香菇多糖的提取方案(毕业论文05142).doc

重庆 毕业设计（论文）题 目 香菇多糖提取工艺的研究 院 系 生命科学与工程学院 专 业 生物技术 年 级 2008级 学生姓名 = 学生学号 指导教师 职称 完成毕业设计（论文）时间 2011 年 5 月目录一 文献综述21香菇多糖及香菇简介22 国内研究现状22.1 原料预处理技术32.2 粉碎技术32.3 超声波技术33存在的问题和发展趋势44 论文的选题与研究内容4二 实验部分51材料与方法51.1 材料51.2 仪器与设备51.3 实验方法51.3.1 苯酚- 硫酸法测定多糖标准曲线的制作51.3.2香菇多糖提取方法的确定51.4 实验步骤61.5 单因子实验71.5.1不同料液比对香菇多糖提取率的影响71.5.2 不同超声时间对香菇多糖提取率的影响81.5.3 不同浸提温度对香菇多糖提取率的影响81.5.4不同浸提时间对香菇多糖提取率的影响91.5.6最后确定每个因素的最佳水 平条件的因素水平见表1。92 结果与分析103讨论124 结论12致谢13参考文献14英文译文15鲜晓洪 香菇多糖提取工艺的研究香菇多糖提取工艺的研究鲜晓洪（重庆三峡学院生命科学与工程学院生物技术专业2008级 重庆万州 40400）摘要 以香菇作为原料，研究香菇中多糖提取得率及其影响因素。 优化影响超声波辅助水浸提法提取香菇多糖的因素, 提高多糖的提取率。设计单因子试验和多因子的正交试验, 研究料液比、超声波处理时间、浸提温度、浸提时间4个因子对香菇多糖提取率的影响。超声波辅助水浸提法提取香菇多糖的最佳条件为: 料液比1：25、超声波处理10 min、100 浸提2. 0 h。在该条件下, 香菇多糖提取率为4. 05%。通过优化提取条件提高了香菇多糖的提取率, 为香菇多糖的开发利用奠定了基础。关键词 超声波；香菇多糖；提取一 文献综述1香菇多糖及香菇简介香菇-植物皇后。香菇，又称香蕈、冬菇，是一种生长在木材上的真菌类。由于它味道鲜美，香气沁人，营养丰富，不但位列草菇、平菇、白蘑菇之上，而且素有“植物皇后”之誉。香菇也是世界第二大食用菌，也是我国特产之一，在民间素有“山珍”之称。它是一种生长在木材上的真菌。味道鲜美，香气沁人，营养丰富，素有“植物皇后”美誉。香菇富含维生素B群、铁、钾、维生素D原（经日晒后转成维生素D）、味甘，性平【1】。主治食欲减退，少气乏力。香菇素有山珍之王之称，是高蛋白、低脂肪的营养保健食品。我国历代医学家对香菇均有著名论述。现代医学和营养学不断深入研究，香菇的药用价值也不断被发掘。香菇中麦角甾醇含量很高，对防治佝偻病有效；香菇多糖（1，3葡聚糖）能增强细胞免疫能力，从而抑制癌细胞的生长；香菇含有六大酶类的40多种酶，可以纠正人体酶缺乏症；香菇中的脂肪所含脂肪酸，对人体降低血脂有益。香菇多糖是从香菇中分离纯化的一种葡聚糖，从香菇(Lentinus edodes)子实体或菌丝中分离的一种多糖，以-1,3葡聚糖为主，有免疫激活和抗肿瘤活性；是以增强T细胞和巨噬细胞功能为主的免疫增强剂，与化疗或放疗联用可发挥增效减毒作用。2 国内研究现状糖类的研究已有百余年的历史，近20多年来，随着膜的化学功能，免疫物质的化学研究的进展以及探寻新药物资源的不断拓展和研究的深入，发现糖类在生物体中的作用不仅是作为能量资源或结构材料，更重要的是还参与了生命现象中细胞的各种活动，具有多种多样的生物学功能。多糖一般由十个分子以上的单糖通过糖苷键连接而成的高分子多聚物。多糖按来源大致可分为植物多糖、动物多糖、海藻多糖、微生物多糖即细菌多糖和真菌多糖等。其中，具有很强生物活性的真菌多糖的研究日益受到重视，真菌多糖从真菌子实体、菌丝体、发酵液中分离，是一类可以控制细胞分裂分化、调节细胞生长和衰老的活性多糖。