法医dna分型技术前沿

,法医DNA分型技术前沿,,,SNP技术,随着人类基因组测序工作的完成,单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)的筛选及其检测正成为研究者们广泛关注的焦点一个SNP 的含义是给定的一个群体中超过1%的个体在给定的遗传区域内发生一次核苷酸改变不包括其它遗传变化比如插入和缺失重复序列拷贝的变化等SNP 被认为是一个物种中不同个体表型的主要遗传来源。,,以PCR 为基础的方法,1 单管双向等位基因专一性扩增 2 单核苷酸引物延伸分析 (SNPE) 3 特异等位基因PCR,,2.以杂交荧光检测为基础的方法,2.1 等位基因特异寡核苷酸片段分析(allele-specific oligonucleotide, ASO) 2.2 焦磷酸荧光法 2.3 Taqman 技术的原理 2.4 双色荧光偏振技术(invader assay with dual-color fluorescence polarization detection) 2.5 芯片分析,,3 . M A L D I - T O F 质谱分析,适当大小的有机分子晶体(介质)用接近其吸收光谱的激光瞬时激发,会发生能量转移及解吸附过程如将低浓度的蛋白质或核酸分子加入介质溶液中并加以干燥,蛋白质或核酸分子将嵌入到介质晶体中将该晶体放入质谱仪的真空小室,用瞬时(纳秒)强激光激发,晶体中的蛋白质或核酸分子就会解吸附,转变成气相的离子态,此时可通过质谱分析这些离子。,MALDI-TOFMS分析核酸的优点,(1) 速度快,核酸分子的离子化分离及检测仅在几毫秒内完成; (2) 分析结果的绝对性,质谱对核酸分子的分离仅与其自身的质量/电荷( m/z )有关,而传统的电泳或杂交方法易受核酸二级结构的影响； (3) 自动化操作,从样品制备到数据的采集加工都可自动化完成适合大规模筛查,有广泛用于检测已知和未知SNP及基因分型和定位研究的前景。,,基因芯片技术,基因芯片技术是90年代中期以来影响最为深远的重大科技进展之一，是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。 DNA芯片（DNA chip）技术是将大量寡核苷酸探针固定于硅片、玻片、聚丙烯或尼龙膜等固相支持物上制成芯片，与标记的样品DNA进行杂交，通过杂交信号强度而获取样品的信息。该技术应用广泛，具有高通量、高信息量的特性。在个体识别方面，STR芯片、SNPs芯片是研究的热点，一旦得到运用，将可使法医学检验更为便捷、准确、高效。,,STR芯片的研制在当前具有重要意义，它可与目前DNA数据库中的遗传标志系统完全兼容，一旦用于检案和建库，将显示出下列优势：技术操作简便，自动化程序高，检测效率高，应用范围广，检测成本低。相比之下，法医SNPs芯片代表法医DNA分析的前沿技术手段，将使个体识别技术迈入新的高度和领域。 法医DNA芯片的研究属特殊领域，它是通过在芯片上对一系列多态性位点进行检测，准确无误地完成生物学检材或身份不明者的个体识别。尽管目前国内外尚无成熟的法医DNA芯片推向市场，但现有科研成果使得法医学家对芯片在法医学上的应用前景充满信心。据Schmalzing报道，可在45秒谟?2.6cm长的芯片泳道上对STR基因座的等位基因进行快速分离。另外，96道毛细管阵列电泳型芯片可使每个样本的基因分型在2秒内完成。借鉴国内外 DNA芯片技术基础，以人类DNA图谱的公布为契机，法医DNA芯片的应用将变为现实。