实验二聚合酶链反应技术、酶切鉴定.doc

实验二 聚合酶链反应技术、酶切鉴定第一节 聚合酶链反应技术目的：1了解PCR基因扩增技术在DNA操作中的重要性及应用范围。2熟悉PCR基因扩增的基本原理。3掌握PCR基因扩增技术的具体操作过程。原理：聚合酶链反应技术（PCR技术）实际上是在模板DNA、引物和四种dNTP存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促反应。在反应中混合下列物质：模板DNA 、四种dNTP(包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP)、引物1、引物2、Taq DNA 聚合酶、缓冲液及Mg2+(MgCl2)，然后经下列过程大量扩增靶DNA，类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性退火延伸三个基本反应步骤构成。试剂：（1）TaKaRa Taq (5U/ ml)（2）10PCR缓冲液(Mg2+ Plus)（3）dNTP混合液(each 10mM)（4）DNA模板 (10ng)（5）引物引物名称引物序列(53)3 的位置(nt)复性温度()产物长度(bp)相互覆盖长度(bp)Mit -1FCTC CTC AAA GCA ATA CAC TG61158802204Mit -1RTGC TAA ATC CAC CTT CGA CC1411Mit -2FCGA TCA ACC TCA CCA CCT CT124558802Mit -2RTGG ACA ACC AGC TAT CAC CA2007操作步骤：1. 在一个无菌的0.5mL Eppendorf离心管内加入PCR混合液25 l混匀，用100l矿物油覆盖于反应混合液之上，以防止反应过程水分蒸发。PCR反应体系：反应体系各成分名称反应体系各成分浓度各成分体积（l）PCR缓冲液10 2.0dNTP200 nmol/L2.0MgCl225 umol/L1.5前向引物10 umol/L0.2反向引物10 umol/L0.2Taq 聚合酶5 U/ul0.1模板DNA50ng/ul1.0ddH2O18.0合计252将Eppendorf离心管放入PCR仪反应仓中。3设置PCR反应条件为：4PCR产物分析：采用1.2琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量、引物扩增的特异性，根据标准DNA的量粗略计算PCR产物的总量，电泳方法见实验一质粒DNA的琼脂糖电泳。注意事项：1用PCR扩增目的基因，一般多采用商品试剂盒。若自己配制试剂，配好后必需高压灭菌。2用于PCR扩增的模板DNA一定要纯，以防止反应体系被痕量非目的基因模板污染。3吸加PCR试剂时戴上新塑料手套，并在超净工作台上操作，避免操作不当建成污染。PCR常见问题及分析1假阳性PCR反应十分灵敏，极微量的模板污染就可以造成假阳性的出现，操作人员身体表面、阳性标本、实验室的一切试剂、器材及仪器或者其它与扩增产物接触的物品都是潜在的污染源，从标本的采集、运输、处理过程到PCR的操作应严格遵守操作规程。为了监控PCR实验的污染情况，应该同时设立阴性对照，重复试验，甚至对PCR产物进行测序分析，以鉴定扩增片段的正确性。2假阴性假阴性在PCR反应过程中也较容易出现，常见原因主要有一下几个方面：标本处理不当造成靶DNA的丢失、降解，或者存在抑制PCR反应的杂质；PCR反应体系中Taq DNA 聚合酶失活、Mg2+浓度过低或者没有添加；引物设计不合理、存在二级结构；PCR循环退火温度过高或者PCR仪显示温度与实际运行温度不符；PCR产物在鉴定的过程中没有加入溴化乙啶或电泳时间过长等，在PCR反应中设立阳性对照，一旦发现假阴性结果，从上述几个方面分析原因。3引物二聚体 产生引物二聚体的原因有：两条相同的引物或者不同引物分子之间存在较多的碱基配对，特别是引物3端有互补区域；PCR反应体系中引物与模板比例过高；PCR反应过程中退火温度设定过低或循环次数过多。4非特异性PCR扩增常见的造成非特异性PCR扩增的原因及相应预防措施如下：引物特异性不高或用量过多；Taq DNA聚合酶质量不好或者用量偏高；Mg2+浓度过高；退火温度过低，退火以及延伸时间过长；循环次数过多。除此之外，选择特征性强的序列来进行引物设计，使用纯度较高的引物、酶、Mg2+ 、模板DNA都是有效的方法，必要时还可以使用提高特异性的添加剂。5、PCR污染及预防措施潜在的污染源包括待检者、操作人员身体表面，实验室的一切试剂、器材及仪器或其它与扩增产物接触的任何东西都可能成为潜在的污染源。1）预防措施：分开操作区域。在专用超净工作台进行样品制备，专设工作台进行PCR操作，PCR 产物在另一工作台进行结果分析；所有工作区域应经常使用紫外线消毒。耐高压的试剂及器材应高压灭菌，但酶、引物、dNTP、加样器等不能高压灭菌，以免试剂失活或器材损坏。使用一次性Tip头、Eppendorf管等。 小量分装所有试剂。样品制备应按无菌操作原则进行，避免样品间相互污染。操作者带手套操作，且应勤换手套。用于PCR的加样器绝不能用于PCR 产物分析。使用尿嘧啶-DNA-糖基化酶控制PCR产物交叉污染。这是近年来新发展起来的避免污染的较好的方法。其原理是：在PCR反应系统中以 dUTP取代dTTP，使扩增产物中含有尿嘧啶。在以后的PCR扩增前用尿嘧啶-DNA-糖基化酶（UDG）处理，UDG切割污染DNA上的尿嘧啶，DNA断裂，TaqDNA聚合酶不可能再扩增污染的DNA 片段，而UDG对天然的核酸模板无影响。