真菌多糖作为药物研究始于20世纪50年代，在60年代以后成为免疫促进剂受到广泛关注，其中香菇多糖(1entinan，LNT)是研究得较透彻的多糖之一。香菇多糖是从香菇( L entinus edod es )中提取的一种生物活性物质。研究表明, 它具有抑制肿瘤生长、提高机体免疫力、抗病毒和抗氧化等生物学活性 1- 6 。目前, 多糖的提取方法主要有水提醇沉法、碱液提取法、酶解法等 7- 11。传统热水提醇沉法能耗高、提取时间长; 碱液提取法反应剧烈、提取液又需进行中和, 这可能破坏多糖的结构、降低香菇多糖的分子量, 致使其药用价值下降12; 酶解法虽然反应时间短、能大幅度提高多糖提取量, 但是酶的价格较高。超声波在食品加工中的应用越来越广泛, 在液体中它可以产生空化作用, 由空化作用产生的冲击波和射流又可破坏细胞和细胞膜结构, 从而增加细胞内容物通过细胞膜的穿透力和传输能 13 。笔者采用单因子试验和多因子的正交试验探讨了不同料液比、超声时间、浸提温度和浸提时间对提取香菇多糖的影响, 为香菇多糖的开发利用奠定了基础。 香菇Lentinus edodes(Berk)Sing为担子菌纲伞形科真菌，是世界名贵食用菌兼药用菌之一。1968年日本千原吴郎首先利用热水从香菇子实体中浸提出6种胞外多糖，1970年Chihard和Sasaki用热水浸提结合有机溶剂沉淀从香菇中提取到另外4种多糖，20世纪80年代以来，LNT的研究受到广泛的重视，取得了一系列进展。国内在这方面也取得了重要的进步。2.1 原料预处理技术在超市购买的成袋的干香菇，产于四川通江县。足够的分量。2.2 粉碎技术把购买的干香菇用粉碎机粉碎，在实验室用小型的粉碎机对起进行粉碎，干香菇先手工弄成较小的碎块，便于从粉碎机入口进去。粉碎后收集好粉末，便于提取时候用。2.3 超声波技术超声波提取中药和天然药物的简易方法和机理说明：在容器中加入提取溶媒（水、乙醇或其他有机溶剂等），将中药材根据需要粉碎或切成颗粒状，放入提取溶媒中；容器的外壁粘接换能器振子或将振子密封于不锈钢盒中投入容器中；开启超声波发生器，振子向提取溶媒中发出超声波，超声波在提取溶媒中产生的空化效应和机械作用一方面可有效地破碎药材的细胞壁，使有效成分呈游离状态并溶入提取溶媒中，另一方面可加速提取溶媒的分子运动，使得提取溶媒和药材中的有效成分快速接触，相互溶合、混合。 超声波提取（也称为萃取）以其提取温度低、提取率高、提取时间短的独特优势被具有创新意识者应用于中药材和各种动、植物有效含量的提取，是替代传统剪切工艺方法实现高效、节能、环保式提取的现代高新技术手段。超声波提取的原理：超声波提取中药材的优越性，是基于超声波的特殊物理性质。主要是主要通过压电换能器产生的快速机械振动波来减少目标萃取物与样品基体之间的作用力从而实现固-液萃取分离。 （1）加速介质质点运动。高于20 KHz声波频率的超声波的连续介质（例如水）中传播时，根据惠更斯波动原理，在其传播的波阵面上将引起介质质点（包括药材重要效成分的质点）的运动，使介质质点运动获行巨大的加速度和动能。质点的加速度经计算一般可达重力加速度的二千倍以上。由于介质质点将超声波能量作用于药材中药效成分质点上而使之获得巨大的加速度和动能，迅速逸出药材基体而游离于水中。 （2）空化作用。超声波在液体介质中传播产生特殊的“空化效应”，“空化效应”不断产生无数内部压力达到上千个大气压的微气穴并不断“爆破”产生微观上的强大冲击波作用在中药材上，使其中药材成分物质被“轰击”逸出，并使得药材基体被不断剥蚀，其中不属于植物结构的药效成分不断被分离出来。加速植物有效成份的浸出提取。 （3）超声波的振动匀化（Sonication）使样品介质内各点受到的作用一致，使整个样品萃取更均匀。 综上所述，中药材中的药效物质在超声波场作用下不但作为介质质点获得自身的巨大加速度和动能，而且通过“空化效应”获得强大的外力冲击，所以能高效率并充分分离出来。