课件：干细胞治疗小儿脑瘫的研究进展.pptx

干细胞治疗小儿脑瘫的研究进展,干细胞针对小儿脑瘫的治疗研究 体外诱导向神经元样细胞分化,脑性瘫痪,脑性瘫痪（ Cerebral palsy ）：是一个泛指人类发展过程中，未成熟的大脑因各种因素（如：母体感染德国麻疹、胎儿被卡在产道过久导致脑部缺氧、产后脑外伤或脑炎）所造成的身心障碍的统称；定义上来说，脑性瘫痪本身必须是非进行性（不会继续恶化）的脑病变，但是患者的身体功能却可继续恶化（如喂食困难导致的营养不良）。脑性瘫痪主要是指脑部（包括大脑或小脑）的动作控制区域在怀孕时、出生后、或生产时受到伤害，患者会因此产生运动功能障碍。由于伤害的位置不同，许多脑性瘫痪的患者会有感官发展及平衡力不佳、智力、认知能力、语言能力及学习能力缺损。此外患者亦可能有癫痫、视力障碍、听力障碍等其他障碍。目前对于脑性瘫痪并没有直接治疗的方法，但早期疗育可以使患者能降低其障碍的严重程度。随着早产儿存活率的升高， 脑瘫的发病率也上升至人口总数的0.06% 0.59%。我国此类患儿不少于 250 万，且每年新增患儿约 20 万左右。,干细胞针对小儿脑瘫的治疗研究,脑瘫的病理改变及发病机制 脑瘫传统治疗方法及缺陷 脐带血干细胞移植治疗脑瘫 干细胞移植后功能重建,1.脑瘫的病理改变及发病机制,成因 病理改变 发病机制,成因,生产前 怀孕期受感染，例如德国麻疹 遗传 接触畸胎原，例如：毒品，放射性物质，酒类，吸烟 早产 生产过程 缺氧 脑部出血 生产后 感染，例如脑膜炎 脑血管出现问题 意外导致脑部受伤 严重黄疸,病理改变,脑瘫病理改变主要为脑干神经核、 皮质、 灰质团块的神经细胞结构改变及白质中的神经纤维变化及髓鞘分离等， 表现为大脑皮层神经细胞变性、 坏死、 纤维化， 从而导致大脑的传导功能失常。在显微镜下可见皮层各层次的神经细胞数目减少，层次紊乱， 变性胶质细胞增生。同时， 运用计算机断层扫描（CT）、磁共振成像 （MRI ） 等现代检查手段， 可以观察到大脑皮层不同程度萎缩、 脑回变窄、 脑沟增宽、 脑室扩大等。,病理改变,痉挛型双瘫：多见于早产儿， 以脑室周围白质软化改变为主。 不随意运动型：可见脑室周围白质软化或基底核病变。 共济失调型：大部分为先天性小脑发育不全。 混合型：综合类型。,发病机制,从原因分析，其病理改变主要是脑损伤和发育障碍， 而中枢神经系统发育障碍或损伤主要累及小脑和锥体系、 锥体外系三大体系。脑瘫动物模型研究发现， 脑瘫仔兔基底神经核区、 脑干区存在单胺类神经递质紊乱， 表现为基底神经核区多巴胺 （DA） 、 5- 羟色胺 （5-H T） 、 脑干区去甲肾上腺素 （NE） 含量显著降低， 且基底神经核区5-H T 含量与 DA 含量之间呈正相关。 另外， 临床研究显示， 脑瘫患儿发病还与自由基产生增加或清除障碍有关。,锥体束,2.脑瘫传统治疗方法及缺陷,自英国矫形外科学专家 John Little 首先研究并治疗脑瘫 （CP）， 到目前为止百余年来已经形成和发展了许多治疗脑瘫的方法， 有非手术治疗、 手术治疗和中医治疗。,非手术治疗方面,国外常用的有 Vojta法其基本原理是利用对诱发带的压迫刺激， 诱导产生反射性运动， 通过这种运动反复规则的出现来促进正常反射通路形成， 抑制异常反射通路和运动从而达到治疗目的; 针对小儿脑瘫常见症状痉挛， 可以采用服用一些药物：,药物治疗 作用：减低痉挛情况 1. 口服肌肉松弛剂 - 如 Diazepam, Baclofen, Dantrolene. - 经血液循环而引起全身性的作用。 - 副作用：疲倦、渴睡、流口水。 2. 药物注射 - BOTOX 肉毒注射 肉毒杆菌A型是一种神经毒素，阻碍神经与目标肌肉之间的讯号传递，从而减低肌肉痉挛的情况。 针对痉挛情况较严重的肌肉注射，亦会视乎情况打石膏以进一步减低挛缩。 有效期：3 - 6个月 打针后，肌肉会明显乏力，需多做运动以改善动作的控制。 - Phenol 直接注射入神经线，用以瘫痪神经，从而减低肌肉痉挛的情况。 打针时和打针后，打针的部位都会非常痛楚。 有效期：3 18个月 - Baclofen 脑脊椎膜内注射 作用与口服Baclofen一样，主要减低痉挛的情况。 较针对性，所需的份量较少，副作用较少。 在香港较新，较少个案记录。 于病者腹部皮下植入一仪器，内有一储存袋，能储存药物足1至3 个月用。仪器有一导管接驳至脊椎神经。仪器能定时打指定份量的药物直接送进脊椎神经。当药物用完后，医生会把药物注射入储存袋内。,但全身性肌松剂在降低全身肌肉张力的同时已会降低患儿的肌力， 影响其正常康复训练； 而且时效性短，费用高，可重复性受患儿耐药性影响大。WrightPA 等曾采用神经肌肉电刺激方法治疗脑瘫患儿，发现该方法能增强肌肉的力量及运动范围， 但曾采用神经肌肉电刺激方法治疗脑瘫对脑瘫患儿整体恢复帮助不大。,手术治疗方面,手术治疗 作用：减低痛楚、增强活动功能、方便家人照顾 1. 骨科手术 - 筋肌手术 放筋或筋肌转驳手术 放筋手术：把收紧的筋肌放长或切断 常用于大腿前筋、大腿内侧筋、大腿后筋及小腿后筋 手术后需打石膏4-8周 副作用：如筋肌过长，会引致肌肉乏力 筋肌转驳手术：把筋肌的位置转移，以改变其功能 手术后需打石膏8-12周 举例：将部分小腿后筋转移至脚面以帮助脚踝向上提起 - 骨骼矫正手术 例如：矫正大腿骨内旋情况 矫正小腿骨外旋或内旋情况 使脱位的关节复位 ( 如髋关节、尺骨桡骨关节 ) 手术需打石膏8-12周 * 石膏拆除后，常有关节肿痛、收紧及肌肉萎缩乏力的情况，需紧密的物理治疗训练才能改善情况。,手术治疗方面,2. 脑神经科手术 - 导管插入手术 医治脑水肿 于脑部放入导管，把脑脊髓液引流至腹腔 多数用于幼儿期进行 - 选择性脊椎神经后根切除手术 脑外科手术 作用：减低痉挛情况，以增强功能,手术治疗方面,但选择性脊神经后根切断术方法的定位定量存在问题， 其降低张力的效果会随外周神经的修复而降低。,中医治疗,在我国传统的中医治疗方面， 国内有临床报道显示， 针灸可以改善脑瘫患儿的各种临床症状， 但针灸治疗中也存在着诸多问题， 如缺少关于中医病因病理的理论和实验研究， 可重复性差， 观察周期较短， 且针灸治疗选穴过于复杂， 穴位配伍混乱。这些现象阻碍了使用针灸深入治疗脑瘫的研究。,针灸治疗,3.脐血干细胞移植治疗脑瘫,脐血干细胞是具有与骨髓干细胞相同的多向分化潜能的原始祖细胞。脐血中含有丰富的造血干细胞和间充质干细胞， 脐血干细胞具备自我更新和增殖的能力， 并能在特定因素的影响或诱导下， 向各种细胞或组织分化。 怎样将干细胞准确、 安全移植到宿主体内， 并最终迁移、聚集到脑内功能缺失部位、 正确分化为神经元是干细胞治疗中的一项重要问题。,干细胞移植途径,神经干细胞具有能够向病变神经系统部位趋行、 聚集的生物学特性， 目前动物实验及临床应用中所使用的移植途径主要包括局部注射移植、 经脑脊液注射移植、 经血液循环注射移植。,移植途径,4.干细胞移植后功能重建,动物研究：有研究表明，在一个大鼠一侧大脑中动脉短暂缺血模型中，移植入 NSCs 后，移植的神经干细胞可迁移至损伤部位并逐渐分化成熟。 尹国才等自孕 16 周的人胎脑组织分离培养神经干细胞球，在脑脊液中培养诱导分化证明了其分化潜能。将培养 14 d 的神经干细胞球移植于 10 d 龄大鼠侧脑室内， 观察发现神经干细胞在脑内发生迁移，并分化成形态上与其所在位置的宿主细胞一致的神经元。,向静等将脐血干细胞植入血管性痴呆大鼠海马内，采用电脑控制的穿梭箱系统对大鼠进行不同时间点行为学测试，发现实验组第 4、8 周的主动回避反应（AAR）较对照组明显好转，该实验提示脐血干细胞移植可以抑制慢性缺血对大脑的损害，提高其行为认知能力。,4.