然后加热去除UDG活性，再做PCR， 即可防止PCR产物污染。每次PCR操作都应设阳性及阴性对照：阳性对照使用能出现扩增条带的最低量的标准病原体DNA，阴性对照不加模板或加其它来源的DNA，试剂加样操作取量同待测标本。2）污染源的处理稀酸或84消毒液处理法：用1 mol/L HCl或适量84消毒液处理污染源，使残存的DNA脱嘌呤降解。紫外线照射法：选用波长254300nm的紫外线照射30min即可。紫外线对500bp以上DNA片段有效，对短片段效果不大。反应液污染的处理：在PCR反应液（不含Taq DNA聚合酶和模板）中加入0.5 U DNase I或核酸内切酶（如10U的MspI），室温下3060min。加热灭活DNase I或核酸内切酶，再加入Taq DNA聚合酶和模板做PCR。第二节 酶切技术目的：掌握限制酶消化PCR产物的一般方法。原理：线粒体12S rRNA基因如无A1555G突变，则有BsmAI识别位点，PCR产物被酶切，琼脂糖凝胶电泳可见两个片段，如12S rRNA基因发生A1555G突变，则无BsmAI识别位点，PCR产物不被酶切，琼脂糖凝胶电泳仅见一个片段。限制酶BsmAI识别序列如下：5.G T C T C (N).33.C A G A G (N).5试剂：（1）10酶解缓冲液：购于供应酶的厂家。（2）限制性核酸内切酶BsmAI（10u/ul）（3）100bp DNA ladder（4）1.0 % 琼脂糖凝胶（5）TAE缓冲液操作步骤：1在Eppendorf管中依次加入 3.5 l 双蒸水 1l 10酶切缓冲液 5l DNA 0.5l BsmAI（10u/l）2将装有上述反应液的Eppendorf管于37水浴保温1小时。该反应液作为样品。3以样品、未酶切PCR产物和DNA mark样品同时进行1.0 % 琼脂糖凝胶电泳。4电泳结束后紫外灯下观察结果。注意事项：1PCR引物设计时，尽量选择基因两侧的保守区，在PCR扩增时，注意Mg2+对Taq酶活性的影响。2限制性内切酶在适宜的反应条件下会完全按照其固有的性质识别并切割特异性碱基序列，但在非理想的条件下，如反应体系pH值和反应温度等发生变化，或模板DNA含有乙醇等，均会使限制性内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，从而产生非特异性酶解DNA片段，这一现象称酶的星号活性现象。星号活性出现的频率根据酶、底物、反应条件的不同而异，在非最佳条件下进行酶切反应容易出现星号活性，尽量用较少的酶进行完全消化反应（一般酶都贮存于50%的甘油中），这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度干扰，样本DNA在酶切反应之前要纯化去除杂质避免有机溶剂（如制备DNA时引入的乙醇）的污染，并优化酶切反应体系pH值、离子等。 3PCR-RFLP若酶切不完全，会影响基因型的判断，造成误检或漏检，因此宜采用酶解4h或过夜，充分酶切。4RFLP酶解片段在电泳分离的过程中，要根据片段的大小选择不同的琼脂糖浓度，如果产生的片段大部分小于500bp以下，可选用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。常见问题及分析：底物DNA没有被切开或者切割不完全。出现这种现象可以有很多原因，首先考虑是DNA本身的原因如DNA不纯、缺少识别序列、DNA甲基化等，另外限制性内切酶部分失活，酶存在星号活性，反应条件不合适等，都会使DNA酶切失败。酶切后除了目的DNA条带外，还有其它条带。酶存在“星号”活性或其它内切酶污染使底物产生非特异切割。在进行PCR-RFLP时，设置阳性对照十分重要，以便在实验中查明失败原因。因此，在设计一个PCR-RFLP实验的时候，应该先寻找突变前后存在的自然酶切位点，当没有这样的位点存在时，可以通过设计引物引入特定的限制性内切酶酶切位点。在应用RFLP检测点突变时可能会引起假阳性，特别是在发生缺失突变时，酶切位点消失，目的片段不能够被切开，在进行临床诊断的时候要特别注意。第三节 琼脂糖凝胶电泳技术目的：掌握琼脂糖凝胶电泳基本操作原理：琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元是D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。因此该凝胶适合于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、鉴定及纯化。在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，DNA分子的电泳迁移率与其分子量的常用对数成反比；分子构型也对迁移率有影响，如共价闭环DNA直线DNA开环双链DNA。当凝胶浓度太高时，凝胶孔径变小，环状DNA（球形）不能进入胶中，相对迁移率为0，而同等大小的直线DNA（刚性棒状）可以按长轴方向前移，相对迁移率大于0。在电泳过程中，凝胶中的溴化乙锭(EB)嵌入DNA分子中，在紫外线照射下，EB-DNA复合物发出橙红色荧光。试剂：（1）琼脂糖（2）TBE（0.08mol/L TrisHCl，pH8.5，0.08mol/L硼酸，0.0024mol/L EDTA）（3）溴化乙锭（EB）操作步骤：（1）凝胶制备: 用TBE缓冲液配制1琼脂糖凝胶溶液，沸水浴或微波炉加热使