Beutler改良法测定组织GSH操作规程.DOC

Beutler改良法测定组织GSH操作规程一、 原理及意义原理：DTNB能被-SH基团还原，产生等克分子的2-硝基-5-巯基苯甲酸，而苯甲酸阴离子在一定PH值条件下呈黄色，在412 nm波长下有吸收峰。意义：还原型谷胱甘肽（glutathione, GSH）是一种低分子自由基清除剂，它可清除O2 、H2O2、LOOH。GSH是蛋氨酸、甘氨酸和半胱氨酸组成的一种小分子肽，是组织中主要的非蛋白质的巯基化合物，并且是谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）和谷胱甘肽硫转移酶（GST）两种酶类的底物，为这二种酶分解氢过氧化物所必需，能稳定含巯基的酶和防止血红蛋白及其它辅因子受氧化损伤，最近还证明GSH也参与使Vit E恢复到还原态的作用。GSH测定值的高低可间接反映机体发生氧化损伤的程度。二、 器材可见光分光计、7 ml离心管和管架、加样器和枪头三、 试剂 1 mmol/L的GSH（标准品）； 1柠檬酸钠； 二硫双基苯甲酸（dithio-bis-nitrobenzoicacid, DTNB）试剂：用1柠檬酸钠配成终浓度0.04（w/v）； 20三氯醋酸； 0.3 mol/L磷酸氢二钠（Na2HPO4）缓冲液。四、 步骤1、样品处理及试验步骤（下面以肝脏组织为例）称取一定量的肝脏组织于冰冷0.85生理盐水中漂洗，滤纸吸干表面水分，烧杯内剪碎 制备20%组织匀浆液（须用0.85生理盐水或三蒸水） 4000 g离心10 min后取上清液 按上清液:20三氯醋酸（体积比）为2:1混合（加TCA前留取20 l上清液用于Lowry法测蛋白） 混匀，4000 g离心10 min（此步离心要充分，可适当提高离心力） 收集上清液按表2测定。2、按下表1绘制标准曲线（单位：ml）表1 GSH标准曲线的测定GSH（mol/L）010203040501 mmol/L的GSH00.050.10.150.20.25三蒸水0.50.450.40.350.30.25磷酸盐缓冲液4.04.04.04.04.04.0DTNB试剂0.50.50.50.50.50.5混匀，5 min内于412nm比色，以三蒸水调零，以标准GSH浓度为X轴，相应吸光值为Y轴，绘制标准曲线，并求回归方程。3、按下表2操作测定样品GSH（单位：ml）表2 Beutler改良法样品测定操作试 剂测定管空白管待测样品液0.10磷酸盐缓冲液4.44.4DTNB试剂0.50.5三蒸水00.1测得的吸光值代入回归方程，可计算出样品液的GSH浓度。五、 实验结果1、标准曲线结果GSH浓度（mol）00.050.10.150.20.25A值0.0000.1260.2600.3940.5290.666根据上数据测得标准曲线方程为：X(mol)=0.3744898 Y+0.0017227（其中Y为吸光值，标准曲线看Figure 1）Figure 1 GSH标准曲线图六、 注意事项 样品应冰上匀浆，所有步骤尽量保证低温下操作，否则结果偏低； 所有用水均需三蒸水，否则结果偏低； 未经蛋白变性处理的样品在20不宜存放； 反应管内最终PH值必须保证在8.09.0间，否则结果不稳定； 配好的DTNB应在有限期内使用（4下可存1个月）； GS