,,基因芯片技术特点 - GeneChip 独特的原位光刻技术，定量分析、重复性好 - GeneChip 独特的PM-MM探针专利设计，有效解决芯片非特异杂交问题，真正提高检测的灵敏度和特异性 - GeneChip 表达谱芯片独特的每一个基因多段25mer探针设计，有效区分同源序列，极大提高检测的特异性和准确性 - GeneChip Genotyping芯片对每个SNP位点进行40次独立的检测，保证检测的准确性 - 单色荧光信号适于多张芯片结果的灵活比较，降低用户成本 - 强大的网上数据分析功能，为后续功能研究提供有力保障,,基因表达谱和基因分型研究的完美技术平台,Affymetrix基因芯片操作平台1套系统，便可完成多物种的表达谱分析、人类SNP分析、高通量测序分析 -专用芯片杂交箱 Hybridization Oven 640 -全自动洗涤工作站 Fluidics Station 450 -高分辨率芯片分析检测系统（GeneChip Scanner 3000）,,基质辅助激光解析电离/飞行时间质谱（MALDITOF）,MALDITOF利用离子进行实际时间的质量测定。 飞行时间质谱具有极高的通量，MALDITOFMS分析可以不使用等位基因分型标准物进行分析，因为此方法分析的是DNA分子的真实质量，使之比电泳中的相对大小测量更准确。 有报道MALDITOF可分析小于150bp的STR等位基因。来自 Gene Trace公司的科学家已经证明STR基因座包括HUMTHO1，FES/FPS，F13A1和CSF1PO可以通过重新设计PCR引物，减小 DNA片段的分子量而供MALDITOF分析。Gene Trace公司的科学家证明MALDITOF分析每天可完成数以千计的单个基因座STR分型。MALDITOF分析法灵敏度高，特异性强，不需凝胶电泳，可以发展为高速检测大量STR的方法。但分析STR的PCR产物还存在一些问题，最大的问题是，只能分析片段较短的DNA分子，当DNA分子或样品盐浓度太大时，MALDITOFMS的分辨率和灵敏度下降。,,变性高压液相色谱法,变性高压液相色谱（DHPLC）是一种高新的高通量的DNA序列多态性分析技术。是用离子对反向高压液相色谱分离检测异源双链。该技术最早由美国stanford大学 Oefner及Underhill等报道的，其原理利用不同的DNA链与色谱柱之间的吸附力差异来分离不同的DNA分子。在两个DNA分子没有长度差异时，如果碱基组成不同，他们与色谱柱的吸附力就有差异，吸附力有差异的DNA分子洗脱时间不同。利用这一原理，可将两个长度一样的DNA分子置高温变性，后置低温复性。若两个DNA分子序列相同，复性后只产生一条双链DNA分子，经色谱分析只产生一个单独的峰；若两个DNA分子序列不同，复性后会产生同源双链（homoduplex）及异源双链（heteroduplex）等不同的DNA分子，这些DNA分子与色谱柱的与色谱柱的吸附力不同，洗脱时间不同，根据DNA片段大小和片断单链的组成顺序 从柱上洗脱下来，以峰的形式被记录下来，第一个峰为掺入的引物峰，然后是引物延伸产物峰，根据峰的个数和对称性，确定基因型。杂合子个体出现二个峰，但在分离度不够的情况下，往往出现肩峰及不对称峰。 该方法的优点是加样和分析的自动化，引物延伸后不需要进行纯化过程，是比较简便的SNP分析方法，而且多个SNP可以复合在一起。 10.DNA芯片技术在法医中的应用,,线粒体DNA测序技术,mtDNA测序采用的原理是Sanger双脱氧终止法。具体的分析方法种类有多种，但大体上的步骤基本一致，包括DNA提取、扩增、测序模板的纯化以及测序反应等等，不同的是标记物及显示序列测定结果的方法。直接测序所采用的标记物有两类，一是经典的测序法采用的放射性同位素标记，另一类为荧光标记，是较新的标记技术，荧光染料受激光激发，释放出特定波长的光谱，依靠自动测序仪检测并记录DNA序列。直接测序法还可以采用银染法，无须标记物，双脱氧核苷酸终止链DNA片段经过电泳分离后直接用银染显带、判读序列。在上述方法中，同位素标记具放射性污染，因为标记物32P半衰期短、操作复杂、检验周期长，实际应用受到一定限制；银染方法灵敏度有限，操作精度要求高，难度较大，不易掌握。因此现在常用荧光标记自动测序技术，它所采用的标记方法有引物标记（dye primer）和末端标记（dye t