干细胞移植后功能重建,临床研究：张丽欣等通过静脉注射和腰椎穿刺方法研究了脐血干细胞治疗脑瘫的安全性，结果发现，脐血干细胞注入脑瘫患儿体内后，脑瘫患儿治疗前后红细胞、血红蛋白、血小板、总蛋白、尿素氮、 肌酐、电解质水平以及出凝血时间等无显著差异； 白细胞计数、中性粒细胞比例、总胆红素、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶等有显著差异，但均在各指标的参考值范围内；但所有指标异常率均无差异，因而表明上述指标的统计学差异在临床上无意义，说明无论静脉输注脐血干细胞还是腰穿移植脐血干细胞，对人不产生重大影响。,王金刚等总结分析了解放军 463 医院近年来 221 例脐血干细胞治疗脑瘫病例，选取其中 51 例无智力障碍、一直进行康复训练的患者，对其进行日常生活活动能力（ADL）的评估（包括个人卫生动作、进食动作、更衣动作、排便动作、器具使用、床上运动、认识交流动作、移动动作、步行动作 ），比较治疗前与治疗 1 个疗程（2128d 进行4次脐带血间充质干细胞治疗 ）后ADL得分，结果发现，治疗前后 ADL 总分、步行动作、床上运动、认识交流动作得分比较, 差异均有统计学意义，从而提示脐带血间充质干细胞对无智力障碍脑瘫患者治疗有效。,冯梅等应用脐血干细胞治疗30例重症脑瘫患者，发现干细胞治疗后脑瘫患者的脑性瘫痪综合功能评分较治疗前提高，各功能区评分值包括认知、运动、言语、 自理等均相应提高， 差异具有统计学意义。,吴景文等对97例脑瘫患儿进行脐血间充质干细胞移植，同时辅助神经营养药物和康复训练治疗，其间为 25d；随访 612 个月，平均 9. 5 月，脑瘫治疗粗大运动评价（GMFM-88）系统对细胞移植术前、 术后患儿的粗大运动功能进行比较， 结果发现，在一个干细胞移植治疗疗程结束后，患儿自身对比的仰卧、俯卧、坐位、爬与跪、站立，以及行走与跑跳等粗大运动能力均得到不同程度提高。随访发现，患儿出院 6 个月后的各项运动指标也较出院时有明显改善。,总 结,脑瘫的大脑损伤是非进行性的，这并不意味着其临床表现静止不变，随着患儿的生长，神经系统逐步发育，受损大脑对全身功能的影响会越来越明显，症状也可能会越来越重， 但如果能在神经系统未发育成熟前康复早期积极干预，使受损部位大脑的功能通过其他途径得以代偿则可以使患儿的功能得到最大程度的恢复和发展。 但随着医学的进一步发展， 神经干细胞治疗配合传统康复治疗的方法正逐渐用于临床。神经干细胞移植治疗脑损伤的机制尚未完全明确，其长期的安全性和有效性在人体也没有严格对照实验数据。大量动物实验和临床实验已证实，神经干细胞移植有利于脑损伤的功能恢复，但神经干细胞治疗的长期效果是否能够维持，且与目前存在的其他治疗方法相比是否具有优越性还有待进一步研究。,体外诱导向神经元样细胞分化,目前通常采用的方法是针对不同的终末靶细胞有目的地选择适当的分化诱导剂, 使胚胎干细胞向一定方向分化。常用的诱导方法包括:化学诱导剂诱导法、细胞因子诱导法、共培养方式诱导法和转基因诱导法等。,1.化学诱导剂诱导法 维甲酸(RA)、二甲基亚砜(DMSO)、维生素A、 地塞米松和2,5-羟基维生素D3等试剂可诱导胚胎干细胞分化为神经细胞、心肌细胞、成骨细胞和软骨细胞等多种类型细胞。最常用的特异性诱导剂是维甲酸, 它可通过经典的信号转导途径诱导胚胎干细胞的分化，还可以阻止白血病抑制因子(LIF)活化胚胎干细胞的自我更新信号通路, 从而促进胚胎干细胞分化。DMSO是影响胚胎干细胞在体外向肌肉细胞定向分化最有效的药物。利用诱导剂诱导胚胎干细胞分化时, 诱导剂的添加不仅对胚胎干细胞产生一定的毒性作用, 同时也给胚胎发育重要内源性因素的分析带来很多不便。,2. 细胞因子诱导法 细胞因子诱导法是目前研究得最为广泛和深入的干细胞诱导方法。在体外培养下, 胚胎干细胞对细胞因子具有依赖性。培养过程中添加或撤除某些细胞因子可诱导胚胎干细胞的增殖或分化。