气相色谱法.ppt

贵 州 省 药 检 所 方 灿 2010-12,气 相 色 谱 法,一、气相色谱法的基本知识 二、气相色谱仪的基本结构 三、气相色谱法的定量方法 四、气相色谱仪使用中应注意的问题 五、气相色谱仪的应用和发展情况,一、气相色谱法的基本知识,气相色谱法是从色谱的基础上发展而来的一种分析方法。 色谱是一种将混合物分离成为可以定性和定量分析单个组分的分析的技术。 在气相色谱（gc）中，载气携带着样品经过固定相（在气相色谱柱中的固体载体）。样品中各组分穿过固定相的速度不同导致了各个组分的分离。大概1020%的已知化合物可以用气相色谱分析。气相色谱一般分析沸点低于400450 的化合物。,色谱法的分类,色谱法的定义 色谱法又可根据分离方法分为：纸色谱法、薄层色谱法、柱色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。 色谱法根据其分离原理可分为：吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法一与排阻色谱法等。 气相色谱法属于分配色谱法的一种。,2.气相色谱法的历史,色谱的起源:色谱法起源于20世纪初，1950年代之后飞速发展，并发展出一个独立的三级学科色谱学。 1938年马丁和辛格建立了现在常用的分配色谱。 1943年又建立了纸色谱法。 1952年马丁和詹姆斯提出用气体作为流动相进行色谱分离的想法，他们用硅藻土吸附的硅酮油作为固定相，用氮气作为流动相分离了若干种小分子量挥发性有机酸，在世界上第一次建立实用气相色谱法。 1957年日本岛津公司生产出气相色谱仪gc-1a 1965年hp公司推出了第一台带微处理器控制的 气相色谱仪5830。,常用气相色谱仪,岛津公司气相色谱仪： gc14c 、 gc17a、gc2010、gc2014 hp公司气相色谱仪： 4890c、5890、6890n、7890a,6890n,2.气相色谱法的定义,气相色谱法系采用气体为流动相(载气)流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。物质(具挥发性)或其衍生物气化后。被载气带入色谱柱进行分离。各组分先后进入检测器，用记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。,二、气相色谱仪的基本结构,所有的气相色谱仪都包括下面的单元：流量控制器，进样装置，色谱柱，柱温箱，检测和数据处理系统。 气源： 气相色谱法的流动相为气体，称为载气，主要选择氦、氮作载气，可由高压钢瓶或高纯度气体发生器提供。经过适当的减压装置，以一定的流速经过进样器和色谱柱；根据供试品的性质和检测器种类选择载气。常用载气为氮气，纯度一般要求在99.99%以上或更高达到99.999%（毛细管分析用 ）。 进样部分：进样方式 一般可采用溶液直接进样或顶空进样。直接进样可采用自动进样器自动进样和手动进样，顶空进样一般采用自动进样器进样。,溶液直接进样 采用微量注射器、微量进样阀或有分流装置的气化室进样，采用溶液直接进时，进样口温度应高于柱温3050；进样口一般不超过数微升（13l），柱径越细，进样量应越少，采用毛细管柱时一般应分流以免过载。 顶空进样 适用于固体和液体供试品中挥发性组分的分离和测定。将固态或液态的供试液制成供试液后置于密闭小瓶中，在恒温控制的加热室中加热蒸供试品中挥发性组分在非气态和气态达至平恒后，由进样器自动吸取一定体积的顶空气注人色谱柱中测定。 多用于药物中含量较少的有机溶剂残留量和药材中农药残留量的测定,进样方式,尾吹气使用意义,尾吹气从接近于色谱柱末端进入检测器，其目的是加速峰通过检测器，特别用于毛细管柱，以便经柱子获得分离的峰不会在通过检测器时再混合使分离变差,色谱柱,常用的色谱柱分为填充柱或毛细管柱 填充柱： 填充柱的材质为不锈钢或玻璃，内径为24mm,长为24m,内装吸附剂、高分子多孔小球或涂渍固定液的载体，粒径为0.250.18mm 0.180.15mm或0.150.125mm 。