超声波提取优点1.提取效率高：超声波独具的物理特性能促使植物细胞组织破壁或变形，使中药有效成分提取更充分，提取率比传统工艺显著提高达50500%； 2.提取时间短：超声波强化中药提取通常在2440分钟即可获得最佳提取率，提取时间较传统方法大大缩短2/3以上， 药材原材料处理量大； 3.提取温度低：超声提取中药材的最佳温度在4060，对遇热不稳定、易水解或氧化的药材中有效成分具有保护作用，同时大大节能能耗； 4.适应性广：超声提取中药材不受成分极性、分子量大小的限制，适用于绝大多数种类中药材和各类成分的提取； 5.提取药液杂质少，有效成分易于分离、纯化； 6.提取工艺运行成本低，综合经济效益显著； 7.操作简单易行，设备维护、保养方便。 提取率提高50%500%；提取时间（分钟）缩短2/3以上；提取温度为4060，保护有效成份。3存在的问题和发展趋势现在用超声波辅助水提取存在提取不完全，残留多。逐渐朝高效率发展，各国还在继续研究最有效的提取方法，比如酶提取法。目前提取多糖的方法很多, 每种都有其优缺点。要根据提取物性质、提取成本、工艺设备等选择高效率、低能耗的提取工艺, 并对提取工艺优化以适应规模化的工业生产需求, 这也是近年来食用菌多糖的研究热点之一; 也对促进我国食用菌产业进一步向产业化、现代化方向发展, 和提高工业经济效益等方面有着重大的意义。相信随着现代分离技术和生化技术的发展, 食用菌多糖的提取会进入新的时代, 在抗肿瘤和提高人体免疫功能等医药方面发挥更大的作用。4 论文的选题与研究内容随着香菇多糖在医学上的应用，我们对其的需求量也是越来越大，所以我们需要研究香菇多糖最大的提取率。争取实现以简单的方法提取最多的香菇多糖。研究的内容：优化影响超声波辅助水浸提法提取香菇多糖的因素, 提高多糖的提取率。二 实验部分1材料与方法1.1 材料香菇购置与学校旁边超市，产于四川通江县。1.2 仪器与设备粉碎仪器：小型粉碎机分光光度计：紫外线分光光度计锥形瓶：常用锥形瓶电磁炉：实验室常用水浴锅：实验室常用水浴锅超声波：实验清洗用超声波1.3 实验方法1.3.1 苯酚- 硫酸法测定多糖标准曲线的制作以葡萄糖为标准品, 精确配制浓度为100 ug/mL 的标准溶液, 依次量取0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL分别放入9支试管中, 蒸馏水补至1.0mL 然后加入0. 5mL苯酚( 5% )、2.5mL浓硫酸, 混匀器上混匀, 沸水浴10min, 室温放置20 min后于490 nm 处测吸光度值。以葡萄糖含量为横坐标, 以OD为纵坐标绘制标准曲线, 得到回归方程: y= 0.0134x+ 0.0037, R2=0. 9996。1.3.2香菇多糖提取方法的确定分别向3个小烧杯中加入1.0 g香菇粉, 再加入20ml蒸馏水, 然后分别用水浸提法、微波法、微波辅助水浸提法、超声波法和超声波辅助水浸提法提取香菇多糖。其中, 水浸提法是将小烧杯在100水中浴浸提2.0 h; 微波法是将材料用微波(640W) 处理3min; 微波辅助水浸提法是将材料先微波(640W) 处理3 min后再100 水浴浸提2.0 h; 超声波法是将小烧杯超声波( 150W)处理15 min; 超声波辅助水浸提法是将小烧杯超声波( 150W )处理15min后100 水浴浸提2.0 h。各提取2次, 然后分别将滤液合并, 浓缩至2ml 再加入6ml无水乙醇, 4静置过夜, 4000 r/min离心20min, 弃上清液, 加蒸馏水溶解并定容。按照葡萄糖标准曲线制作方法测OD490值,并计算多糖提取率。