发酵工程知识点总结.doc

名词解释（每个3分） 填空题 单项选择题 计算题（2题） 简答题 （4-5题） 分析题（1-2题） 论述或问答题(1题）第一章1发酵和发酵工程的概念发酵狭义：利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动，来制备微生物菌体或其代谢产物的过程。广义：凡是培养细胞（动、植物和微生物细胞）来制得产品的过程。发酵工程研究发酵工业生产过程中，各个单元操作的工艺和设备的一门科学2、发酵工程研究的内容发酵工业用生产菌种的选育：自然选育诱变育种基因工程育种发酵条件的优化与控制生物反应器的设计发酵产物的分离、提取和精制3、发酵类型1 按发酵产品的类型划分2 按发酵工艺是否需氧划分 厌氧发酵：如酒类发酵、酒精发酵、丙酮丁醇发酵、乳酸发酵和甲烷发酵 通风发酵：如酵母菌生产、抗生素发酵、有机酸发酵、氨基酸发酵和酶制剂生产等3 按发酵工艺培养基的状态划分 固态发酵：主要应用于传统酿造业。 液态发酵：，是目前发酵工业所采用的主要工艺。4、发酵工艺培养方法发酵工艺培养方法有：固态发酵工艺和液态发酵工艺1固态发酵工艺 固态薄层发酵 固态厚层（通风）发酵2 液态发酵工艺液态表面发酵（浅盘发酵）工艺液态深层通风发酵(Submerged fermentation)液态深层通风发酵是指在无菌条件下，在液体培养基内部进行微生物培养，获得产品的过程。它包括向发酵罐中通入大量无菌空气、搅拌使空气均匀、培养基灭菌和无菌接种。液态深层通风发酵是发酵工业使用的主要工艺。5、分批发酵，分批补料发酵分批发酵(batch-process)：在生物反应器内投入限量培养基后，接入微生物菌种进行培养，完成一个生长周期，获得产品的微生物培养方法。是目前传统发酵工业所采用的主要发酵形式。在分批补料发酵：发酵的开始投入一定量的培养基，在发酵过程的适当时期，开始连续补加碳或（和）氮源或（和）其他必需基质，直至发酵液体积达到发酵罐最大操作容积后，将发酵液一次放出，这种操作方式称为补料分批发酵。这种发酵方式能保持较高的活菌体浓度，目前，基因工程菌发酵常采用此方法第二三章1、发酵工业常用的微生物的种类，主要的发酵产品。发酵工业常用的微生物有细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类。细菌：1、枯草杆菌与中性蛋白酶和-淀粉酶；2、乳酸杆菌、双歧杆菌与酸奶、微生态剂； 3、醋酸杆菌与醋酸； 4、棒状杆菌与谷氨酸 5、大肠杆菌与基因工程受体菌；6、目前正在研究和开发的重要细菌代谢产物 枯草杆菌与溶栓酶；大肠杆菌与天冬酰胺酶放线菌：是一类呈分枝状生长，主要以孢子或菌丝体繁殖的单细胞原核型丝状微生物，是抗生素的主要生产菌，目前发现的近万种抗生素中，80%来源于放线菌。如 链霉素、卡那霉素、新霉素、四环素、金霉素、土霉素、放线菌素D、红霉素、螺旋霉素、白霉素、制霉菌素等。酵母菌：啤酒酵母（面包酵母）：应用十分广泛，除用于传统的发酵行业外，还可用于提取核酸、麦角固醇、细胞色素C、凝血质和辅酶A等；同时，还可用作食用、药用和饲料用酵母。假丝酵母( 有较强合成能力，可用于农产品废弃物及食品生产废水的处理。红酵母但能同化某些糖类，产脂能力较强，可从菌体提取大量脂肪。并能合成-胡罗卜素。发酵工业上常用的霉菌有：根霉、曲霉、青霉、木霉和红曲霉等。根霉分泌淀粉酶、蛋白酶，能产生酒精、芳香脂类物质，是酿酒所必需的主要菌。毛霉能糖化淀粉并能少量乙醇，产生蛋白酶，有分解大豆蛋白能力。 多用来做豆腐乳、豆豉。有的毛霉能产生脂肪酶、果胶酶、凝乳酶。对甾族化合物有转化作用.米曲霉：具有较强的蛋白分解能力和糖化能力。用于酱油和酿酒生产黑曲霉是发酵工业应用最广的曲霉 菌，具有多种酶系，是糖化酶、蛋白酶、果胶酶、纤维素酶、植酸酶和葡萄糖氧化酶生产菌。黑曲霉能产生多种有 机酸，如柠檬酸、衣康酸、葡萄糖酸、抗坏血酸、没食子酸等栖土曲霉：栖土曲霉含有丰富的蛋白酶系，为蛋白酶生产菌。青霉能产生多种酶和有机酸。木霉主要用于纤维素酶 的生产红曲霉能分泌淀粉酶，产生红色素，产生酒精，产生降血压和降血脂的药物，。产黄头孢霉：本种霉菌产头孢霉素N和头孢霉素C，其衍生物称为先锋霉素。2、微生物的生长和繁殖的条件 1、营养物质：水、C源、N源、生长因子，矿质元素。