常用载体为经酸洗并硅烷化处理的硅藻土或高分子多孔小球，常用固定液有甲基聚硅氧烷、聚乙二醇（peg）等。,毛细管柱,毛细管柱的材质为玻璃或石英。内壁或载体经涂渍或交联固定液。内径一般为0.25、0.32、0.53mm，柱长560m。固定液膜厚0.1 5.0m，常用的固定液有甲基聚硅氧烷、不同比例组成的苯基甲聚硅氧烷、聚乙二醇（peg）等。,检测器种类,气相色谱法的检测器有： （氢）火焰离子化检测器(fid） 热导检测器（tcd） 火焰光度检测器（fpd） 电子捕获检测器(ecd） 氮磷检测器（npd） 质谱检测器（ms）等。,检测器应用范围,火焰离子化检测器：对碳氢化合物响应良好，适合检测大多数的药物。 氮磷检测器：对含氮、磷元素的化合物灵敏度高。 最初研制的火箱热离子化检测器是在fid检侧器的喷口上方加热碱源。 火焰光度检测器：对含磷，硫元素的化合物灵敏度高。,检测器应用范围,电子捕获检测器：适于含卤素的化合物 质谱检测器：能给出供试品某个成分相应的结构信息。可用于结构确证。,三、气相色谱法测定法的定量方法,定量的前提条件：必须进行系统适应性实验，满足一些基本条件才能进行实验，测定结果才能保证科学性和准确性。如：理论板数、分离度(r) 等 色谱柱的理论板数 在规定的色谱条件下，注人供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液.记录色谱图，量出供试品主成分峰或内标物质峰的保留tr和半高峰宽(wh/2) ，按 n=5.54(tr /wh/2）2 计算理论板数。,分离度(r),无论是定性鉴别还是定量分析，均要求待测峰与其他峰、内标峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度，计算公式为: r =2（tr2-tr1）/（w1+w2）: tr2为相邻两峰中后一峰的保留时间; tr1为相邻两峰中前一峰的保留时间; w1、w2为此相邻两峰的峰宽。 除另有规定外，定量分析时分离度应不小于1.5,外标法测定供试品含量,按各品种项下的规定，精密取对照品和供试品，配制成溶液，分别精取一定量，注入仪器，记录色潜图对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积(或峰高) ，按下式计算含量 x/。 由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中某杂质或主成分含量时，以自动进样器进样为好。,内标法测定供试品含量,内标法加校正因子测定供试品含量 按各品种顶下的规定，精密取对照品和内标物质。分别配成溶液。精密取各溶液，配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注人仪器。记录色谱图，测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子； 校正因子（f）= ar为对照品的峰面积或峰高； as为内标物质的峰面积或峰高； cr为对照品溶液的浓度； cs为内标物质溶液的浓度。,内标法测定供试品含量,再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品中待测成分（或其杂质）和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量: / 为供试品（或其杂质）峰面积或峰高; 为供试品（或其杂质）溶液的浓度: 为内标物质溶液的浓度。 为校正因子,内标物质的选择1,内标法是一种间接或相对的校准方法。在分析测定样品中某组分含量时，加入一种内标物质以校准和消除出于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，以提高分析结果的准确度。 理想地说，内标物应当是一个能得到纯样的己知化合物，这样它能以准确、已知的量加到样品中去，它应当和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征，最好是被分析物质的一个同系物。