1.4 实验步骤 香菇粉碎称重浸提滤渣同法提取过滤合并上清液醇析蒸发浓缩4放置过夜离心干燥粗多糖Fig.1 The flow chart of extracting agaric polysaccharide图1香菇多糖提取工艺流程图1.5 单因子实验探讨不同因素对提取率影响的情况,只有一个因素作为变量，当该因素变化时，提取率随着变化的情况。1.5.1不同料液比对香菇多糖提取率的影响香菇粉和蒸馏水按料液比分别为1：15、1：20、1：25、1：30、1：35、1：40、1：45、1：50、1：55 进行配制, 超声处理15min后100 热水浸提2. 0h, 浸提2次。由图2可见, 随料液比的增大, 香菇多糖的提取率也增大, 但是当料液比大于1 :20 ( 多糖提取率为3.90% )时, 提取率增加的幅度很小。考虑到料液比过大会增加浓缩的时间, 所以初步将料液比定为1:20。图2 料液比对香菇多糖提取率的影响1.5.2 不同超声时间对香菇多糖提取率的影响香菇粉和蒸馏水按料液比为1：20进行配制, 超声波处理15 min, 然后分别于70、80、90、100 浸提2. 0 h, 浸提2次。由图3可知, 随着浸提温度的增加, 香菇多糖的提取率也在增加, 当浸提温度为100 时多糖提取率最高( 3. 94% )。图3超声时间对香菇多糖提取率的影响1.5.3 不同浸提温度对香菇多糖提取率的影响香菇粉和蒸馏水按料液比为1:20进行配制, 超声波处理15 min, 然后分别于70、80、90、100 浸提2. 0 h, 浸提2次。由图4可知, 随着浸提温度的增加, 香菇多糖的提取率也在增加, 当浸提温度为100 时多糖提取率最高( 3.94% )。图3图4 浸提温度对香菇多糖提取率的影响1.5.4不同浸提时间对香菇多糖提取率的影响香菇粉和蒸馏水按料液比为1：20进行配制, 超声波处理15 min, 然后100 热水浴分别浸提1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h, 浸提2 次。由图5可知, 随浸提时间的延长, 香菇多糖提取率先升后降,当浸提时间为2. 0 h时多糖提取率最高( 3. 95% )。图5 浸提时间对香菇多糖提取率的影响1.5.6最后确定每个因素的最佳水 平条件的因素水平见表1。表1 正交试验因素水平Table 1 Levels and factors of L ( 34 ) orthogonal test水平LevelA料液比Material liquidratio B超声时间minDisposing timeOf ultrasonicC浸提温度minExtracting temperatureD浸提时间hExtracting time11:1510801.521:2015902.031:25201002.52 结果与分析按1.5.6进行操作，利用吸光度-葡萄糖浓度的标准曲线计算多糖得率，其正交试验结果见表2。表2 香菇多糖提取的正交实验结果试验号A料液比 B超声时间C浸提温度D浸提时间香菇多糖提取率111112.85212222.95313333.02421233.15522312.87623123.03731323.98832133.33933213.01K18.829.989.218.73K29.059.159.119.96K310.329.069.879.5R1.50.920.761.59料液比的大小、浸提时间的长短和浸提温度的高低都影响多糖的提取率, 超声波处理时间过长又会导致多糖降解、活性降低, 因此选择以上4个因素设计L9 ( 34)正交试验, 结果见表2。由极差分析可知RDRARBRC 从而可以得出影响香菇多糖提取量因素的顺序为: D A B C,即浸提时间 料液比 超声处理时间浸提温度, 最优水平为A3B1D2C3,即超声波辅助水浸提法提取香菇多糖的最佳提取条件为: 料液比1：25、超声波处理10min、100浸提2.0 h。