2、pH 值：通常细菌、放线菌在中性； 酵母、霉菌在偏酸性条件下生长3、温度：通常细菌最适生长条件为370C；放线菌、酵母、霉菌在280C生长4、湿度： 5、气体：CO2 、O2等3、微生物纯培养生长曲线及在发酵工业中的应用A、迟缓期（适应期） 特点: 生长速率等于零 细胞合成新的成分适应新的培养基或别的培养条件 细胞形态变大或变长 对外界不良环境敏感 实际意义：种龄: 1对数期“种子”，迟缓期较短；2迟缓期或衰亡期“种子”,迟缓期较长接种量：1接种量大，迟缓期较短； 2接种量小，迟缓期较长； 培养基成分:1培养基成分丰富的，迟缓期较短培养基2成分与种子培养基一致,迟缓 期较短B、对数生长期影响因素：菌种：不同菌种的代时差异极大 营养物浓度：影响微生物的生长速率和总生长量 培养温度：影响微生物的生长速率 营养成分：营养越丰富，代时越短对数期的实践意义代谢、生理研究的良好材料 增殖噬菌体的最适宿主菌龄发酵生产中用作“种子”的最佳种龄 因工程菌发酵要尽量延长对数期C、稳定期特点： 细胞生长速率为零;活细胞总数维持不变，即新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，菌体总数达到最高点。细胞生理上处于衰老，代谢活力钝化，细胞成分合成缓慢，G+染色发生变化稳定期的实践意义发酵生产中以菌体为终产品的最佳收获期 导致了连续培养原理的提出和工艺技术的改某些代谢产物特别是次生代谢产物发生在此阶段，某些细菌的芽孢也发生在此阶段，故又称作代谢产物合成期；D、衰退期特点： 细胞以指数速率死亡， 有时细胞死亡速率降低是由于抗性细胞的积累；细胞变形退化，有的发生自溶，G+染色发生变化。影响衰亡期的因素及实践意义菌种的遗传特性有关: 有些细菌的培养经历所有的各个生长时期，几天以后死亡, 有些细菌培养几个月乃至几年以后仍然有一些活的细胞；营养物质和有毒物质有关：补充营养和能源以及中和环境毒性，可以减缓死亡期细胞的死亡速率，延长细菌培养物的存活时间4、初级代谢产物和次级代谢产物的定义。1初级代谢产物的定义：微生物代谢产生的，并且是微生物生长与繁殖所必需的代谢产物 初级代谢产物种类：有机酸、 氨基酸、核苷酸、蛋白质（包括酶）、多糖、核酸等2次级代谢产物的定义：微生物代谢产生的，与微生物生长与繁殖无明确关系的代谢产物； 种类包括：抗生素、激素、毒素、色素、信息素、生物碱等。5、微生物合成次级代谢产物的基本特征。A、次级代谢产物具有种属特异性 B、次级代谢产物在菌体稳定期合成 C、次级代谢产物不少是结构相似的混合物 D、次级代谢产物合成受多基因调控6、提高次级代谢产物产量的方法。A、补加前体类似物 如青霉素生产补加苯乙酸能增加青霉素G；加苯氧乙酸得到青霉素K。B、加入诱导物 如加蛋氨酸能增加头孢霉素C的产生；加巴比妥可提高利福霉素产量C、防止碳分解产物的阻遏或抑制： 如限量流加法发酵 D、防止氮分解产物的阻遏或抑制 如限量氮源 E、选育耐前体物质的突变株、耐抗生素的突变株、毒性的突变株、营养突变株第四章 菌种选育 1、微生物纯种分离方法有哪些？1、固体稀释平皿倾注法（混菌法）最常用的微生物纯种分离方法 2、涂布分离法 3、平板划线分离法 4、单细胞挑取法 5、组织分离法 6、利用选择培养基分离法 7、其他方法2、从自然界中分离和筛选微生物菌种的步骤1.定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。2.采样：有针对性地采集样品。3.增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。4.分离：利用分离技术得到纯种。5.发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。微生物菌种的分离和筛选实例从自然界中分离产?淀粉酶枯草芽胞杆菌1、确定采样地点：2、处理样品：3、增殖培养：4、选择培养基分离：5、挑选单菌落于斜面试管， 280C培养；6、摇瓶培养：280C， 23天，取出，过滤；7、测定菌株的?淀粉酶活性3、诱变育种和分子育种的定义。诱变育种的含义 应用微生物遗传和变异理论，用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群, 促进其突变率大幅度提高, 然后采用简便、快速和高效的筛选方法, 从中挑选少数符合育种目的的突变株, 以供生产实践或科学研究用分子育种的含义 分子育种（分子克隆、基因工程）是分子水平上的育种方法。