常用的细胞因子诱导法是先得到拟胚体(EBs), 再在拟胚体的基础上进一步诱导使其分化为目的细胞。但是, 利用此法获得的目的细胞纯度不高, 这是胚胎干细胞内在的多能性发育程序所决定的。,3.共培养方式诱导法 细胞生长的微环境对细胞中多种因素共同作用的结果, 同时微环境中各因素也共同决定着胚胎干细胞的分化方向。两种或两种以上细胞共培养, 会增加病原体的传播概率, 尤其是病毒的传播概率, 这是共培养体系应用于临床诱导干细胞向肝细胞分化的主要障碍。,4.转基因诱导法 转基因诱导法主要是利用基因转染技术将某些信号转导成分的基因转入胚胎干细胞中, 使某个促分化基因在胚胎干细胞中过表达, 从而有效地诱导胚胎干细胞发生特异性分化。这种方法诱导胚胎干细胞分化的效率高, 得到的分化细胞的纯度也较高, 具有应用前景。,2019/4/22,37,可编辑,神经干细胞受到取材困难，不易获得，易被污染及伦理、法律方面的问题影响，且随年龄增长其干细胞数量和增值能力也明显下降。 目前国内的干细胞治疗来源主要有：胚胎分离神经干细胞；自体骨髓血间质干细胞；脐带血间充质干细胞及脐带间充质干细胞。,脐血间充质干细胞诱导向神经元样细胞分化的实验研究,1.方法 1.1脐血间充质干细胞的分离和培养 按1：1比例将脐带血与 PBS 混匀， 缓慢加入 1.077 g/ml 的 Ficoll-Hypaque 淋巴细胞分离液上层， 2000rpm， 离心 15min， 小心吸取中间单个核细胞层， PBS 洗涤 2 次， DMEM 重悬细胞，以 1.0106/L 密度接种于胎牛血清包被的培养瓶中，培养基采用含 15%胎牛血清、5ng/ml bFGF 的 DMEM/F12 培养液， 37， 5% CO2条件下培养72h 后， 更换培养液， 以后每 34d 换液一次， 待细胞达到 8090%融合时， 0.25%胰蛋白酶消化， 以 1： 3 比例进行传代。倒置显微镜下观察培养细胞的形态变化及生长状况。,1.2 MSCs 生长曲线绘制 分别取处于对数生长期的 P0、P3、P10代MSCs，按1.0104/ 孔接种于24孔板，37，5%CO2条件下培养， P0原代细胞每3d计数一次细胞数，P3、P10 传代细胞每天计数一次，取平均值，以培养天数为横坐标，细胞计数为纵坐标，绘制MSCs细胞生长曲线。,P0代脐血间充质干细胞生长曲线,P3 P10代脐血间充质干细胞生长曲线,多次传代后， 随着破骨样细胞的去除， 纯化的 MSCs 细胞增殖速度趋于稳定， 以 P3 代细胞增殖能力最强，所有生长曲线均呈 S 型。,1.3.流式检测 MSCs 表面标志物 取 P3 代处于对数生长期的MSCs，PBS 重悬后,调整细胞浓度为 1.0106/ml，分别加入5l单克隆抗体，室温孵育30min，PBS 洗涤2次，加入FITC荧光标记羊抗鼠IgG1二抗，室温避光孵育 30min， PBS 洗涤 1次， 500l PBS 重悬后，流式细胞仪检测 MSCs 表面抗原表达。,1.4 MSCs 向成骨细胞、脂肪细胞分化 取P3代处于对数生长期的脐血 MSCs，分别向脂肪细胞、成骨细胞诱导，待细胞密度达 30-40%，成骨细胞诱导组中加入成骨诱导液（10-8M地塞米松、10mM-磷酸甘油、10g/l 抗坏血酸、高糖 DMEM ），体外培养 2 周后，采用茜素红 S 染色检测 脂肪细胞诱导组加入成脂诱导液（10-7M 地塞米松、6ng/ml 胰岛素、1%FBS、F12 ），体外培养 3 周后，采用苏丹IV染色检测。,1.5 MSCs 向神经元样细胞分化及免疫组化检测 取 P3 代处于对数生长期的 MSCs，以 2105/孔的密度接种于 24 孔培养板中，待细胞密度达 30-40%时，去掉旧的培养基， 加入诱导液（含 20%FBS 和 3mmol/L -巯基乙醇的 DMEM ），培养 24h后，换为含 20g/L DMSO 和 200mmol/L 丁化羟基苯甲醚的DMEM 培养液，继续进行预诱导。