当然，在色谱分析条什下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。,内标物质的选择2,简单归纳为以下四点： 1.内标物的分子结构、性质与待测组分的相似或相近，且在待测组分附近出峰。 2.试样中不存在内标物，且内标物应与试样中各组分完全分离，即在色谱图上内标物单独出峰。 3.内标物应是纯物质或含量准确已知。 4.内标物与试样互溶，且不发生不可逆化学反应。,四、气相色谱仪使用中应注意的问题,关于使用气体要求 一般常用火焰离子化检测器，用氢气作为燃气，空气作为助燃气。 气体的纯度是根据分析内容和要求的灵敏度的不同而异： 内容越高的分析，所用的气体纯度越高。 填充分析通常采用99.99%氮气作为载气， 毛细管分析通常采用99.999%氮气作为载气。 也用氢气作为载气，安全原因多不采用。 用氦气作为载气，灵敏度高，基线噪声非常小，成本过高。 须特别注意的事项： 定期检查去除来自空气压缩机的空气中水分的硅胶和去除有机物的分子筛等，由于用一段时间后去除力减弱，须定期检查进行再生。 极性强的毛细管柱耐氧性差，容易因氧化等而变坏，因此，应尽量装配氧气捕集器除氧。氧气捕集器须定期用氢还原进行再生。 来自空气压缩机的空气不是经常流量一定，流量变动会影响基线，因此，在流路途中增加硅胶管和用于控制流量的波纹管阀，使流量稳定。,柱的良好用法,1.柱的使用温度要尽量比柱的耐热温度低(最高使用温度)。 (可延长柱的使用寿命，减低检测器的噪声级) 2.除去载气中的氧(特别是使用极性柱时) 使用高纯度气体(99.99%以上) 气瓶更换时特别注意不要混入空气 氧气捕集器装入gc的前面。 3.不要使难于挥发的成分进入柱内 充分做好试样的前处理 使用柱衬管和石英棉 安短的一次性使用的前置柱,填充柱的老化(维护方法),为了缩短稳定的时间，改善分离能力和进行高灵敏度分析，必须要对柱进行老化。 有时柱中带有一些挥发性杂质或溶剂，如果不老化就使用会引起很大程度的基线漂移和保留时间的变化。在开始分析前，对柱进行老化直到没有基线漂移. 特别地，新柱会带有很多杂质或溶剂.为了防止检测器被污染，在正常老化柱之前进行，不要在柱出口连接检测器，进行两个小时的预老化. 如果是玻璃柱，将较长的柱末端插入进样口。尽可能深地插入以接触柱箱顶部。因此，在此情况卜，载气不流过检测器，关闭检测器，用密封塞盖上柱连接检测器的安装口。 对于通常的填充柱老化，使用下述步骤。 (1)载气设置 应用分析流速，通常，不必改变分析时的值。 (30到60 ml/min) (2)柱箱温度设置 指定比柱分析时的操作温度(或者最大柱温限制)大约高30 的温度值.,填充柱的老化(维护方法),如果载气中含有氧气，当升高柱箱温度时会损坏柱。在载气通过柱30到60分钟之后，柱中的空气完全被替代以后升高柱箱温度。如果有必要，可使用特殊的除氧装置（氧气捕集器）除去载气中的氧气。 (3)进样口和检测器温度设置 对于进样口，不必改变分析时的设置值。当已经在柱入口上连接了检测器时，指定检测器温度大约高于柱箱温度30 。 (4)老化时间通常，老化2到24个小时。,毛细管柱老化(维护方法),使用下述步骤对毛细管柱进行老化。 (1)载气设置 应用分析时流速。但是，可以通过降低分流比节省载气。 (2)柱箱温度设置 指定高于分析时的柱操作温度大约30 。此情况下，不要确定高于柱温度限制的最大温度。而且，不要过快地升高温度.(尤其是在使用极性柱时) (3)进样口和检测器温度设置 对于进样口，不必改变分析时的温度设置。 对于检测器温度，指定高于柱箱温度大约30 。 (4)老化时间 通常，老化2到3个小时. 如果柱污染太严重，执行较长时间的老化。 根据柱的类型，一些柱容易损坏，在确定柱的操作温度限制后指定老化温度。老化温度太高会损坏柱，而且，如果载气中氧气浓度较高，会非常严重的损坏毛细管柱。强烈建议使用特殊的除氧装置（氧气捕集器）除掉载气中氧气。,毛细管柱的维护(维护方法),除去柱内残留的难于挥发的成分方法 1.柱的老化： 柱温度上升到柱的最高使用温度，使高沸点成分气化驱除。