根据需要，用人工的方法取得供体DNA上的基因，在体外重组于载体DNA上，再转移到受体细胞使其复制、转录和翻译，表达出供体基因原有的遗传形状。4、原生质体融合定义及主要步骤定义 用脱壁酶（细菌和放线菌用溶菌酶，酵母和霉菌用蜗牛酶和钎维素酶）去除微生物的细胞壁，制成原生质体，用聚乙二醇促进原生质体融合，从而获得异核体的这一技术叫原生质体融合。步骤标记菌株的筛选:营养缺陷型和抗药性标记原生质体的制备：脱壁酶脱壁原生质体的融合：聚乙二醇促进融合原生质体的再生：再生培养基培养再生壁融合子的选择：选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。生产性能筛选。5试述柠檬酸菌种分离和诱变育种的主要过程从土壤中分离、诱变及随机筛选柠檬酸高产菌种选育过程。一、从土壤中筛选产柠檬酸的黑曲霉菌株1、确定筛选产柠檬酸的菌种种类，采集样品： 取霉腐土层，筛选黑曲霉菌株。2、选择合适的培养和纯种分离的方法： 固体稀释平皿倾注法分离土壤中的黑曲霉，在平板培养基中添加碳酸钙，待培养长出菌落后，挑取透明圈大的菌落于斜面。3、挑选产酸的单菌落斜面菌种，进行生产性能的测定： 即确定所筛选的黑曲霉菌株产的是柠檬酸。二、菌种的诱变育种1、将黑曲霉接种于斜面活化；2、制备出发菌孢子悬液并进行活菌计数； 3、诱变剂处理：可先单一，后复合处理： 1）物理因子：紫外线诱变和射线诱变处理；2）化学因子：硫酸二乙酯、亚硝基胍处理； 3、用加碳酸钙的平板分离诱变处理后的孢子，待菌落长出后，挑取平板上透明圈较大的单菌落200个于斜面培养基，30培养长出孢子后，进行摇瓶初筛。 4、摇瓶初筛： 5、摇瓶复筛： 若产率不高，还必须进行第二轮诱变育种三、变异株稳定性试验： 转接10代，考察传代后，各代菌株柠檬酸生产率是否有较大的变化；四、菌种特性考察，菌落特征、菌丝形态及产生孢子的情况进行考察；五、中试验证菌种是否适合工业化生产； 六、大型投产试验，进行工业化生产 。6、核糖体工程育种的定义及原理7、菌种衰退的含义及菌种复壮的方法。菌种的衰退：生产菌株几乎都是人工诱变变异株，都是代谢调控失控菌株，遗传特性很不稳定，极易发生自然变异。因此，在使用和保藏过程中，生产菌株会逐渐向不利于生产方向发生变化，这种变化称为菌种的衰退 方法 A、纯种分离：选取典型性状的单菌落B、淘汰衰退个体 C、选择合适的培养条件第五、六章 培养基、灭菌1、葡萄糖（转化）值（DE）；DE值： 表示淀粉糖的葡萄糖组成，是指糖化液中的还原糖（以葡萄糖计）的含量占干物质的百分率。DE值 还原糖（葡萄糖）含量（）/干物质含量（）X 1002、淀粉水解糖的生产工艺；生产工艺有酸法、酶法、酸酶法三种酸水解120以上 盐酸或草酸 淀粉乳高温液化酸水解其中盐酸的水解淀粉能力高，但酸法水解缺乏专一性，淀粉酶液化 糖化酶糖化淀粉9095 寡糖 5560 葡萄糖具有高度的专一性，副产物少，纯度高，糖色浅，与酸法相比，可以转化较高浓度的固形物，提高效率，减少损耗，降低成本，所得母液还可以利用，而且在常温常压下进行，设备工艺都比较简单。 酸酶法投料浓度，淀粉乳淀粉含量在3440（1820Bx）为酸法的两倍，节省费用，缩短时间，DE值（糖化率）可达96%，纯度高，糖液色浅，容易结晶析出，用酸量少，仅为酸法的20%，产品质量高。（注：有先酸后酶法和先酶后酸法两种）3、发酵培养基筛选原则； 总体原则：根据微生物化学组成成分以及微生物生长和繁殖条件所需营养物质（水、C源、N源、生 长因子以及pH 值、温度、湿度、气体等）首 先确定培养基C/N比，再用正交试验确定原材料 的浓度的配比。 具体做到：1)必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。2)有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质所合成产物数量或最大产率。3)有利于提高培养基和产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。4)有利于提高产物合成速度，缩短发酵周期。5)尽量减少副产物形成，便于产物的分离纯化。6)原料价格低廉，质量稳定，取材容易。