培养 12h 后， 采用免疫组织化学方法检测诱导后人脐血 MSCs 的 NSE、 NF 和 GFAP 表达：4%多聚甲醛固定细胞， PBS 洗涤 3 次， 0.1%Triton 破膜 20min，PBS 洗涤 3 次， 3% H2O2消除内源性过氧化物酶， 滴加 4%山羊血清封闭 1520min， 倾去， 滴加鼠抗人 NSE、 NF 和 GFAP 抗体， 工作液浓度分别为 1:1000、1：1000、1：500，阴性对照组加入PBS， 37孵育 23h， PBS 洗涤 3 次， 滴加生物素化二抗， 37孵育 1h， PBS 洗涤 3 次，滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液，37孵育 1015min， DAB 显色剂显色，光镜下观察计数 5 个高倍视野中阳性细胞数， 判定标准： 以细胞胞浆呈棕褐色或棕黄色为阳性。,2.结果 2.1MSCs 形态学观察 培养初期，悬浮的原代脐血 MSCs呈圆形，3d后观察到细胞开始贴壁，呈卵圆形、纺锤形或多角形，逐渐出现小突起，但无明显扩增，10d以后细胞体积增大，密度明显增加，少数 MSCs呈多角形，大部分呈长梭形，细胞突起明显，且向周围伸展，约 2-3 周后 细胞可生长达80%-90%融合，平行排列，呈漩涡样、辐射状和网状生长（图 1A、图 1B ） 。传代脐血 MSCs于接种后 6-12h 即开始贴壁， 细胞增殖迅速，呈长梭形，形态均一，约在培养后 8d 即可达到 80%-90%融合（图 1C ）。,2.2 MSCs 的免疫表型鉴定 流式检测结果表明， P3 代脐血间充质干细胞不表达或弱表达 CD34、 CD45、 CD106，其阳性细胞百分数分别为 0.47%、1.21%和 17.6%， 稳定地表达 CD29、 CD44、 CD105， 阳性细胞百分数分别为 87.5%、 63.9%、 89.4%， 表明脐带血中包含区别于造血干细胞的非定向干 / 祖细胞， 且处于未分化状态， 与骨髓源性 MSCs 表型相一致。,2.3 MSCs 向成骨细胞、脂肪细胞诱导分化 成骨诱导 1 周后，细胞形态变化不明显，茜素红染色结果阴性，2周后，染色结果呈强阳性，表现为胞浆中大量红色钙化基质沉积； 向脂肪细胞诱导 1 周后，开始出现少量圆形、椭圆形细胞，胞质中出现强折光性脂滴，随着诱导时间延长，脂滴数量逐渐增多，并可被油红O染为红色（图 2 ） 。,2.4 MSCs 向神经元样细胞诱导分化 预诱导后 12h，长梭形MSCs出现明显的形态变化，表现为胞体回缩，边缘突起伸出，随着诱导时间延长，细胞逐渐向神经元样细胞转化，至诱导后24h，大多数MSCs转变为神经元样细胞，胞体收缩成锥形，突起变长，甚至可见一级和二级分支。诱导前，人脐血 MSCs 中 NSE、NF 和 GFAP 表达均为阴性，经过诱导，MSCs均有不同程度的阳性表达，表现为胞浆呈棕褐色或棕黄色阳性细胞数随着诱导时间延长而增多，至诱导后 24h， NSE、 NF 和 GFAP 阳性细胞率分别为 54.73.2%、60.23.7%、 25.82.4% （图 3 ）,3 讨论 间充质干细胞在适当条件下，可横向跨系诱导分化为神经元样细胞，并表达神经细胞标志蛋白。本实验中，在特定的诱导体系下，MSCs培养24h可观察到典型的神经元样形态改变，并可检测出神经元特异性标志 NSE，NF和胶质细胞特异性标志 GFAP 的阳性表达，证实所获得的间充质干细胞在体外培养条件下，可被成功诱导为神经元样细胞和胶质细胞，而其是否真正具有神经元细胞功能有待于进一步研究。 可见，通过体外培养可从脐血中分离培养间充质干细胞，且脐血来源 MSCs 具有较好的扩增能力与分化潜能，并可定向诱导分化为神经元样细胞，可作为间充质干细胞另一重要来源，应用于神经系统疾病的细胞治疗或基因治疗。