(进行1一2小时，柱的检测器一侧连接不变的状况下监视基线。)(注意：请事先设定检测器温度，一定要比柱温度高） 2.除去受污染的柱入口部分 因难于挥发的成分碳化，用上述方法不能除去时，在注入口侧切掉3050mm (使用可将柱切口切成直角的专用毛细管切割刀具) 3.用溶剂清洗 不建议非专业人员采用此法，可能损坏柱子 在柱内流动少量有机溶剂，溶解高沸点成分后去除。(溶剂的流动方向，由柱检测器侧向注入口侧。数ml的己烷、氯仿、丙酮等)(注意：毛细管柱的化学结合率通常不到90%。因洗掉了未化学结合的液相部分，保留时间或分离状态有可能发生变化。),玻璃衬管的维护与检修,在下列情况下，进行玻璃衬管的检修和维护。 在一系列分析开始前 保留时间、面积的重现性变差时 检测出鬼峰时 检修点 玻璃衬管的形状(形状异常时，无法进行正确的分析。) 玻璃衬管的破损 (破损是产生重现性差的原因。) 玻璃衬管内的石英棉 (石英棉填装不当是产生重现性差的原因。) 玻璃衬管的内壁污染，或有进样垫碎渣 (这些污染是产生重现性差、或产生鬼峰的原因。),进样垫的检修和维护,在下列情况下，进行进样垫的检修和维护 注入次数大致达100次时，进行定期更换 保留时间、面积的重现性变差时 检测出鬼峰时 检修点 漏气(载气泄漏是产生重现性差的原因。) 进样垫污染(进样垫污染是产生鬼峰的原因。),fid的维护,在使用火焰离子化检测器时、检测器温度一般高于柱温（3050 ），并不得低于150，以免水汽凝结，通常为250350 。 fid因附着高沸点成分或污垢，检测器污染时，如需要清扫，但如只是轻度污染时可用下列方法恢复。 fid点火。 氢流量增到通常时的3倍。(通常压力为50kpa时设定为150kpao) ，同样，空气流量也增至通常时的3倍。设置30分1小时后，回复到通常的设定。 这种方法简单可行，1次试用这种方法后，如果fid未回复正常时，建议进行清扫。 另外，请尽量不要自己更换喷嘴等做清扫以外的事。必要时，请与管理人员或维修人员联系进行。 发现fid的基线异常时，大多数是流路上的问题。请检查一下漏气或流量控制器和压缩机等。,氢焰离子化检测器(fid)的检修,喷嘴需要定期清洗或更换 建议管理人员或专业维修人员进行 虽然根据使用条件不同而异，但是，经长时间使用时，由于由填充柱流失产生的白色二氧化硅和黑色含碳炭黑以及试样或液相蒸气燃烧的生成物对电极部(输入线)或喷嘴的污染，因绝缘电阻下降而产生噪声和尖峰信号或基线不稳定。发生这种情况时，清洗检测器可恢复到良好状态。但是由于fid是非常高敏度的检测器，如果清洗的方法不当或受清洗用溶剂污染，反而会因清洗使检测器状态变坏，务必注意。 fid喷嘴部的检修 fid喷嘴部在石英制的喷嘴尖端部装有带内径为0.3中孔的金属喷嘴帽。这个内径为0. 3中的孔如被液相蒸气等堵塞，或因石英喷嘴冲击等造成损坏时无法点火，即使点火，注入试样时也会马上熄灭，因此要经常确认石英喷嘴是否损坏，喷嘴帽的孔是否堵塞。,喷嘴帽的孔堵塞时，如下图，用比0.3中细的金属丝进行清理。另外，在池座下部落入杂物或尘埃、保温材料的碎片等时，fid的基线上出现针刺状的噪声，因此池座下部应经常保持清洁。,fid喷嘴部的检修,注射器的使用和维护,注射器使用方法 在gc上最常使用进样容量约为10l的微量注射器。用这种注射器注入容量为0.53l液体试样，初学者最好用握住针的根部附近，注入时不要让柱塞脱出，边推边将针插入进样垫。通常试样打完后敏捷地拔出注射器。尽快地掌握住自己的打法。这样可以使每次注入重复一致，即能够有良好的精密度和重复性。 注射器中气泡的排除 注射器用于手动进样时，在吸入液体试样后常常在柱塞处附着少量气泡较难排除，如果采用外标法测定含量会造成精密度不好，增加工作量。 需采用下面方法排出气泡：用两个手指轻捏针头处针口，注射器针口向上，轻推柱塞使气泡移动至注射器上部，放开捏针头手指，轻推柱塞使气泡从针口排除，推柱塞至所需体积后进样。,注射器内未进试样时，尽量避免推动柱塞。有时会损伤注射器的内壁。另外，在采样时应事先用溶剂等清洗注射器。须特别注意不要使试样污染。