培养.若细胞贴壁并已伸展但未汇合（sub-confluent），用台盼蓝拒染法检查活细胞数大于 95%，继续以后实验. 1.2.3细胞低氧培养方法将接种于培养瓶或培养板的细胞放置于一体积约7L的真空干燥瓶中，通入950mL・L-1N2和50mL・L-1CO2的混合气体，以2L・min-1，通气12min，使真空干燥瓶中气体浓度达到2030mL・L-1O2和50mL・L-1CO2，并可持续24h. 1.2.4免疫组织化学染色药物及2030mL・L-1O2低氧作用2h后，以40g・L-1的多聚甲醛固定（4，20min），然后以15g・L-1的正常羊血清孵育30min以封闭组织中的抗体非特异性结合位点.将2g・L-1BSA/0.5g・L-1NaN3/PBS稀释的FOS抗体（11000）加至玻片上，4孵育48h，再依次在生物素化抗IgG（1400）和ABC液（1200）中分别孵育2.5h（25）.最后用硫酸镍铵葡萄糖氧化酶法呈色，脱水透明后封片.实验中同时设立空白和替代对照实验. 1.2.5MTT比色法将心成纤维细胞以5107L-1每孔100L种至96孔板，24h后换为各种浓度的药物，每组为8个复孔.置于低氧或常氧24h，以5g・L-1，每孔20L，加入MTT.4h后吸弃液体，以每孔150L加入DMSO，轻轻震荡10min，用酶联免疫分析仪测A490nm值. 1.2.6Ca2+i的测定将心成纤维细胞以1107L-1每皿0.3mL种至中心有孔的培养皿上.待细胞贴壁后，用台氏液洗涤细胞2次，于37，闭光条件下用furo-3/AM（10mol・L-1）荷载，50min后用台氏液洗涤3次，洗去残余染料.用共聚焦显微镜动态扫描细胞内Ca2+i荧光强度变化. 1.2.7数据处理及统计学分析免疫组化结果用LEICAO500MC图像分析系统对细胞数及染色强度进行定量分析.采用双盲法，输入方式为普通光源照明，显微镜放大倍数400倍，固定输入条件后，在高分辨率图像监视器上每张玻片随机抽取5个视野，测定每个视野的阳性细胞百分数及阳性物质的平均灰度（meangrey），测量单位为AU（arbitrayunit）.计算其均值，再求出每组的平均值.数据以xs表示，两组间比较采用t检验;多组间比较采用方差分析及两两显著性检验. 2结果 2.1VNP对低氧刺激的心成纤维细胞增殖的影响培养板放入低氧环境后，心肌细胞的A490nm值增加.VNP可以降低低氧刺激的心成纤维细胞A490nm值，VNP降低此作用，且呈剂量依赖性（Tab1）. 表1血管钠肽对低氧刺激心成纤维细胞MTT光吸收值的影响略 2.2VNP对低氧诱导的FOS样免疫反应阳性细胞数目的影响对照组（常氧和不加VNP）有少量细胞呈弱阳性表达（Fig1A）低氧组的FOS样免疫反应阳性心成纤维细胞占（84.67.8）%，染色强度为（20412）AU（P<0.05vs对照组），阳性产物主要存在于细胞核中，呈椭圆形或圆形，紫黑色，可见不着色的核仁区（Fig1B）.单独用VNP（10-6mol・L-1）处理，对心肌细胞FOS蛋白表达无显著影响.以VNP（10-6mol・L-1）预处理30min，可减弱低氧增强FOS蛋白表达的作用，FOS样免疫反应阳性心成纤维细胞占（76.17.1）%，染色强度为（18410）AU（P<0.05vs低氧组），但FOS蛋白的表达仍高于对照组的基础水平（P<0.05，Fig1C）. 图1乳鼠心成纤维细胞的Fos染色略 2.3VNP对心肌细胞内Ca2+水平的影响低氧使心成纤维Ca2+i相对水平显著升高，VNP可使低氧时显著升高的Ca2+i相对水平降低.对照组Ca2+i相对水平为（2.300.21）U，低氧组Ca2+相对水平为（4.450.36）U，VNP组Ca2+i水平为（2.960.11）U，显著低于低氧组（P<0.05，Fig2）. 图2略 3讨论 c-fos属于即刻早期反应基因（IERG），即刻早期反应基因是细胞在受刺激后短时间内发生反应的基因家族.此类基因表达的蛋白可与DNA结合，影响细胞的分化、增殖和凋亡等功能.