,Wnt信号分子诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化,Wnt信号通路是细胞增殖分化的关键调控环节。Wnt1主要促进神经干细胞的增殖，同时也有助于各类神经元的分化， Wnt3a主要促进神经干细胞的分化，Wnt5a(一种非经典的Wnt)促进神经元极性建立和轴突生长。Sommer认为Wnt信号通路在神经组织的发育过程中对神经干细胞有许多不同的作用，但Wnt信号分子对于体外培养的骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是否有促进向神经元样细胞分化作用还未见报道。 本实验采用细胞因子与Wnt信号分子不同组合的方法将体外培养的BMSCs向神经元样细胞分化，旨在寻找促进分化的Wnt信号分子。,1.1方法 大鼠BMSCs培养： 无菌条件下取SD大鼠四肢骨，D-Hanks液冲洗骨髓腔，收集细胞于淋巴细胞分离液(相对密度1.077)表面。2 000 r/min离心20 min，取云雾状单核细胞层(白膜层)，以浓度为1106L-1，接种在25 cm2的培养瓶中，用体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基， 于培养箱中培养。 4 d后换液，以后每3 d换液1次，显微镜逐日观察，细胞接近汇合后用0.25%胰蛋白酶消化， 按13传代，并标记为第1代(Passage1，P1)。以后实验取P3细胞进行。,1.2 大鼠BMSCs表型鉴定： 按常规方法消化BMSCs， 洗涤， 每个Eppendoff管1105个细胞，重悬于50 L PBS溶液中，并分别加入兔抗鼠直标CD34，CD14，CD9，CD44，CD45各10 L，阴性对照管加FITC标记的兔抗鼠IgG及PE标记的兔抗鼠各10 L，4 孵育30 min，PBS洗涤后流式细胞仪分析。,1.3大 鼠 BMSCs 神 经 分 化 诱 导 ： BMSCs 以1.0106 L-1密度，每孔2 mL接种于置以盖玻片6孔培养板。Wnt3a和Wnt5a组分别采用：诱导液1：L-DMEM，100 g/L碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，50 g/L Wnt3a；诱导液2：L-DMEM， 100 g/L bFGF，50 g/L Wnt5a。对照组不加Wnt分子单纯诱导剂培养液培养。诱导2周后终止诱导，每天记录细胞形态的变化。,1.4免疫组织化学及RT-PCR法检测诱导后的细胞： 组织化学检测(二步法)：BMSCs诱导前及后7，10 d固定细胞，进行免疫组织化学染色。细胞漂洗，体积分数为3%H2O2孵育10 min漂洗，0.01%triton PBS孵育30 min漂洗，加入正常山羊血清， 孵育30 min， 加入一抗鼠抗Nestin(1200)，NSE(1100)，GFAP(1100)，阴性对照以PBS代替一抗。4 过夜，漂洗，加入的二抗(HRP标记兔抗鼠IgG抗体)，室温60 min，PBS漂洗。DAB液显色，苏木精复染，封固。 RT-PCR法检测：提总RNA，测定抽提总RNA测定浓度和纯度并判断有无降解，反转录合成cDNA第一链，PCR扩增目的基因片段，产物经琼脂糖凝胶电泳，并以EB染色后，采用成像系统进行图像扫描和分析。,RT-PCR的引物设计：,主要观察指标： 干细胞表面抗原检测 神经分化标志物 mRNA表达。,2 结果 2.1 大鼠BMSCs的形态学观察 大鼠BMSCs原代培养24 h，部分细胞贴壁。以后贴壁细胞分裂增殖，细胞不断增加，细胞逐渐变为梭型，细胞形态比较均一。1014 d，细胞呈漩涡状集落，辐射状排列生长，接近80%90%汇合。传代的细胞24 h内完全贴壁，伸展为三角形、椭圆形，并逐渐重新变为长梭形，细胞增殖速度明显快于原代细胞，传代细胞多于接种后6 d长满瓶底。,2