7)所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能耗。8)有利于产品的分离纯化，并尽可能减少产生“三废”的物质。4、培养基各成分的定量计算方法理论计算法设微生物生长和产物形成化学方程式为:碳源和能源 + 氮源 + 其他所需物质细胞 +产物 +CO2+H20+ 热量将该方程进行定量表达, 就可对培养基进行经济设计, 计算出得到一定量菌体所需营养物质的最小量。5、发酵过程灭菌对象：发酵过程需要灭菌的有：培养基、发酵设备和发酵过程中通入的空气除菌。培养基、发酵设备一般都采用蒸汽灭菌, 空气则采用过滤的方法除菌。 6、培养基分批（间歇）灭菌概念及过程；概念：将配制好的培养基输入发酵罐内，直接用蒸汽加热，达到灭菌要求的温度和压力后，维持一定时间，再冷却至发酵要求的温度。分为升温、保温和冷却三个阶段 1、种子的扩大培养概述及一般过程菌种的扩大培养是发酵生产的第一道工序, 该工序又称为种子制备。 将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁（茄子）瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种 培养物称为种子。 7、发酵工业常用空气除菌的方法。1、加热灭菌 ：用蒸汽、电能、空气压缩过程中产生的热量进行灭菌。2、静电除菌其原理是含有灰尘和微生物的空气通过高压直流电场, 气体产生电离, 产生的离子使灰尘和微生物等成为载电体,载电体被捕集于电极上，达到除菌的目的。吸附于电极上的颗粒、油滴、水滴等须定期清洗, 以保证除尘效率和除尘器的绝缘效果3、介质过滤除菌：用一种介质将空气中的各种微粒和极少量的游离微生物捕集起来予以除掉。介质过滤除菌是目前发酵工业中最常用空气除菌方法。第七、八章 种子培养、工艺控制1、种子的扩大培养概述及一般过程2、影响种子质量的因素1、培养基 2、培养条件 3、种龄 4 、接种量孢子质量的因素1、培养基 2、培养温度和湿度 3、培养时间和冷藏时间 4、接种量3、发酵过程的主要控制的理化参数有哪些物理：1、温度 2罐压 3、搅拌及搅拌转速 4、空气流量 5、粘度 6、浊度化学：1、pH值(酸碱度) 2、基质浓度(g或mg%) 3、溶解氧的浓度(ppm,饱和度%) 4、氧化还原电位(mV): 5、产物的浓度 6、废气中的O2和CO2浓度4、影响发酵温度变化的因素及其控制。因素 1、生物热（Q生物）：菌体生长繁殖产生的热；2、搅拌热（Q搅拌）：搅拌时，液体与液体之间、液体与设备之间摩擦产生的热；3、蒸发热（Q蒸发）：排除气体引起水分蒸发所需的热。4、发酵过程热量可用以下公式表示： Q发酵= Q生物 + Q搅拌 - Q蒸发温度的控制2、温度控制方法 夹层通入温水或冷却水来调节温度5、影响供养的因素。1、空气的流速（通风量）： 一般控制在0.51.0 v/v min范围内,即1：0.51vvm。2、罐压： 罐压的高低还与氧和CO2在培养液中的溶解度有关。一般控制在 0.050.10mp范围内。3、搅拌： 搅拌形式、搅拌转速； 4、发酵液的粘度5、发酵液的理化性质 6、泡沫：7、空气的分布： 8、发酵罐的结构：（最主要是搅拌转速和通风量）6、补料分批培养、作用及适用范围。1、补料分批培养的含义：是指在分批培养过程中，间歇或连续的补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法。2作用1、可以控制抑制性底物的浓度，使底物浓度保持在发酵最适浓度范围； 2、可以解除或减弱分解产物对代谢过程的 阻遏； 3、可以使发酵过程最佳化。3适用范围1、高菌体浓度培养即高密度培养系统； 2、存在高浓度底物抑制系统，特别是用甲醇、苯酚等作底物的系统； 3、受代谢物阻遏的系统 4、希望延长反应时间的系统7、发酵过程中泡沫对发酵的影响和消除的方法影响 1、使发酵罐装量减少； 2、大量逃液，导致产物的损失； 3、泡沫顶罐，培养基从搅拌轴封渗出，增加了染菌的机会； 4、影响通气搅拌的正常进行，造成发酵异常； 5、使微生物菌体提前自溶，又使更多泡沫产生； 6、迫使加入消泡剂，这将对发酵工艺和产物的提取带来困难。