另外，即刻早期反应基因也说明细胞对环境刺激的适应性反应1. 低氧时呼吸链中的酶降低及细胞内氧化还原反应发生改变.低氧条件下是通过血清反应序列（SRE）引起c-fos的转录活性的激活.而丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）在低氧条件下激活.因此，低氧时细胞内呼吸链中酶水平的降低是通过MAPK途径引起c-fos表达增加5.c-fos的产物Fos单独不能与DNA结合，它可与Jun通过亮氨酸拉链形成Fos/Jun二聚体，即有活性的AP-1.AP-1通过顺式作用，激活与细胞生长有关的基因，由于Fos将细胞外传来的信号与细胞核内的基因活动联系起来，因而称为第三信使6.正常情况下，c-fos基因在造血组织以外的大多数其他类型的细胞仅有低水平表达，但儿茶酚胺、生长因子、应急等多种因素可使这些组织表达增加7.它的激活不依赖于新蛋白的合成，而是由于已存在蛋白质的修饰，这种修饰主要通过第二信使介导.c-fos基因上游的顺式作用元件构成其转录的调控单位.其中最重要的是SRE和血小板源生长因子（c-sis）诱导序列，SRE的调控中心由血清反应因子（SRF）占据，SRF是一个二聚体蛋白，在它旁边还有多种蛋白与SRE的其他区域结合，其中较为重要的是胞核原癌蛋白ETS中的EIK-1，EIK-1的作用依赖于SRE与SRF的结合.SRF和EIK-1均是MAPK的靶分子，存在于细胞内的Raf-MAPK激酶-MAPK-核糖体S6激酶网络通过MAPK从胞质到胞核的易位与核内c-fos发生联系，MAPK在核内累积达到峰值，此时正是c-fos转录的峰值8. 增加细胞内Ca2+可能是参与低氧引起c-fos表达的一种第二信使9.ANP可增加低氧时培养的细胞内cGMP含量，降低Ca2+内流并具有浓度及时间依赖性.ANP调控Ca2+通道直接通过百日咳毒素敏感性G蛋白，经过cGMP和通过百日咳毒素不敏感性G蛋白的不依赖cGMP的Ca2+通道，来减弱低氧对细胞的刺激作用10.VNP是ANP和C-型钠尿肽（CNP）的嵌合体，可能与ANP有相似的药理效应2，3.应用VNP能够减弱低氧诱导的c-fos表达，在两栖类动物的细胞中，L型Ca2+通道的抑制与激活磷酸二酯酶导致的cAMP水平降低有关.在哺乳动物细胞中，cGMP抑制Ca2+流的效应不依赖于cAMP水平的变化，而是直接作用于L型Ca2+通道11.VNP可能通过升高心成纤维细胞内cGMP水平直接抑制Ca2+通道，拮抗低氧对Ca2+通道的激活作用，使心成纤维细胞内Ca 2+浓度降低，使c-fos基因转录活性下降.即VNP减弱低氧刺激心成纤维细胞c-fos表达的机制在于二者对心成纤维细胞Ca2+通道的效应是互相拮抗的，并且VNP的这种效应是通过cGMP水平的变化实现的. 参考文献: 1TamamoriM，ItoH，HiroeM，MarumoF，HataRI.Stimula-tionofcollagensynthesisinratcardiacfibroblastsbyexposuretohypoxiccultureconditionsandsuppressionoftheeffectbyna-triureticpeptidesJ.CellBiolInt，1997;21（3）:175-180. 2FengHS，ZangYM，ZhuMZ，PeiJM，WangYM，NiuGM，WangL，ShiPT.VasorelaxingeffectofvasonatrinpeptideonpumonaryarteryinratsJ.XinGongnengZazhi（ChinJCardFun），1998;10（2）:69-71. 3WeiCM，KimCH，MillerVM，BurnettJCJr.Auniquesyn-theticnatriureticandvasorelaxingpeptideJ.JClinInvest，1993;92（4）:2048-2052. 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