在该最优条件下, 香菇多糖的提取率为4.05% 。为了验证A3B1D2C3是最佳配方，与多糖最高得率A3B1C3D2比较（见图6）， 由图6可知A3B3C2D2为木耳多糖提取的最佳组合。图6 最佳组合验证3讨论通过单因子试验和多因子的正交试验, 确定了各因素影响超声波辅助水浸提法提取香菇多糖的大小排列顺序为: 浸提时间 料液比 超声处理时间浸提温度, 香菇多糖提取的最佳条件为: 料液比1：25、超声波处理10min、100 浸提2.0 h,在该条件下, 多糖的提取率为4.05%。4 结论该试验建立了香菇多糖热水浸提的最佳工艺，通过正交设计对提取温度、提取时间、液料比、超声波时间进行优化，结果表明浸提时间对多糖得率具有显著的影响，其次为料液比、超声时间和浸提温度。最优组合为料液比1：25、超声波处理10min、100 浸提2.0 h，此时香菇多糖得率为4.05%。致谢本次论文设计过程中，王兆丹老师对该论文从选题，构思到最后定稿的各个环节给予细心指引与教导,使我得以最终完成毕业论文设计。在学习中，王老师严谨的治学态度、丰富渊博的知识、敏锐的学术思维、精益求精的工作态度以及侮人不倦的师者风范是我终生学习的楷模，导师们的高深精湛的造诣与严谨求实的治学精神，将永远激励着我。这四年中还得到众多老师的关心支持和帮助。在此，谨向老师们致以衷心的感谢和崇高的敬意！ 最后，我要向百忙之中抽时间对本文进行审阅，评议和参与本人论文答辩的各位老师表示感谢。参考文献1 王谦.大型食用真菌的多糖类物质J.广西轻工业,1995(4):16-19.2 王玢,任清,李奇,等.香菇多糖的提取及其抗氧化性和保湿性评价J.食用菌,2008(5): 58-60.3 李小定,荣建华,吴谋成.真菌多糖生物活性研究进展J.食用菌学报,2002,9(4):50- 58.4 唐省三,朱晓琴.复合真菌多糖的抗肿瘤及免疫增强作用初探J.基础医学与临床,2004, 24(5):599-600.5 QUZY,NIUMJ,GUOC L.Mechanism of antitumor action of LentinanJ.China Domestic Fungus,1997,16(5):3-4.6 MACQ,XIAR,PENGY, etal Studies of extract ion method of Lentinan and aminoacidsJ. MedicalHerald,2003,22(6):372-374.7 袁静,王平全.香菇多糖的抗肿瘤作用J.上海医药学,1999,10(1):29-32.8 汪财生,孙安吉,王忠华,等.紫山药多糖酶法提取工艺优化研究J.食品工业科技,2010,31(2):266-268.9刘宁,李健.香菇多糖的提取工艺比较J.食品科学,2007,28(9):199-202.10 白玉静,佟丽华.香菇多糖提取工艺和含量测定方法研究J.黑龙江医药科学,2006, 29(1):55-56.11黄伟光.香菇多糖提取技术的研究J.龙岩师专学报,1999,17(3):66-69.12 刘栋,钱建亚.香菇多糖抗肿瘤作用研究现状J.食用菌,2003 9(2):43-45.13 孙庆磊,梁月荣,陆建良.超声波在茶叶提取中的应用J.茶叶,2006,32(2):79-82.英文译文Studies on the extraction technology of LentinanXian Xiaohong Department of Biology, Chongqing Three Gorges College of Biotechnology 2008 Wanzhou, Chongqing 404100Abstract: Objective The research aimed to optimize