消除泡沫的方法 1）机械消泡：通过机械强烈振动或压力变化 2）消泡剂消泡：消泡剂为表面活性剂，主要有油脂类、高碳醇、脂肪酸、聚醚类、硅 酮类等8、典型机械搅拌发酵罐的主要结构第九、十章一：生物传感器的组成类型（按识别元件）及特点生物传感器一般有两个组成部分：其一是分子识别元件(感受器)，其二是信号转换器(换能器)。当待测物与分子识别元件特异性地结合后，所产生的复合物(或光、热等)通过信号转换器转变为可以输出的电信号、光信号等，从而达到分析监测的目的。 生物传感器的分子识别元件(感受器)： 由具有分子识别能力的生物活性物质构成，可以是生物体成分(酶、抗原、抗体、激素、DNA)或生物体本身(细胞、细胞器、组织)等，它们能特异地识别各种被测物质并与之发生特异性的反应；按所用分子识别元件的不同，可分为： 酶传感器、微生物传感器、组织传感器、细 胞器传感器、免疫传感器等二：发酵动力学中常用的几个术语1得率(或产率，转化率Y)：包括生长得率(Yx/s)和产物得率(Yp/s)，是指被消耗的物质和所合成产物之间的量的关系。2、生长得率：是指每消耗1g(或mo1)基质(指碳源)所产生的菌体重(g)，即Yx/s=X一S。3、 产物得率：是指每消耗1g(或mo1)基质所合成的产物g数(或mol数)。这里消耗的基质是指被微生物实际利用掉的基质数量，即投入的基数减去残留的基质量(S。一S)。 4、转化率：往往是指投入的原料与合成产物数量之比。 三：工业发酵过程研究的一般规律1、实验室研究 ：菌种的选育、培养基的组成成分和发酵最适条件的研究；2、中试规模 ：确定菌种培养和发酵的最佳工艺条件；3、工厂规模：规模化生产，取得经济效益。通常又可将它们称为小试、中试、工业性试验四：微生物发酵实验室研究的内容 1、研究菌种保藏方法； 2、研究菌株在固体培养基上培养和繁殖条件； 3、发酵工业用菌种的选育； 4、考查菌株培养和发酵培养基最适组成； 5、实验室规模的培养与发酵条件五：摇瓶发酵概念六：正交试验最佳配方的确定！1）确定因素和水平（2）选择正交设计表（3）将因素和水平填入正交表（4）按正交表数据的配方称取培养基。第十一章一：工业上应用的基因工程菌应具备的条件：一般：1）菌株最好是分泌型的； 2）发酵产品是高浓度、高转化率和高产率； 3）能利用常用的碳源，并可进行连续发酵； 4）发酵温度适当，发酵所产生热量和需氧量都较低； 5）代谢控制容易进行； 6）菌株是不致病的； 7）重组的DNA稳定，DNA不易再发生重组、突变和质粒脱落。重要：1）基因工程菌的稳定性 2）质粒不稳定对工程菌发酵的影响3）质粒不稳定产生的原因二：提高工程菌培养中质粒的稳定性方法（1）通过控制不同比生长速率可以改变质粒拷贝数（2）采用两阶段培养法, 第一阶段先使菌体生长至一定密度, 第二阶段诱导外源基因的表达。（3）采用适当的操作方式（4）其他三、基因工程菌培养发酵的特点1、培养装置：摇瓶、10200L发酵罐； 2、培养基：合成培养基，氮源主要有酵母提取物、蛋白胨、碳源主要为甘油； 3、加入诱导剂如异丙基D-硫代半乳糖苷（IPTG）等，诱导工程菌表达； 4、质粒必须稳定： 5、采用高密度发酵工艺四：实现高密度发酵应采取的措施1、选择合适培养基2、培养方式（1）分批补料（流加式培养）（2）补料时间和培养基的量3、发酵期间溶氧的控制4、其他因素五：基因工程菌的培养发酵的一般步骤以TNF-（肿瘤坏死因子）大肠杆菌工 程菌生产TNF-为例 1、菌株：TNF-工程菌，含氨卞青霉素抗性基因 2、仪器设备：恒温振荡摇床；10L发酵罐；分光光度计；高速冷冻离心机3、培养基： 1）发酵培养基（g/L）：蛋白胨 240g，酵母膏 120g，甘油 40ml ， KH2PO4 12g，K2HPO4 122. 5g。 2）补料培养基（g/L）：甘油 170，酵母膏 71，蛋白 71。 4、发酵类型： 高密度分批补料发酵5、培养发酵1）菌种活化2）三角瓶种子3）发酵罐发酵A） 培养基的配制及灭菌b) 接种及发酵c) 诱导表达d) 菌体收集e) 发酵过程中的分析菌体浓度测定： OD测定：用分光度计测定OD600 重量测定：发酵菌液经5000r/min离心30分钟，称菌体湿重，650C烘至恒定，称细胞干重。 OD值、菌体湿重、细胞干重之间的关系通常为：一个单位的OD值约为干菌0.4g/L，1g湿菌体相当于0.2g干菌体。