第十章 转基因植物的检测与鉴定ppt课件

第九章 转基因植物的检查与鉴定,第九章 转基因植物的检查与鉴定,第一节 报告基因的表达检测 第二节 外源基因整合的Southern杂交鉴定 第三节 外源基因转录的Northern杂交检测 第四节 外源基因表达蛋白的检测,报告基因的两大特点： 表达产物及产物的类似功能在未转化的植物细胞内并不存在； 便于检查 目前常使用的报告基因GFP，GUS，BAR，NPTII等,第一节 报告基因的表达检测,1、gfp（绿色荧光蛋白）基因,简介：绿色荧光蛋白是一些腔肠动物所特有的生物荧光素蛋白。生物荧光素蛋白是指存在于生物体的、能在激发光作用下发射出荧光的蛋白质。它是一种能接受荧光辐射能并最终发射荧光的物质。 从水母中分离纯化的Gfp是由238个氨基酸残基组成的单体蛋白，分子量26888Da，它在蓝光激发下能发出绿光。,Gfp作报告基因的优点： 适用于各种生物的基因转化； 检查方法简便，无需底物、梅、辅因子等物质； 便于活体检测； 检测是可获得直观信息。,一、Southern杂交步骤,（一）植物总DNA提取 （二）杂交探针的制备 探针：是经过特殊化合物标记的特定的核苷酸序列。 分为DNA探针和RNA探针，DNA探针又分为单链DNA探针和双链DNA探针。 杂交探针制备包括：探针核苷酸序列的获取及标记两部分。,鉴定转基因植株时应使用同源探针，常以转化的目的基因作探针。 目的基因探针一般从载体质粒上切取。包括质粒DNA的分离纯化；限制性内切梅切割；电泳分离酶切片段；从凝胶中回收目的片段。,1、探针核苷酸序列的获取,2、探针标记,（1）理想的标记物条件： 标记前后探针的基本结构相同，标记物不影响探针的杂交特异性； 检测灵敏度高、特异性强、本底低、重复性好且操作简便、省时； 稳定、安全、无环境污染； 经济。,标记物分为：放射性和非放射性两类 放射性标记物主要有32P、35S、125I、14C等； 非放射性标记物主要有生物素、地高辛、荧光素、辣根过氧化物酶等.,（2）放射性标记物 制备核酸探针时使用的放射性标记物多为三磷酸核苷酸（NTP）或脱氧三磷酸核苷酸（dNTP），以这些标记的核苷酸作底物，通过酶促聚合反应，使标记物掺入到多核苷酸链中，从而获得合适探针。 特点：放射自显影灵敏度高，压片时间短； 分辨力较低； 探针不能长期保存,（3）非放射性标记物 特点：敏感性较差； 稳定性好、分辨力高，检测所需时间短。对人和环境无害。 生物素:是一种水溶性B族维生素，其分子中的戊酸羧基经化学修饰可含有各种活性基团，它能与蛋白质、核酸等多种物质发生偶联，从而使这些物质被生物素标记。,生物素标记的探针可通过生物素-抗生物素蛋白的亲和系统检出，也可通过生物素-抗生物素抗体的免疫系统检出。 抗生物素蛋白可与酶、荧光素等物质结合，是抗生物素蛋白被这些物质标记，杂交时，生物素标记探针与被检的单链DNA中同源序列杂交，检出时，加入被酶等标记物标记的抗生物素蛋白，生物素与被标记的抗生物素蛋白特异结合，形成杂交DNA-生物素-抗生物素-酶等标记物的杂交检出体系，根据抗生物素蛋白上的标记物性质进行检出。,图28-3地高辛标记探针杂交体检出原理示意图,3、标记方法,放射性标记有体内标记法及体外标记法。体外标记法包括化学法、酶法和PCR法 酶法：是先将标记物标记在核苷酸上，然后通过酶促聚合反应使带标记的核苷酸掺入到核酸序列中，产生合适探针。 包括切口平移法及随机引物法。,PCR法：是利用Taq酶可将修饰的核苷酸掺入到PCR产物中（如32P-dNTP、地高辛-dUTP荧光素标记的dNTP）所得PCR产物可用作探针。 化学法：是通过标记物的活性基团与核酸分子中的某种基团发生化学反应而继续标记，标记物直接与核酸分子相连。,28-4切口平移法,28-5随机引物法,三、Southern印迹杂交,程 序 1、植物总DNA的限制酶切 2、凝胶电泳分离酶切片段 3、凝胶中的DNA变性 4、印迹：毛细转移法和电转移法 5、杂交 6、杂交信号的检出,5、杂交,1）杂交体系： 探针浓度：控制在0.5ng/ml或更低 杂交反应温度：低于Tm值15-25 杂交时间：,2）预杂交及洗膜,杂交的特异性是影响杂交效果的重要因素，非特异性杂交的去除主要是通过杂交前的预杂交和杂交后的洗膜完成。 预杂交：是在加入探针前用封闭剂封闭膜上的非特异性位点。 常用封闭剂包括变性的非特异性DNA，如鲑鱼精子DNA，小牛胸腺DNA等；另一类是高分子化合物，如Denhardts 操作：将印迹后的固相膜放在含封闭剂的预杂交液中，37-42 温育3-12h,洗膜：是杂交后将固相膜依次置于不浓度的溶液中漂洗，以除去游离的及非特异性位点上结合的探针。 洗膜液的温度、离子强度及洗膜时间是影响洗膜效果的三要素。,6、杂交信号的检出,放射性标记的探针通过放射自显影检出； 包括：感光材料曝光、显影、定影、水洗等过程。 非放射性标记的探针主要通过酶反应法检出 包括：偶联反应和酶的显色反应两阶段。,二、外源基因整合的PCR-Southern检测,该方法是先对被检测材料进行外源基因的PCR扩增，然后再用目的基因的同源探针与扩增的特异性条带进行杂交。 注意：设置三个对照 空白对照：无任何DNA模板； 阳性对照：以外源基因的重组质粒DNA为模板； 阴性对照：以非转化植株基因组DNA为模板。,第三节 外源基因转录的Northern杂交检测,植物细胞总RNA的提取 探针的制备 印迹及杂交,外源基因表达的RT-PCR检测,第四节 外源基因表达蛋白的检测,外源基因表达蛋白检测主要利用免疫学原理，主要方法是Western杂交和ELISA 一、ELISA检测 酶联免疫吸附法（ELISA）是一种利用免疫学原理检查抗原、抗体的技术。 检测程序包括：抗体制备、抗体或抗原的包被和免疫反应及检出。,1、抗体的制备,抗体：是机体应抗原刺激产生的一组特殊的球蛋白，Ig表示。 ELISA检测中涉及的抗体有两种，未标记的抗体和酶标记的抗体，酶标记的抗体有包括两种：一是针对特异抗原的酶标一抗，一是针对一抗的酶标二抗。,2、包被 包被是将抗原或抗体固定在固相载体表面。常用的固相载体是多孔的聚苯乙