通常的分析时注射器要清洗35次，在分析的最后，注射器一定要用适当的溶剂清洗。对此疏忽，试样中的污垢等会残留在注射器内，使柱塞不能动，会导致注射器不能使用。 若柱塞的活动不畅时，请采取如下措施:用溶剂(准备性质不同的数种)清洗注射器内部。若不能从针头吸入试样时，拔出柱塞，用另一个注射器从针头的另一侧送入溶剂。用柔软的干净布擦注射器除掉污垢。用专用的注射器清洗剂。,注射器的维护,五、气相色谱仪的应用和发展情况,气相色谱仪的应用 气相色谱覆盖了药品检测、环境分析、食品安全、法医、国土安全和石油化工领域等。在全球对气相色谱的需求趋于平稳的同时，而由于中国的工业化进程的快速发展和一些关注环境和食品、药品安全的地区的要求，对于气相色谱的需求越来越大。 药品检测：药品检测主要涉及药品含量测定（如：冰片、薄荷脑、龙脑、斑蟊素等及含有相关具挥发性成分的药品）、药品中有机溶剂残留量（原料药中合成或精制过程使用的特别是三类以上对人体危害较大的有机溶剂）、特殊剂型和项目（如：酊剂、酒剂中乙醇量、甲醇量）的测定、药材中农药残留量的测定控制等方面。,气相色谱仪的应用,医疗器械和药包材：主要涉及医疗器械中消毒剂（环氧乙烷）和药包材生产原料中有毒残留溶剂（乙醛等）的检测。 食品安全：食品安全分析包括食品中添加剂，药物残留，污染物和毒素的检测。 法医分析：多采用气质联用仪，覆盖刑侦物证分析，药物筛查和毒物研究的实验室分析。 国土安全: 在各政府部门，军队，法律部门用于在检测、鉴定、确定、消除生物和化学武器以及有毒化学品。 石油化工: 传统上，气相色谱最大的市场是石油化工行业。分析石油及各类石油产品的成分和质量控制等各个方面。,气相色谱仪的发展情况,从气相色谱仪的发展过程，可以看到一段从机械仪器到电子仪器的发展历程。早期的气相色谱仪由于电子技术水平及材料科学的限制，也限制了设计师的思路与发挥，使得当时的色谱技术也受到了很大的局限，如程序升温、程序升压等现在轻而易举的技术手段在当时是非常麻烦和不实用的。 随着电子技术和材料科学的发展，不仅强化了气相色谱仪的功能，而且也极大地丰富了应用气相色谱仪技术的方法和手段，同时更给设计师的设计思想带来了深刻的影响和促进，从而更快地推动气相色谱仪的进步。,气相色谱仪的发展情况,仪器方面的最新进展 自动化程度进一步提高，特别是epc（电子程序压力流量控制系统）技术已作为基本配置在许多厂家的气相色谱仪上安装（如agilent6890，shimadzugc-2014、gc-2010，varian3800，peautoxl，cemega8000等），从而为色谱条件的再现、优化和自动化提供了更可靠更完善的支持。 与应用结合更紧密的专用色谱仪，如天然气分析仪等。 色谱仪器上的许多功能进一步得到开发和改进，如大体积进样技术，液体样品的进样量可达500微升；检测器也不断改进，灵敏度进一步提高；与功能日益强大的工作站相配合，色谱采样速率显著提高，最高已达到200赫兹，这为快速色谱分析提供了保证。 色谱工作站功能不断增大，通讯方式紧跟时代步伐，已实现网络化，从技术上讲，现在实现气相色谱仪的远程操作（样品已置于自动进样器中）是没有问题的。,气相色谱仪的发展情况,色谱柱发展 新的高选择性固定液不断得到应用，如手性固定液等。 细内径毛细管色谱柱应用越来越广泛，主要是快速分析，大大提高分析速度。 宽口径毛细管色谱柱的出现使毛细管色谱柱载量增大，即接近填充柱应用又有较好的分离效果，逐步得到广泛运用。 耐高温毛细管色谱柱扩展了气相色谱的应用范围，管材使用合金或镀铝石英毛细管，得到较好的峰形。,gcgc色谱（全二维气相色谱）,gcgc技术是近两年出现并飞速发展的气相色谱新技术，样品在第一根色谱柱上按沸点进行分离，通过一个调制聚焦器，每一时间段的色谱流出物经聚焦后进入第二根细内径快速色谱柱上按极性进行二次分离，得到的色谱图经处理后三维图。据报道，使用这一技术分析航空煤油检出了上万个组分。,气-质联用仪主要用于药品的质量保证和质量控制,气相色谱法具有分离效率高、定量分析简便的特点，但定性能力较差；质谱法则具有灵敏度高、定性能力强等热点，但进样要纯，才能发挥其特长，进行定量分析