内部资料仅供参考9JWKffwvG#tYM*Jg&6a*CZ7H$dq8KqqfHVZFedswSyXTy#&QA9wkxFyeQ!djs#XuyUP2kNXpRWXmA&UE9aQGn8GK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxY7JnD6YWRrWwcvR9CpbK!zn%Mz849GxG89AmUE9aQGn8xp$R#͑GxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxY7JnD6YWRrWwcvR9CpbK!zn%Mz849GxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxY7JnD6YWRrWwcvR9CpbK!zn%Mz849GxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z8vG#tYM*Jg&6a*CZ7H$dq8KqqfHVZFedswSyXTy#&QA9wkxFyeQ!djs#XuyUP2kNXpRWXmA&UE9aQGn8xp$R#͑GxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxY7JnD6YWRrWwcvR9CpbK!zn%Mz849GxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxY7JnD6YWRrWwcvR9CpbK!zn%Mz849GxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmUE9aQGn8xp$R#͑GxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxY7JnD6YWRrWwcvR9CpbK!zn%Mz849GxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxY7JnD6YWRrWwcvR9CpbK!zn%Mz849GxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWv*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxY7JnD6YWRrWwcvR9CpbK!zn%Mz849GxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWpazadNuGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxY7JnD6YWRrWwcvR9CpbK!zn%Mz849GxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxY7JnD6YWRrWwcvR9CpbK!zn%Mz849GxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWv*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxY7JnD6YWRrWwcvR9CpbK!zn%Mz849GxGjqv$U*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxY7JnD6YWRrWwcvR9CpbK!zn%Mz849GxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89Amv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxY7JnD6YWRrWwcvR9CpbK!zn%Mz849GxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWv*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxY7JnD6YWRrWwcvR9CpbK!zn%Mz849GxGjqv$U*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxY7JnD6YWRrWwcvR9CpbK!zn%Mz84!z89Amv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxY7JnD6YWRrWwcvR9CpbK!zn%Mz849GxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWv*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxY7JnD6YWRrWwcvR9CpbK!zn%Mz849GxGjqv$U*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxY7JnD6YWRrWwcvR9&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxY7JnD6YWRrWwcvR9CpbK!zn%Mz849GxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWv*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxY7JnD6YWRrWwcvR9CpbK!zn%Mz849GxGjqv$U*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxY7JnD6YWRrWwcvR9CpbK!zn%Mz849GxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWpazadNuGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxY7JnD6YWRrWwcvR9CpbK!zn%Mz849GxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxY7JnD6YWRrWwcvR9CpbK!zn%Mz849GxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWv*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxY7JnD6YWRrWwcvR9CpbK!zn%Mz849GxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxY7JnD6YWRrWwcvR9CpbK!zn%Mz849GxGjqvadNu#KN&MuWFA5uxY7JnD6YWRrWwcvR9CpbK!zn%Mz849GxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxY7JnD6YWRrWwcvR9CpbK!zn%Mz849GxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWv*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxY7JnD6YWRrWwcvR9CpbK!zn%Mz849GxGjqv$U*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxY7JnD6YWRrWwcvR9CpbK!zn%Mz849GxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89Amv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxY7JnD6YWRrWwcvR9CpbK!zn%Mz849GxGjqv$UE9wEwZ#QcUE%&qYpEh5pDx2zVkum&gTXRm6X4NGpP$vSTT#&ksv*3tnGK8!z89AmYWv*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&MuWFA5uxY7JnD6YWRrWwcvR9CpbK!zn%Mz849GxGjqv$U*3tnGK8!z89AmYWpazadNu#KN&Mu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